Summary
클로 스트 리듐 디피는 엄격한 혐기성 미생물과 항생제 관련 설사 (AAD)를 일으키는 원인이되는 병원성 세균입니다. 여기서, 분리 배양 및 C를 유지하기위한 방법 어울리지 않는 식물 세포 및 포자가 설명되어 있습니다. 이 기술은 최적의 C에 대한 적절한 조건을 보장하기 위해 정기적 인 유지 보수를 필요로하는 혐기성 챔버를 필요로 남과 어울리지 재배.
Abstract
클로 스트 리듐 디피 항생제 관련 설사 (AAD)의 주된 책임이며 중요한 병원 내 병원체 그람 양성, 혐기성, sporogenic 세균이다. C. 남과 어울리지 분리 및 배양하는 악명 어려운 환경에있는 산소도 낮은 수준에 매우 민감하다. 여기에, C.를 분리하는 방법 대변 샘플에서 어울리지 이후에 배양 C. 장기 저장을위한 글리세롤 주식의 준비를위한 어울리지이되게됩니다. 현미경과 동물 연구 등의 다운 스트림 응용 프로그램의 다양한 실험실에서 포자 주식을 준비하고 열거하는 기술도 설명되어 있습니다. 이 기술은 최적의 C에 대한 적절한 조건을 보장하기 위해 일관성있는 혐기성 환경을 유지하는 혐기성 챔버를 필요로 남과 어울리지 성장. 우리는 CA없이 챔버 안팎으로 물질을 전달하기위한 프로토콜을 제공한다효율적이고 일관성있는 C.에 해당하는 혐기성 환경을 유지하기 위해 필요한 정기적 인 유지 보수에 대한 제안과 함께 중요한 산소 오염을 사용하여 남과 어울리지 재배.
Introduction
클로 스트 리듐 디피는 의무를 혐기성 미생물과 인간과 동물의 잠재적으로 치명적인 위장 병원체 그람 양성, 포자를 형성하는 박테리아입니다. 처음에는 신생아 1, C.에서 배설물 샘플에서 발견 공생 생물로 1935 년에 설명 어울리지는 나중에 항생제 치료 2와 관련된 위 막성 대장염의 원인 물질로 증명되었다. C.에게 남과 어울리지 않는 감염 (CDI)는 일반적으로 C에 대한 틈새 시장을 창조하는 정상 결장 식물의 중단 결과 항생제 치료가옵니다 어울리지 2 번창한다. C. 어울리지는 분변 - 경구 경로를 통해 휴면 포자로 전송 이후에 여러 가지 독소를 생성하고 심각한 질병 및 대장염 3을 일으킬 수있는 식물 세포를 생산, 위장 내에서 발아한다. CDI는 종종 기존의 치료와 이들의에 불응fections 자주 4를 반복합니다. 그 결과, CDI는 미국 5-7 의료 비용의 최대 48억달러에 대한 책임이 있습니다.
C. 남과 어울리지 않는 환경에있는 산소도 낮은 수준에 매우 민감하다. C.에 대한 어울리지 않는 환경에서 지속하고 효율적으로 호스트에 호스트로부터 전송, 대사 적으로 비활성 포자의 형성이 중요 8입니다. 때문에 C.의 실험실 유지 및 조작 어울리지 이러한 기술은 혐기성 챔버의 사용을 필요로, 제어, 혐기성 환경이 필요합니다. 혐기성 챔버의 사용은 증가 된 회복 의무를 혐기성 9-11 단리 초래하였으며, 혐기성 분위기에서 수행 될 분자 기술의 수가 허용했다.
C. 외에도 어울리지는 여기에 설명 된 혐기성 챔버의 사용 및 유지 보수가 적용됩니다같은 다른 클로스 트리 디움 종 (예를 들면 C. 퍼프 린 젠스), 다른 위장 종 (예를 들어 테로이 12 종) 및 치주 병원균 (예 Peptostreptococcus 종 13) 등의 의무를 혐기성 균에.
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Protocol
참고 : C. 어울리지 위장 질환을 일으킬 수있는 인간과 동물의 병원체이다. C. 관련된 실험 어울리지 적절한 바이오 안전성주의 사항 (BSL-2)으로 수행해야합니다.
