Summary
Clostridium несговорчивый является патогенным бактерия, которая является строгим анаэробных и вызывает антибиотик диарею, ассоциированную (AAD). Здесь, способы выделения, культивирования и поддержания C. несговорчивый вегетативные клетки и споры описаны. Эти методы требуют анаэробной камере, которая требует регулярного технического обслуживания, чтобы обеспечить надлежащие условия для оптимального C. несговорчивый выращивание.
Abstract
Clostridium несговорчивый является грамположительных, анаэробные, спорогенной бактерия, которая несет основную ответственность за антибиотиками ассоциированной диареи (AAD) и является существенным внутрибольничной патоген. С. несговорчивый, как известно, трудно выделить и культивировать и чрезвычайно чувствительна к даже при низких уровнях кислорода в окружающей среде. Здесь, способы выделения C. несговорчивый от фекальных образцов и последующего культивирования С. несговорчивый для приготовления глицерина запасов для долговременного хранения представлены. Методы подготовки и перечисления спор запасы в лаборатории для различных последующих применений, включая микроскопии и исследования на животных также описаны. Эти методы требуют анаэробной камере, которая поддерживает последовательную анаэробные условия для обеспечения надлежащих условий для оптимального C. несговорчивый рост. Мы предоставляем протоколы для передачи материалов в и из камеры без окиспользуя значительное загрязнение кислорода наряду с предложениями для регулярного технического обслуживания, необходимом для обеспечения соответствующего анаэробные условия для эффективного и последовательного C. несговорчивый выращивание.
Introduction
Clostridium несговорчивый является грамположительных, спорообразующие бактерии, которые является облигатным анаэробных и потенциально смертельной желудочно-кишечного патогена человека и животных. Первоначально описано в 1935 году как комменсальной организма, найденного в образцах фекалий от новорожденных 1, С. несговорчивый впоследствии доказано, что возбудителем псевдомембранозного колита, связанные с лечением антибиотиками 2. C. несговорчивый инфекции (CDI), как правило, предшествует лечения антибиотиками, что приводит к нарушению нормальных толстой флоры, создавая нишу для C. несговорчивый процветать 2. С. несговорчивый передается как дремлющем споры через фекально-оральным путем, а затем прорастает в желудочно-кишечном тракте, производя вегетативные клетки способны генерировать несколько токсины и вызывает тяжелое заболевание и колит 3. CDI часто невосприимчивы к стандартным способам лечения и их винфекций часто рецидивирующей 4. В результате, CDI несут ответственность за до $ 4,8 млрд. в ценах здравоохранения в США 5-7.
C. трудный очень чувствительна даже к низким уровнем кислорода в окружающей среде. Для С. несговорчивый сохраняться в окружающей среде и эффективно передаваться от одного к другому, формирование метаболически неактивной споры важно 8. Поскольку обслуживание лабораторного и манипулирование С. несговорчивый требуется контролируемое, анаэробные условия, эти методы требуют использования анаэробной камере. Использование анаэробных камер привело к увеличению восстановления и выделения облигатных анаэробов 9-11, и позволил ряд молекулярных методов должны быть произведены в анаэробной атмосфере.
В дополнение к С. несговорчивый, анаэробная использование камеры и техобслуживанию, которые описаны здесь применимыдругим облигатных анаэробов, таких как других видов клостридий (например C. Perfringens), других желудочно-кишечных видов (например, видов Bacteroides 12) и пародонта патогенов (например, видов Peptostreptococcus 13).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: С. несговорчивый является человека и животных возбудитель, который может вызвать желудочно-кишечные заболевания. Опыты с С. несговорчивый должны выполняться с соответствующими мерами предосторожности биобезопасности (BSL-2).
1. Анаэробной камере эксплуатации и техническому обслуживанию
C. трудный является строгим анаэробных и чрезвычайно чувствителен к даже низких концентраций кислорода в атмосфере. Таким образом, под контролем, анаэробная среда необходима для его успешного манипулирования. Использование анаэробной камере (рис. 1А) обеспечивает наиболее стабильную обстановку и идеальные условия для эффективного выращивания C. несговорчивый и других анаэробных бактерий 14. Здесь, в атмосфере, содержащей газовой смеси (5% CO 2, 10% H 2, 85% N 2) может быть стабильно сохраняется.
Чтобы ввести все детали в камеру без значительного загрязнения кислорода,шлюз должен использоваться (рис. 1b). Это устройство работает как обмена газа и работает автоматически, полу-вручную или вручную. Воздушный шлюз имеет две двери: одну предоставления доступа к внешней стороне шлюз и другой, обеспечивающей доступ к внутренней части анаэробной камере. В зависимости от модели, шлюз может иметь дополнительное дверь, которая может предложить доступ к соседней анаэробной камере, тем самым экономя затраты на отдельном шлюза. Если активно не перемещая элементы в или из камеры, обе двери должны оставаться закрытыми всегда, чтобы избежать загрязнения кислорода. Воздушный шлюз обладает включения / выключения на передней панели и панель из четырех кнопок,. Газовые линии и вакуумный насос шланг связаны в задней части шлюзовой камеры, рядом с панелью, где выключатели для полностью ручной работы агрегата расположены. Рекомендуется два цикла продувки, при использовании азота (N 2), используются перед заполнением обмен с газовой смеси (5% CO 2, 10% H 2, 85% N 2), чтобы уменьшить количество кислорода, подаваемого в камеру. Важно также, чтобы никогда не оставить ни дверь открытой дольше, чем время, количество, требуемое для перемещения элементов в и из обмена и тщательно планировать эксперименты, чтобы уменьшить частоту перемещения элементов в и из камеры. Различные операционные процедуры для виниловых анаэробных камер, изложены ниже. Перед выполнением этих протоколов, убедитесь, что они совместимы с инструкциями изготовителя, предусмотренных с камерой.