1. 혐기성 실 사용 및 유지 보수
C. 남과 어울리지 않는 엄격한 혐기성 미생물과 대기 중의 산소도 낮은 농도에 매우 민감하다. 따라서, 제어, 혐기성 환경은 성공적인 조작에 필요하다. 혐기성 챔버 (도 1a)의 사용은 C. 효과적인 재배 가장 안정적인 환경과 이상적인 조건을 제공한다 남과 다른 혐기성 세균 14. 여기서, 혼합 가스 (5 % CO 2, 10 % H 2, 85 % N 2)를 함유하는 분위기가 안정적으로 유지 될 수있다.
중요한 산소 오염없이 실에 어떤 항목을 소개하고,에어 록 (그림 1B)를 사용해야합니다. 이 장치의 가스 교환 등의 기능과는 반 수동으로 또는 수동으로, 자동으로 작동합니다. 에어 록의 외부와 혐기성 챔버의 내부에 다른 액세스를 제공에 대한 액세스를 제공 하나 출입구는 두 개의 문이있다. 모델에 따라, 에어 락 따라서 별도의 출입구의 비용을 절감, 인접 혐기성 챔버에 대한 액세스를 제공 할 수있는 추가로 문을 가질 수있다. 적극적으로 챔버 또는 축소 항목을 이동하지 않는 한, 두 문은 산소의 오염을 방지하기 위해 항상 닫혀 있어야됩니다. 출입구는 전면에 ON / OFF 스위치와 네 개의 버튼이 포함 된 패널을 보유하고있다. 가스 라인과 진공 펌프의 호스 유닛의 완전 수동 조작 스위치가있는 패널 가까운 출입구의 후면에 접속된다. 그것은이 퍼지 사이클은 질소 가스를 사용하여 (N 2)를 사용하는 것을 권장 가스 혼합 (5 % CO 2와 교환을 작성하기 전에, 10 % H 2, 챔버에 도입 산소의 양을 줄이기 위해 85 % N 2). 그것은 또한과 교류 밖으로 항목을 이동하는 데 필요한 양의 시간보다 더 오래 열려있는 하나의 문을 떠나지 않을 것이 중요합니다 정중 챔버 안팎 항목을 이동의 빈도를 감소시키는 실험을 계획한다. 비닐 혐기성 챔버의 다른 운영 절차는 아래에 설명되어 있습니다. 이러한 프로토콜을 수행하기 전에 이러한 챔버와 함께 제공되는 제조업체의 지침에 호환되는지 확인합니다.
- 자동 모드
이 프로그램과 사용자 정의 모드이며 출입구가 완전히 수행됩니다. 에어 락을 프로그래밍하려면, 제조업체의 지침을 참조하십시오. 챔버 내로 전형적인 엔트리 추천 프로그램 밀접 참 내에 유지 분위기 일치 가스 혼합 기밀실 리필 이어 질소 가스를 이용하여이 퍼지 사이클을 포함BER. 각 진공 사이클 동안, 표준 공장 절차는 20 inHg에 진공을 잡아 당기는 제안하고 1 inHg에 퍼지.- 내부 출입구의 문이 완전히 닫혀 있는지 확인합니다.
- 외부 출입구의 문을 엽니 다.
- 에어 록에 항목을 배치하고 외부 출입구의 문을 닫습니다. 액체를 도입하는 경우, 효율적인 가스 교환을 보장하기 위해 중간 캡을 풉니 다. 밀봉 포장 및 용기 전에주기를 시작으로 열 수 있습니다, 그래서 일을 자제는 워프와 손상 plasticware에 컨테이너 수 있습니다. 무균 유지를 위해 유일한 효율적인 가스 교환을 허용하도록 충분한 패키지를 연다.
- 시작 버튼을 누릅니다.
- 에어 록이 프로그램을 통해 순환하고 표시가 될 때까지 대기 "혐기성를."
- 내부 출입구의 문을 엽니 다.
- 챔버로 항목을 이동합니다.
- 내부 문을 닫습니다.
- 반 수동 모드
이 모드는 챔버 또는 축소 항목을 이동할 때 사용하고, 필요한 경우는 C 될 수있다챔버 내에 가스를 ycling하는 것은 필요합니다.- 내부 출입구의 문이 완전히 닫혀 있는지 확인합니다.
- 외부 출입구의 문을 엽니 다.
- 에어 록에 항목을 배치하고 외부 출입구의 문을 닫습니다. 액체를 도입하는 경우, 효율적인 가스 교환을 보장하기 위해 중간 캡을 풉니 다. 이러한 접종 루프와 96 - 웰 플레이트로 밀봉 된 패키지는, 이전에 사이클을 시작하기 열어야합니다.