- Автоматический режим
Это программируемый и настраиваемый режим и полностью выполняется шлюза. Чтобы запрограммировать шлюз, обратитесь к инструкциям производителя. Рекомендуется программа для типичного вступления в камере включает в себя два продувки циклов с использованием газообразного азота с последующим заполнением воздушный шлюз с газовой смеси, который точно соответствует атмосферу поддерживается в ChamBER. Во время каждого вакуумном цикле, стандартные процедуры заводских предлагаю создавая вакуум до 20 INhg и продувки до 1 дюйм.- Убедитесь, что внутренняя дверь шлюза полностью закрыт.
- Откройте внешнюю дверь шлюза.
- Разместите элементы в шлюзовую камеру и закрыть внешнюю дверь шлюза. Если введения жидкостей, открутить крышки на полпути, чтобы обеспечить эффективное газообмен. Запечатанные пакеты и контейнеры должны быть открыты до начала цикла; отказ от этого требования может деформироваться и повреждение Пластик и контейнеры. Для сохранения стерильности, вскрывайте упаковки достаточно, чтобы только обеспечить эффективное газообмен.
- Нажмите кнопку Пуск.
- Подождите, пока шлюз не ездили на велосипеде в рамках программы и на дисплее появляется сообщение "анаэробных".
- Откройте внутреннюю дверь шлюза.
- Перемещение элементов в камеру.
- Закройте внутреннюю дверь.
- Полу-ручной режим
Этот режим может использоваться при перемещении товаров в или из камеры и необходимо, когда сycling газ внутри камеры не требуется.- Убедитесь, что внутренняя дверь шлюза полностью закрыт.
- Откройте внешнюю дверь шлюза.
- Разместите элементы в шлюзовую камеру и закрыть внешнюю дверь шлюза. Если введения жидкостей, открутить крышки на полпути, чтобы обеспечить эффективное газообмен. Запечатанных упаковок, такие как прививки петель и 96-луночных планшетах, должны быть открыты до начала цикла.
- Нажмите Меню.
- Нажмите кнопку Старт. Шлюз будет отображать функции каждой кнопки и не будет отвечать, пока это не будет завершена:
- Стрелка вверх: активизирует вакуумный насос.
- Стрелка вниз: инициирует азота (продувки) потока газа.
- Старт: инициирует поток газа смешивания.
- Меню: возврат к меню по умолчанию.
- Нажмите кнопку "Up", удаления газа из шлюза, пока на дисплее не появится 20 INhg.
- Нажмите кнопку "Вниз", заполняя шлюз азотом, пока на дисплее не появится менее 1 дюйм. Не О.В.ershoot, как это будет создавать положительное давление в шлюзовой камере, которые могут повлиять на ее целостность.
- Повторите шаги 6 и 7 для выполнения дополнительный цикл продувки.
- Нажимайте "Up", пока на дисплее читает 20 INhg.
- Нажмите кнопку "Пуск", заполняя обмен с газовой смесью, пока на дисплее не появится менее 1 дюйм.
- Откройте внутреннюю дверь шлюза.
- Перемещение элементов в камеру.
- Закройте внутреннюю дверь.
- Ручной режим
Этот режим может быть использован, когда автоматические или полу-ручной режимы не работают или нет питания к шлюзу. Этот режим не работает, если шлюз на, поэтому трудно определить давление в шлюзовой камере. Поскольку вакуум тянуть и раз газ продувки зависит от вакуумных и газовых потоков ставок, соответственно, использование манометром в обмен требуется для контроля давления и снизить риск получения травмы и повреждения шлюзу.- Убедитесь, что внутренняя дверь шлюза полностью закрыт.
- Откройте внешнюю дверь шлюза.
- Разместите элементы, в том числе манометром, в шлюзовую камеру и закрыть внешнюю дверь шлюза. Если введения жидкостей, открутить крышки на полпути, чтобы обеспечить эффективное газообмен. Запечатанных упаковок, такие как прививки петель и 96-луночных планшетах, должны быть открыты до начала цикла.
- Найдите три переключателей на задней панели шлюз с надписью "Руководство Переключатели управления." Они индивидуально помечены как:
- Для Вакуумные
- Азот
- Газ Mix
- Переверните к вакуумным тумблер пока манометр не читает около 20 INhg.
- Поверните выключатель Азот переключить пока манометр не покажет приблизительно 1 дюйм.
- Переверните к вакуумным тумблер пока манометр не читает около 20 INhg.
- Поверните выключатель Азот переключить пока манометр не покажет приблизительно 1 дюйм.
- Переверните к вакуумным тумблер пока манометр не читает около 20 INhg.
- Переверните тумблер газ Mix пока манометр не покажет приблизительно 1 дюйм.
- Откройте внутреннюю дверь шлюза.
- Перемещение элементов в камеру.
- Закройте внутреннюю дверь.
2. Культивирование, Перечисление и хранение С. несговорчивый от кала
Эта процедура предназначена для восстановления C. несговорчивый от фекальных образцов, содержащий споры и впоследствии поддерживать изолированные колонии как вегетативных клеток или спор в длительном хранении, как акции глицерина. Кроме того, эта процедура может быть использована, чтобы перечислить количество С. несговорчивый присутствует в образцах кала (например исследований на животных). Чтобы выборочно и по-разному для обогащения С. несговорчивый, таурохолат-цефокситин-циклосерин-фруктозы агар (TCCFA) используется для подавления роста нормальных фекальной флоры 15-16. Циклосерин бактериостатическим для грамотрицательных бактерий, в то время как цефокситин более широко ингибирует рост и грамотрицательных и-положительных бактерий, за исключением С. несговорчивый и наиболее введите штаммов кокки. Индикатор рН, нейтральный красный, могут быть включены в среде, как ферментации фруктозы приведет к снижению рН и последующей изменению цвета с красного / оранжевого до желтого цвета. Чтобы эффективно восстановить споры C. несговорчивый как вегетативных бактерий, солей желчных кислот таурохолат натрия используется, чтобы вызвать прорастание 17-18. Поскольку С. несговорчивый образует спор, спирт или термообработку образцов могут быть использованы для уменьшения или устранения вегетативных клеток, ограничение роста загрязняющих флоры, которые могут повысить эффективность С. несговорчивый восстановление 19. Как упоминалось выше, очень важно, чтобы предварительно уменьшить все пластины для по меньшей мере 1-2 часа в анаэробной камере перед использованием, чтобы гарантировать удаление остаточного кислорода. Воздушный dryiнг пластины перед использованием в камере может уменьшить образование конденсата. Жидкая среда может потребоваться до 24 ч для снижения зависимости от объема и соотношения поверхности к воздуху контейнера используется.
Прежде чем начать, следующие пункты должны быть помещены в анаэробной камере:
- Кала
- Стерильные тампоны
- Стерильные прививки петли
- 1x PBS (см. материалы)
- TCCFA пластины (см. материалы)
- BHIS (Brain Heart Infusion среда с дрожжевым экстрактом) пластины и бульон (см. Материалы)
- 50% глицерина (стерилизовать)
- 10% L-цистеин (стерилизовать)
- Криогенные флаконы хранения
* В качестве альтернативы, отдельные колонии могут быть распределены на чашках с агаром BHIS, а затем соскабливают и ресуспендировали в BHIS жидкой среде с 15% глицерина для длительного хранения при -80 ° С. ** Важно отметить, что Грам-окрашивание не является эффективным стратегия для идентификации C. несговорчивый непосредственно из образцов стула 23 С. несговорчивый должны сначала быть изолированы от других флоры, находящихся в стуле.
- Ресуспендируют кала в 1X PBS (это могут быть выполнены в аэробных условиях) и гарантировать, что образец кала полностью ресуспендировали в 1х PBS на вортексе. Если перечисления C. несговорчивый со стула, взвешивают образец кала до добавления 1x PBS.
- Сделать серийные разведения ресуспендированного образца кала в 1x PBS для соответствующей изоляции или перечисления колониеобразующих единиц (КОЕ) на грамм стула.
- С помощью асептической техники, применяются 100 мкл каждого последовательного разбавления до TCCFA пластин.
- Использование серии стерильных петель инокуляции, полоса применяется для культивирования изолированных колоний или равномерно нанесенный культуру на поверхности пластины TCCFA для подсчета колоний.
- Инкубировать в анаэробных условиях в течение 48 ч при 37 ° С. Вполне возможно, для обнаружения и идентификации C. несговорчивый колонии в пределах 24 часов на основеквартиры, нерегулярные, матового стекла появление колоний 15, хотя и более точная идентификация и подсчет достигается после 48 часов.
- Использование стерильных петли прививки, субкультура любые колонии, которые могут оказаться С. несговорчивый на предварительно восстановленных пластин агара BHIS, с добавлением 0,03% L-цистеина 20. Pick индивидуальный колонии, а полоса на тарелку в квадрантах, с помощью нового стерильную петлю для инокуляции каждом квадранте, чтобы получить изолированные колонии. Кроме того, подсчитать C. несговорчивый колонии из каждого разведения (это могут быть выполнены в аэробных условиях) и вычислить количество колониеобразующих единиц на грамм образца стула.
- Подтвердите C. несговорчивый идентификация через Грама-окрашивания. После грам-окрашивание, С. несговорчивый появится как фиолетовые стержней и некоторые клетки могут содержать терминальные эндоспоры. Полимеразной цепной реакции (ПЦР) идентификация генов, которые кодируют токсина B может предоставить дополнительную подтверждениетоксигенные штаммы C. несговорчивый 21 а мультилокусных набрав последовательность (MLST) является успешным для идентификации и точного набора текста неизвестных и нетоксигенных штаммов C. несговорчивый 22.
- Для поддержания запас C. несговорчивый при -80 ° С, выбрать индивидуума, изолированных колоний из BHIS агаром с использованием стерильного прививки петли и ресуспендируют колонии в 10 мл предварительно восстановленного BHIS жидкую среду с добавлением 0,03% L-цистеина. *
- Выдержите в течение ночи в анаэробных условиях при 37 ° С, или пока культура не станет мутным.
- Добавить 333 мкл 50% глицерина и 666 мкл С. несговорчивый культура в 1,8 мл криогенной трубки, чтобы создать 15% глицерина запас изолированного штамма.
- Плотно закрывайте колпачок криогенной трубку, хорошо перемешать и сразу же снять акции с анаэробной камере и место в -80 ° C морозильник для длительного хранения.