- 메뉴를 누릅니다.
- 시작을 누릅니다. 에어 락은 각 버튼의 기능을 표시하고이 작업이 완료 될 때까지 응답하지 않습니다 :
- 위쪽 화살표 : 진공 펌프를 활성화합니다.
- 아래쪽 화살표 : 질소 (퍼지) 가스의 흐름을 시작합니다.
- 시작 가스 혼합 흐름을 시작합니다.
- 메뉴 : 기본 디스플레이로 돌아갑니다.
- 디스플레이가 20 inHg가 표시 될 때까지 키를 눌러 "업", 출입구에서 가스를 제거.
- 보도 자료 "아래,"디스플레이가 1보다 inHg 표시 될 때까지 질소 에어 록을 작성합니다. OV하지 마십시오ershoot,이 같은 무결성에 영향을 미칠 수있는, 에어 락에서 긍정적 인 압력을 작성합니다.
- 추가 퍼지 사이클을 수행하는 6 단계와 7 단계를 반복합니다.
- 표시 될 때까지 키를 눌러 "업"20 inHg를 읽습니다.
- 누르십시오 "시작", 가스 혼합과의 교류를 충전 디스플레이가 1보다 작 inHg가 표시 될 때까지.
- 내부 출입구의 문을 엽니 다.
- 챔버로 항목을 이동합니다.
- 내부 문을 닫습니다.
- 수동 모드
자동 또는 반 수동 모드가 작동하지 않거나 출입구에 전원이 없을 때마다이 모드를 사용할 수있다. 출입구가 켜져있을 때이 모드에서는 작동하지 않으며, 따라서, 기밀실 내의 압력을 결정하는 것은 곤란하다. 진공 당겨 가스 퍼지 시간은 진공 및 가스 유동 속도에 의존하고 있기 때문에, 각각 교환 내의 압력 게이지의 사용은 압력을 모니터링하고 상해 및 출입구에 대한 손상의 위험을 줄일 필요가있다.- 내부 출입구의 문이 완전히 닫혀 있는지 확인합니다.
- 외부 출입구의 문을 엽니 다.
- 에어 록으로 압력 게이지 등의 항목을, 배치하고 외부 출입구의 문을 닫습니다. 액체를 도입하는 경우, 효율적인 가스 교환을 보장하기 위해 중간 캡을 풉니 다. 이러한 접종 루프와 96 - 웰 플레이트로 밀봉 된 패키지는, 이전에 사이클을 시작하기 열어야합니다.
- 표시된 에어 록의 뒷면에있는 3 개의 스위치 찾습니다 "수동 제어 스위치를." 각각 다르게 표시되어 같은 :
- 진공
- 질소
- 가스 혼합
- 압력 게이지가 약 20 inHg가 표시 될 때까지 토글을 진공 스위치를 플립.
- 압력 게이지가 약 1 inHg가 표시 될 때까지 질소 토글 스위치를 플립.
- 압력 게이지가 약 20 inHg가 표시 될 때까지 토글을 진공 스위치를 플립.
- 압력 게이지가 약 1 inHg가 표시 될 때까지 질소 토글 스위치를 플립.
- 압력 게이지가 약 20 inHg가 표시 될 때까지 토글을 진공 스위치를 플립.
- 압력 게이지가 약 1 inHg가 표시 될 때까지 가스 혼합 토글 스위치를 플립.
- 내부 출입구의 문을 엽니 다.
- 챔버로 항목을 이동합니다.
- 내부 문을 닫습니다.