3. Культивирование C. несговорчивый
Эта процедура предусматривает восстановление C. несговорчивый от глицерина запасов, хранящихся при температуре -80 ° С. Поскольку повторные циклы замораживания-оттаивания могут убить вегетативные клетки, важно, чтобы держать глицерина запасы замороженных в любое время. Мы не рекомендуем использовать сухой лед для передачи штаммов в и из камеры, как испарение сухого льда может изменить среду в камере. Вместо этого, мы рекомендуем использовать замороженные стойки охлаждения держать глицерина запасы замороженных во время транспортировки. Для различных селективных и дифференциальных целей, три среды обычно используются для культивирования C. несговорчивый. TCCFA, как обсуждалось выше, является селективным для С. несговорчивый и содержит таурохолат натрия, germinant. Brain Heart Infusion, дополненной дрожжевым экстрактом (BHIS) является широко используемым, обогащенный, неселективные носитель, который позволяет для роста широкого спектра организмов (рис. 2а) 24. Часто, L-цистеине добавляется к BHIS в качестве восстанавливающего агента 20. Наконец, добавление крови к среде (рис. 2В) позволяет более эффективно, чем на споруляции TCCFA и обеспечивает обнаружение уникального зеленоватым или зеленовато-желтого флуоресценции, проявляемой С. несговорчивый под длинноволновой ультрафиолетовой (УФ) 15 (рис. 2С). При культивировании C. несговорчивый из запасов спор, очень важно помнить, что таурохолат натрия должен быть добавлен в среду, чтобы обеспечить прорастание.
Прежде чем начать, следующие пункты должны быть помещены в анаэробной камере:
- Замороженные запаса глицерина (в режиме охлаждения стойки)
- Стерильные прививки петли
- TCCFA или BHIS пластины (см. материалы)
- BHIS бульон (см. Материалы)
- 50% глицерина (стерилизовать)
- Криогенные флаконы хранения
- Поместите замороженные глицерина запас C. несговорчивый в охлаждающей стойку, которая хранится при температуре -80 ° C пр.IOR использовать для предотвращения размораживания.
- Принесите замороженного запаса глицерина на сухом льду в анаэробной камере.
- С помощью асептической техники и стерильный прививки петли, место небольшое количество акций на тарелку и полоски поперек одном квадранте пластины.
- Поверните пластину на 90 ° и, используя новый стерильный прививки петлю, продолжают полоски поперек втором квадранте.
- Повторите для третьего и четвертого квадрантов, чтобы обеспечить изоляцию отдельных колоний.
- Немедленно снять замерзший глицерина акции от анаэробной камере и вернуться к -80 ° С.
- Инкубировать в анаэробных условиях в течение ночи при 37 ° С Отдельные изолированные колонии должны быть соблюдены после ночного роста.
4. Очищающий Споры от С. несговорчивый
Как споруляции требуется для выживания в богатых кислородом средах и для эффективной передачи болезни 8, подготовка запасов спор является Ofteн необходимо для последующих применений, а не только микроскопии и животных исследований. Важно отметить, что перечисление споры требует повторения, чтобы обеспечить воспроизводимость пунктам. Пипетки вверх и вниз несколько раз между разведения также снижает потери, так как споры придерживаться пластика хорошо.
Споруляция из С. несговорчивый не таким быстрым, или однородная, как и другие спорогенной видов. Для оптимизации производства и восстановление спор, либо споруляционная среда, (SMC) 17,25 или 70:30 среда 26 рекомендуется. Другие носители, обычно используемые в BHIS, что требует 4-5 дней роста до эффективной споруляции 27 видно, а Clospore, жидкая среда, которая производит высокие титры спор (10 7 - 10 8 спор на миллилитр) после 72 ч роста. Другие протоколы используют ледяной водой, а не 1X PBS 20, однако, использование изотонического раствора может уменьшить споры прилипание друг к другу и пластиковых поверхностей. Кроме того,некоторые исследователи дальнейшей очистки их споры с использованием сахарозы градиент полностью удалить вегетативные клетки и мусора 29.
Прежде чем начать, следующие пункты должны быть помещены в анаэробной камере:
- Стерильные прививки петли
- BHIS, SMC и / или 70:30 пластины (см. материалы)
- BHIS бульон (см. Материалы)
- 1x PBS, фильтр-стерилизовать (см. материалы)
- Культура штаммы из замороженного раствора в глицерине на предварительно восстанавливают BHIS пластин и инкубировать в анаэробных условиях в течение ночи при 37 ° С.
- Restreak на нескольких предварительно восстанавливают SMC или 70:30 пластин и инкубировать в анаэробных условиях при 37 ° С в течение 24-48 часов. Образование спор может следовать через фазово-контрастной микроскопии. Споры появится фаза ярки пока растительный и материнские клетки появится фаза темно. * В качестве альтернативы, споры могут быть очищены от 70:30 жидкой среде после 24-48 часов, что дает 10 5 -10 6 спор на миллилитр, в зависимости от Straiн используется.
- Используя стерильный прививки петлю, скоблить тарелки и ресуспендирования клеток в 10 мл стерильной 1x PBS.
- Откажитесь пластины и снимите суспензией спор с анаэробной камере. Гранул клеток при 3000 х г в течение 15 минут. Промывают клетки дважды в 1x PBS, полностью ресуспендирования клеточного осадка каждый раз.
- Выдержите в течение ночи при 4 ° С, чтобы помочь в лизиса вегетативных и материнских клеток.