2. 배양, 열거 및 보관 C. 대변 샘플에서 어울리지
이 절차는 C.를 복구하기 위해 설계되었습니다 어울리지 배설물 샘플에서 포자를 포함하고 이후 글리세롤 주식으로 장기 저장에 식물 세포 또는 포자와 같은 고립 된 식민지를 유지한다. 대안 적으로,이 절차는 C.의 개수를 열거하는데 사용될 수있다 (예를 들어, 동물 연구에서) 대변 샘플에 어울리지 않는 존재. 선택적 차등 C.에 풍부하게 어울리지는, 타우로 콜산 - 폭시 틴-사이클로 세린 과당 한천 (TCCFA)는 정상 배설물 식물 15 ~ 16의 성장을 억제하는 데 사용됩니다. 폭시 틴이보다 광범위 C. 제외하고, 그람 음성 및 양성 세균 모두의 성장을 억제하면서 세린은 그람 음성 세균에 대한 정균이며 어울리지 대부분이 구균 균주를 입력합니다. 과당의 발효는 pH의 감소와 노란색에 레드 / 오렌지에서 연속적인 색상 변화가 발생하므로 산도 표시기, 중립 빨간색, 중간에 포함 할 수 있습니다. 효율적 C.의 포자를 복구하려면 어울리지는 식물 박테리아로, 담즙 염 나트륨 타우로 콜레이트는 발아 17 ~ 18을 유도하는 데 사용됩니다. 때문에 C. 디피는 C.의 효율을 증가시킬 수있는 오염 식물의 성장을 제한하는, 식물 세포를 감소 또는 제거하기 위해 사용될 수있다 포자, 알코올 또는 샘플의 열처리를 형성 어울리지 복구 19. 상술 한 바와 같이, 잔류 산소의 제거를 보장하기 위해 사용 전에 혐기 챔버에서의 적어도 1-2 시간 동안 모든 플레이트를 미리 줄이는 것이 중요하다. 공기 dryiNG 챔버 내에 사용하기 전에 플레이트를 응축을 감소시킬 수있다. 액체 매체는 볼륨과 사용 된 용기의 표면에 공기 비율에 따라 감소하기까지 24 시간이 필요할 수 있습니다.
시작하기 전에 다음과 같은 항목은 혐기성 챔버에 배치해야합니다 :
- 대변 샘플
- 멸균 면봉
- 멸균 접종 루프
- 1X PBS (자료 참조)
- TCCFA 판 (자료 참조)
- BHIS (뇌 심장 주입 효모 추출물 중간) 접시와 국물 (자료 참조)
- 50 % 글리세롤 (살균)
- 10 %의 L-시스테인 (살균)
- 극저온 저장 작은 유리 병
* 대안으로, 절연 콜로니를 -80 ℃에서의 장기 저장을 위해 15 % 글리세롤 BHIS 아가 플레이트 상에 확산하고,이어서 긁어 및 BHIS 액체 배지에 재현 탁 될 수있다 **은 그람 염색법은 C.를 식별하는 효과적인 전략이 아니라는 것을주의하는 것이 중요하다 대변 샘플 (23)로부터 직접 어울리지 C. 어울리지 먼저 의자에 존재하는 다른 식물에서 분리해야합니다.
- 1X PBS (이것은 호기성 조건에서 수행 될 수있다)의 대변 샘플을 재현 탁하고, 대변 샘플이 완전히 소용돌이로 교반하여 1X PBS에 재현 탁되어 있는지 확인합니다. 만약 C.를 열거 의자에서 어울리지는 이전 1X PBS를 추가로 대변 샘플을 단다.
- 대변 g 당 콜로니 형성 단위 (CFU)의 적절한 분리 또는 열거 1X PBS에 재 부유 대변 샘플의 시리얼 희석합니다.
- 무균 기술을 사용하여, TCCFA 판에 각 시리얼 희석 100 μl를 적용합니다.
- 멸균 접종 루프의 일련의 연속 격리 된 식민지 또는 균등 식민지의 열거에 대한 TCCFA 판의 표면에 도포 문화 확산을위한 적용 문화권을 사용하여.
- 37 ℃에서 48 시간 동안 혐기성 접시를 품어 그것은 C.를 감지하고 식별 할 수있다 24 시간 이내 어울리지 식민지에 기반식민지 (15)의 평면, 불규칙한, 지상 유리 외관,보다 정확한 식별 및 열거 형이 48 시간 후에 이루어집니다 있지만.
- 멸균 접종 루프를 사용하여, C.로 나타나는 식민지를 배양 0.03 %의 L-시스테인 (20) 보충 사전 감소 BHIS 한천 플레이트 상에 어울리지. 격리 된 식민지를 얻기 위해, 각 사분면에 대한 새로운 멸균 접종 루프를 사용, 사분면에있는 접시에 개별 식민지, 그리고 행진을 선택합니다. 대안 적으로, C. 카운트 각 희석액 디피 콜로니 (이 호기성 조건에서 수행 될 수있다), 및 대변 시료 g 당 콜로니 형성 단위의 수를 계산한다.