- Инкубировать при 70 ° С в течение 20 мин, чтобы убить любые остаточные вегетативные клетки.
- Для определения колониеобразующих единиц (КОЕ) на миллилитр, серийно разбавленных каждого препарата спор в 1x PBS и пластину на BHIS + 0,1% таурохолат натрия. Планшеты инкубируют в течение как минимум 24 часов, прежде чем перечислить колонии.
- Споры могут быть сохранены в 1x PBS в любом комнатной температуре или температуре 4 ° С для длительного хранения. При хранении при 4 ° С, может быть полезным для подогрева препарат спор при 55 ° С в течение 15 мин, чтобы восстановить эффективное прорастание.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Пример C. несговорчивый выросли на BHIS и Колумбийского анаэробного овец кровяного агара СМИ можно увидеть на рисунке 2. С. несговорчивый формирует неправильные колонии, которые являются плоскими и обладающие матового стекла внешний вид, который очевидно в обеих средах. Здесь, эритромицин чувствительных клинический изолят из С. несговорчивый, 630E 30, выращивается на BHIS агар, обогащенной, не-селективной среде, в течение 24 часов при 37 ° С (рис. 2А). Колонии на Columbia анаэробной овец кровяной агар появляться аналогичны тем, которые выращивали на BHIS под белым светом (рис. 2В), однако использование этого средства также предусматривает обнаружение зеленоватой флуоресценции или зеленовато-желтого проявляемой С. несговорчивый под длинноволновой ультрафиолетовой (УФ) 15 (рис. 2С). С. несговорчивый колонии на TCCFA агар похожи на рост на BHIS агара. Из-за наличия двух антибиотиков в TCCFA среды, в тимэ период 48 роста ч необходимо перед перечисления колонии.
Рисунок 1. Кой лаборатории Тип C винил камера и ее компонентов. (А) Кой лаборатории Тип C винил камера, которая обеспечивает рабочее пространство для одного человека за один раз (42 дюйма х 32 дюймов). Он содержит блок вентилятора катализатора (задний левый угол), который циркулирует и нагревает воздух, и держит Стак-Пак, содержащий палладиевый катализатор, необходимый для снижения любого загрязнения кислорода. (B) шлюз служит обмена и обеспечивает механизм для передачи материалов в и из камеры, не допуская значительное загрязнение кислорода в анаэробной среде. Воздушный шлюз имеет две двери: одна, обеспечивающий доступ к внешней стороне шлюз и другой, обеспечивающей доступ к внутренней части го э анаэробной камере. Воздушный шлюз программируется и позволяет для индивидуальных циклов для вступления в камере. Прибор включится в автоматическом, полу-ручных и ручном режимах. (С) Прикрепленный, гибкие латексные перчатки предусмотрены которые позволяют полный диапазон движения и достичь в камере. Перчатки прикреплены к специализированной манжеты, прикрепленной к виниловых рукавов с виниловым клеем, что позволяет замену перчатки без нарушения анаэробного атмосферу камеры. Неопрена перчатки, также доступны. (D) Модель 10 Газоанализатор непрерывно контролирует как кислород, так и уровень водорода, обеспечивающие мгновенное считывание атмосферы внутри камеры. Это устройство позволяет оперативно оповещения в случае утечки, неправильное сочетание газ используется или дополнительные проблемы возникают через звуковые сигналы и мигающим светодиодным светом.
ig2.jpg "/>
Рисунок 2. Появление С. несговорчивый колонии на различных средствах массовой информации. Характеристика плоским, нерегулярные, матового стекла появление очевидно с эритромицин-чувствительный клинического изолята из С. несговорчивый, 630E 30, выращенных на BHIS агара в течение 24 ч (А) и Колумбийский анаэробной овец кровяном агаре в течение 48 ч в белом свете (В) и длинных волн ультрафиолетового света (С).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Методы, описанные здесь обеспечить простую и быстрого восстановления C. несговорчивый из различных образцах фекалий, в том числе людей, мышей и хомяков, а также долговременного хранения С. несговорчивый как глицерин или спор запасов. С. несговорчивый может быть трудной организм выращивать, но тщательный уход из анаэробной среде и применение методов асептики может обеспечить устойчивый рост и сокращение загрязнения.
Анаэробные камеры: Соображения и техническое обслуживание
Есть два типа анаэробных камер: жесткие камеры или виниловые камеры. Жесткие камеры, как правило, изготовлены из алюминия или жесткого полимера (например, плексигласа или акриловые материалы), что позволяет использовать едких химических веществ. Жесткие камеры могут быть преобразованы в стиле без перчаток и менее склонны к проколам, однако, утечка трудно обнаружить и найти и жесткие камеры требуют некоторого методкомпенсировать смещение газа во время использования. Полимерные блоки часто снабжены продувки только шлюз, который может стоить больше работать. Для обеспечения строгих атмосферных условий, стоимости, гибкость требований лабораторных космических и легкого обслуживания, винил анаэробные камеры рекомендуется (Coy лабораторные материалы, рис. 1А). Это анаэробная камера состоит из виниловых бардачке, который поддерживается трубчатой алюминиевой структуры и подключен к воздушный шлюз, который функционирует в качестве обмена для передачи материалов в и из камеры (рис. 1В), используя латексные или резиновые перчатки прикреплены к виниловых рукавами (рис. 1в). Важно точно следовать инструкциям производителя для правильного включилась в организацию анаэробной камере. Это может быть регулируемой температурой с одним (или более, в зависимости от размера камеры) нагреватель коробка блоки, которые обеспечивают циркуляцию воздуха через палладиевого катализатора. Палладий окtalyst служит для уменьшения загрязнения кислородом, вводимым через развязки путем преобразования водорода и кислорода в воде. В идеале, оба кислорода и водорода уровни контролируются с помощью газового анализатора (рис. 1D), отображающий концентрацию кислорода в частях на миллион (м.д.) и концентрация водорода в процентах.
Жидкие и твердые носители должны быть предварительно восстанавливают в анаэробной камере перед использованием. Чашки Петри (100 мм в диаметре) может быть снижена лишь на два часа перед использованием 31, однако, жидкие среды должна быть снижена на ночь. Важно отметить, что средства массовой информации должны быть охлаждены до передачи в камеру, чтобы предотвратить вскипание жидкого хладагента во время эвакуации шлюзового отсека. Пластиковые расходные материалы, такие как 96-луночные планшеты, должны быть предварительно уменьшена в течение ночи перед использованием, как пластмасса является пористым и может хранить молекул кислорода 32. В зависимости от применения, некоторые пластики должны быть предварительно уменьшена до 48 часов перед использованием 33. Biohazard отходов должны бэ утилизировать надлежащим образом. Небольшое биологической мешок может храниться внутри камеры, но должны быть заменены часто.
Концентрация водорода по меньшей мере 3% должны быть сохранены внутри камеры, так как это обеспечить как хороший рост С. несговорчивый и эффективное удаление кислорода. Если концентрация водорода падает ниже 3% или если камера не используется в течение нескольких дней, цикл камера должна быть выполнена для восстановления концентрации водорода в желательных уровней. Здесь, примерно треть газа в камере пылесосом (коробка винил значительно выкачать) и заменена свежей газовой смеси. Убедитесь, что шлюз является анаэробным перед началом. Насосное слишком много газа в камеру следует избегать, так как это не только ставит ненужного стресса на виниловый мешок, но также исключает попадание пользователю в задней части камеры. Всегда выполняйте эту процедуру в хорошо проветриваемом помещении. Принять дополнительные меры предосторожности, если чаMBER хранится в небольшом, плохо проветриваемом помещении. Откройте все двери в номер, поскольку содержание газа внутри камеры может задохнуться пользователю.
Дополнительная обслуживание включает регенерацию палладиевого катализатора, чтобы обеспечить эффективное удаление кислорода внутри камеры. Как кислород и водород уменьшается на катализаторе, вода может накапливаться на поверхности палладия покрытых гранул алюминия, что снижает их эффективность с течением времени. Чтобы преодолеть это, палладиевые катализаторы должны быть регенерирован по крайней мере один раз в неделю путем обжига по меньшей мере 230 ° С в течение одного часа. Кроме того, в результате восстановления кислорода, так и испарения воды из пластин и средств массовой информации, накопление воды является общей проблемой в анаэробных камер. Чтобы обеспечить удобное манипулирование и увеличить период полураспада оборудования внутри камеры, влагопоглощающие пакеты могут быть использованы, но должны быть высушены часто следуя той же процедуре, используемой для палладиевых катализаторов. Кроме того, деувлажнитель может быть использован который циркулирует воздух через металлический блок, который конденсатов воды и собирают в контейнер. Устройство предотвращает переполнение емкости с водой, однако, осушители должны контролироваться и контейнеры должны быть полностью очищены, когда близко к полному. Для очистки виниловых камеру, использование мягкой тканью и любой имеющегося в продаже средства рекомендуется для поливинилхлорида (ПВХ) рекомендуется (например, пластиковые Магия чистого, арт. 1600480, кой лаборатории). Чтобы не поцарапать и не повредить виниловую камеру, не используйте бумажные полотенца, КИМ-салфетки или продукты, содержащие кетоны или других соединений, которые могут повредить ПВХ.
Наконец, С. несговорчивый производит сероводород (H 2 S), что крайне реактивной и коррозию. Сероводород может быть разрушительным для приборов, палладиевого катализатора и любой открытой металлов. Если это возможно, не оставляйте приборы, такие как гомогенизаторы и спектрофотометров, в ChambER в течение длительных периодов времени, чтобы избежать коррозии, вызванной сероводорода. Из-за производства сероводорода, такие предметы, как анализатора палладиевого катализатора и газа должны быть заменены периодически как часть регулярного технического обслуживания камеры. Альтернативы для снижения уровней сероводорода внутри камеры, например, с использованием активированного угля, ацетат свинца, хлорид серебра или серебра, сульфат серебра, чтобы поглотить или химически удалить сероводород, были описаны 34 и может быть использовано, чтобы замедлить коррозию оборудования.
Дополнительные меры предосторожности
Никогда не открывайте одну дверь к шлюзу без обеспечения, что другая дверь закрыта и заблокирована для предотвращения загрязнения кислорода. Кроме того, избегать использования острых предметов внутри камеры, чтобы уменьшить риск прокола винил.
Важно отметить, что водород является горючий газ в присутствии кислорода. Будьте осторожны при введении элементов яНТО камеры, что высокие уровни загрязнения кислорода не происходит (более 999 частей на миллион). Важно использовать только предварительно смешанного негорючий анаэробной газовой смеси и внимательно следить за газоанализатор в камере, особенно при использовании нового бензобак. Если оба водорода и кислорода концентрации выше 4% происходят, убедитесь, что соответствующие аварийные процедуры, которые должны быть изложенные в стандартных операционных процедур лаборатории (СОП), следуют.
Поиск и устранение неисправностей С. несговорчивый рост
Если слабый рост C. несговорчивый культуры наблюдается в обогащенной среде, это чаще всего из-за загрязнения кислорода в камере. Добавление восстановителя (например, L-цистеина или тиогликолятной) в среду может улучшить рост, однако, вопрос о загрязнения кислорода в камере нужно будет решить. Мониторинг уровня кислорода и водорода в камере с помощью газоанализатора может быстроLert пользователю вопросы, стоящие перед задержкой в прогресс и снижению производительности происходит. Если загрязнение кислорода происходит, быстро определять источник с детектором утечки газа (доступно от Coy Laboratories) рекомендуется. Чтобы увеличить шансы в поиске местоположение утечки, тряпкой, смоченной в спирте может быть размещен внутри камеры, так как детектор утечки газа могут определить повышенные уровни углеводородов, а также повышенный уровень водорода. После того, как источник утечки найден, он может быть восстановлен с помощью клея или силикона в соответствии с инструкциями изготовителя.
Ряд организмов легко расти в анаэробных условиях, в том числе других распространенных видов клостридий (например Clostridium Perfringens) и Факультативный анаэроб, кишечной палочки. Асептики и другие стратегии могут снизить риск заражения. Соответствующие организации в камере, таких как размещение элементов в пределах досягаемости, чтобы уменьшить потенциал Рили разливы и быстрое удаление накопленного биологически опасных отходов, может снизить риски загрязнения. Кроме того, бумажные полотенца, смоченной разбавленным раствором хлорной извести можно периодически поступают в камеру, чтобы вытереть поверхности и латекса или резиновые перчатки. Очень важно, чтобы не оставить отбеливать или спиртовых растворов внутри камеры в течение длительного периода времени, поскольку они могут проникать в атмосферу и твердых и жидких сред, убив C. несговорчивый, а также повреждения винил 34. Кроме того, регулярная замена латексных или неопрена перчатки могут также уменьшить риск загрязнения. Как упоминалось выше, если не уверены, если организм C. несговорчивый или загрязнений, тест на наличие гена tdcB с помощью ПЦР может быстро определить, является ли организм С. несговорчивый 21. Наконец, если культивирование нескольких организмов в пределах одной анаэробной камере, важно отметить, что С. несговорчивый может производить обменные побочных продуктов (е. Г. Сероводород), которые ингибируют рост других анаэробных организмов и наоборот.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить кой лаборатории за любезно предоставленные фотографии анаэробной камере. Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения гранта DK087763 (SMM) и STEP / HHMI учебной программы стипендий развития (АНХ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Proteose Peptone no. 2 | BD | 212120 | |
| Na2HPO4 | Fisher | S373 | |
| KH2PO4 | Fisher | BP362 | |
| NaCl | Fisher | S27 | |
| MgSO4 (anhydrous) | Fisher | M65 | |
| á´…-Fructose | Fisher | L96 | |
| Sodium taurocholate | Sigma | T4009 | |
| á´…-cycloserine | Sigma | C6880 | |
| Cefoxitin | Fluka | C4786 | |
| Brain heart infusion medium | BD | 237300 | |
| Proteose Peptone | BD | 211684 | |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A5132 | |
| Tris base | Fisher | BP152 | |
| Agar | BD | 214010 | |
| L-cysteine | Sigma | C7755 | |
| BactoPeptone | BD | 211684 | |
| Columbian sheep blood agar | Fisher | L21928 | |
| NaCl | Fisher | S27 | |
| KCl | Fisher | P217 | |
| Glycerol | Fisher | BP2291 | |
| Sterile inoculating loops | Fisher | 22363596 | |
| Sterile swabs | Fisher | 1495990 | |
| Coy Vinyl Anaerobic Chamber and Accessories | Coy Laboratory Products, Inc | Customer Specified | These items are custom ordered per laboratory needs |
| Materials | |||
| TCCFA agar Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g Na2HPO4 5 g KH2PO4 1 g NaCl 2 g MgSO4 (anhydrous) 0.1 g Fructose 6 g Agar 20 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add: 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 0.1%) 25 ml of 10 mg/ml á´…-cycloserine, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 250 μg/ml) 1.6 ml of 10 mg/ml cefoxitin, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 16 μg/ml) BHIS Medium Brain heart infusion 37 g Yeast extract 5 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate (dissolve in water; final concentration, 0.1%) SMC Sporulation Medium BactoPeptone 90 g Protease peptone 5 g (NH4)2SO4 1 g Tris base 1.5 g Agar 15 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 70:30 Medium BactoPeptone 63 g Protease peptone 3.5 g Brain heart infusion 11.1 g Yeast extract 1.5 g (NH4)2SO4 0.7 g Tris base 1.06 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (final concentration, 0.03%). Blood agar The use of premade Columbia anaerobic sheep blood agar plates (Fisher Scientific, L21928)35 is recommended. 1X Phosphate buffered saline (PBS) NaCl 8.01 g KCl 0.2 g Na2HPO4 1.44 g KH2PO4 0.27 g Bring to 1 L with deionized water and adjust pH to 7.4 with HCl. Filter sterilize before use. |
|||
References
- Hall, I. C., O'Toole, E. Intestinal flora in new-borin infants - With a description of a new pathogenic anaerobe, Bacillus difficilis. Am. J. Dis. Child. 49, 390-402 (1935).
- Tedesco, F. J., Barton, R. W., Alpers, D. H. Clindamycin-Associated Colitis - Prospective Study. Ann. Intern. Med. 81, 429-433 (1974).
- Gerding, D. N. Clostridium difficile 30 years on: what has, or has not, changed and why. Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 2-8 (2009).
- Gerding, D. N., Muto, C. A., Owens, R. C. Treatment of Clostridium difficile infection. Clin. Infect. Dis. 46, Suppl 1. 32-42 (2008).
- Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin. Infect. Dis. 55, 88-92 (2012).
- Bouza, E. Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden. Clin. Microbiol. Infect. 18, 5-12 (2012).
- Peery, A. F., et al. Burden of gastrointestinal disease in the United States: 2012 update. Gastroenterology. 143, 1171-1173 (2012).
- Deakin, L. J., et al. The Clostridium difficile spo0A gene is a persistence and transmission factor. Infect. Immun. 80, 2704-2711 (2012).
- Drasar, B. S. Cultivation of anaerobic intestinal bacteria. J. Pathol. Bacteriol. 94, 417-427 (1967).
- Leach, P. A., Bullen, J. J., Grant, I. D. Anaerobic CO 2 cabinet for the cultivation of strict anerobes. Appl. Microbiol. 22, 824-827 (1971).
- Killgore, G. E., Starr, S. E., Del Bene,, Whaley, V. E., N, D., Dowell, V. R. Comparison of three anaerobic systems for the isolation of anaerobic bacteria from clinical specimens. Am. J. Clin. Pathol. 59, 552-559 (1973).
- Bacic, M. K., Smith, C. J. Laboratory maintenance and cultivation of bacteroides species. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 13, Unit 13C 11 (2008).
- Doan, N., Contreras, A., Flynn, J., Morrison, J., Slots, J. Proficiencies of three anaerobic culture systems for recovering periodontal pathogenic bacteria. J. Clin. Microbiol. 37, 171-174 (1999).
- Socransky, S., Macdonald, J. B., Sawyer, S. The cultivation of Treponema microdentium as surface colonies. Arch. Oral. Biol. 1, 171-172 (1959).
- George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 9, 214-219 (1979).
- Wilson, K. H., Silva, J., Fekety, F. R. Suppression of Clostridium difficile by normal hamster cecal flora and prevention of antibiotic-associated cecitis. Infect. Immun. 34, 626-628 (1981).
- Wilson, K. H., Kennedy, M. J., Fekety, F. R. Use of sodium taurocholate to enhance spore recovery on a medium selective for Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 15, 443-446 (1982).
- Bliss, D. Z., Johnson, S., Clabots, C. R., Savik, K., Gerding, D. N. Comparison of cycloserine-cefoxitin-fructose agar (CCFA) and taurocholate-CCFA for recovery of Clostridium difficile during surveillance of hospitalized patients. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 29, 1-4 (1997).
- Marler, L. M., et al. Comparison of five cultural procedures for isolation of Clostridium difficile from stools. J. Clin. Microbiol. 30, 514-516 (1992).
- Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 1 (2009).
- Bouillaut, L., McBride, S. M., Sorg, J. A. Genetic manipulation of Clostridium difficile. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 2 (2011).
- Lemee, L., Pons, J. L. Multilocus sequence typing for Clostridium difficile. Methods. Mol. Biol. 646, 77-90 (2010).
- Shanholtzer, C. J., Peterson, L. R., Olson, M. N., Gerding, D. N. Prospective study of gram-stained stool smears in diagnosis of Clostridium difficile colitis. J. Clin. Microbiol. 17, 906-908 (1983).
- Smith, C. J., Markowitz, S. M., Macrina, F. L. Transferable tetracycline resistance in Clostridium difficile. Antimicrob. Agents Chemother. 19, 997-1003 (1981).
- Permpoonpattana, P., et al. Surface layers of Clostridium difficile endospores. J. Bacteriol. 193, 6461-6470 (2011).
- Putnam, E. E., Nock, A. M., Lawley, T. D., Shen, A. SpoIVA and SipL are Clostridium difficile spore morphogenetic proteins. J. Bacteriol. , (2013).
- Burns, D. A., Minton, N. P. Sporulation studies in Clostridium difficile. J. Microbiol. Methods. 87, 133-138 (2011).
- Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile. J. AOAC Int. 94, 618-626 (2011).
- Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. Inhibiting the initiation of Clostridium difficile spore germination using analogs of chenodeoxycholic acid, a bile acid. J. Bacteriol. 192, 4983-4990 (2010).
- O'Connor, J. R., et al. Construction and analysis of chromosomal Clostridium difficile mutants. Mol. Microbiol. 61, 1335-1351 (2006).
- Buggy, B. P., Wilson, K. H., Fekety, R. Comparison of methods for recovery of Clostridium difficile from an environmental surface. J. Clin. Microbiol. 18, 348-352 (1983).
- Koch, C. J., Kruuv, J. The release of oxygen from polystyrene Petri dishes. Br. J. Radiol. 45, 787-788 (1972).
- Ethapa, T., et al. Multiple factors modulate biofilm formation by the anaerobic pathogen Clostridium difficile. J. Bacteriol. , (2012).
- Speers, A. M., Cologgi, D. L., Reguera, G. Anaerobic cell culture. Curr. Protoc. Microbiol. Appendix 4, Appendix 4F (2009).
- Lyras, D., et al. Toxin B is essential for virulence of Clostridium difficile. Nature. 458, 1176-1179 (2009).