- C.에게 확인 그람 염색을 통해 어울리지 식별. 후 그람 염색, C. 어울리지 보라색 막대로 표시됩니다 일부 세포는 터미널 내생 포자를 포함 할 수 있습니다. 독소 B를 인코딩하는 유전자의 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)의 식별은 추가의 확인을 제공 할 수있다C.의 독소 균주 어울리지 21 multilocus 순서 입력 (MLST)를 식별 및 C의 알 수없는 및 nontoxigenic 균주의 정확한 입력을위한 성공하면서 22 어울리지.
- C.의 재고를 유지하려면 -80 ° C에서 어울리지는 멸균 접종 루프를 사용 BHIS 한천 플레이트에서 개인, 고립 된 식민지를 선택하고 액체 배지는 0.03 %의 L-시스테인 보충 사전 감소 BHIS 10 ㎖에 식민지를 재현 탁. *
- 하룻밤 혐기성 문화가 혼탁이되어 37 ° C에서, 또는 때까지 배양한다.
- 50 % 글리세롤의 333 μL와 C. 666 μl를 추가합니다 분리 균주의 15 % 글리세롤 주식을 만들 수있는 1.8 ml의 저온 관에 어울리지 문화.
- 단단히 극저온 튜브 캡, 잘 섞어 바로 장기 저장을 위해 -80 ° C의 냉동고에 혐기성 챔버와 장소에서 주식을 제거합니다.
3. C.를 배양 남과 어울리지 않는
이 절차는 C의 복구를 위해 제공 어울리지 -80 ° C.에 저장 글리세롤 주식에서 반복 된 동결 - 해동 사이클은 식물 세포를 죽일 수 있으므로, 항상 냉동 글리세롤 축적량을 유지하는 것이 중요하다. 우리는 드라이 아이스의 증발 챔버 내 환경을 변경할 수있는 챔버의 안팎으로 긴장을 전송하기위한 드라이 아이스의 사용을 권장하지 않습니다. 대신, 우리는 수송 도중 냉동 글리세롤 주식을 유지하기 위해 냉동 냉각 랙을 사용하는 것이 좋습니다. 다양한 선택적 및 차동 위해, 세 가지 미디어 일반적 C. 배양에 사용 남과 어울리지. TCCFA는, 전술 한 바와 같이, C의 선택이다 어울리지 나트륨 타우로 콜레이트를 포함, germinant. 효모 추출물 (BHIS)로 보충 뇌 심장 주입 유기체의 다양한 (도 2A) (24)의 성장을 허용하는 일반적으로 사용되는, 농축 비 선택적 매체이다. 자주, L-시스테인전자는 환원제 (20)로 BHIS에 추가됩니다. 마지막으로, 매체 (그림 2B)에 혈액의 추가 TCCFA에보다 효율적 포자 형성이 가능하며 C.에 의해 전시 된 고유 한 녹색 또는 연두색 형광 검출을 제공한다 남과 어울리지 장파 자외선 (UV) 빛 (15) (그림 2C)에서. C를 배양 할 때 포자 주식에서 어울리지는, 그 타우로 콜산 나트륨 발아을 보장하기 위해 중간에 추가해야 기억하는 것이 중요합니다.
시작하기 전에 다음과 같은 항목은 혐기성 챔버에 배치해야합니다 :
- 냉동 글리세롤 (랙 냉각에)
- 멸균 접종 루프
- TCCFA 또는 BHIS 판 (자료 참조)
- BHIS 국물은 (자료 참조)
- 50 % 글리세롤 (살균)
- 극저온 저장 작은 유리 병
- C.의 냉동 글리세롤 주식을 배치 -80 ° C 홍보에 저장되어있는 냉각 선반에 어울리지해동을 방지하기 위해 사용하는 IOR.
- 혐기성 챔버에 드라이 아이스에 냉동 글리세롤 주식을 가져와.
- 무균 기술 및 멸균 접종 루프를 사용하여 판의 사분면에 걸쳐 접시와 행진에 주식의 작은 금액을 놓습니다.
- 플레이트를 90 ° 회전하고, 새로운 멸균 접종 루프를 사용하여, 두 번째 사분면에 걸쳐 행진을 계속합니다.
- 개별 식민지의 분리를 보장하기 위해 세 번째와 네 번째 사분면에 대해 반복합니다.
- 즉시 혐기성 챔버에서 냉동 글리세롤 주식을 제거하고 -80 ° C.로 돌아
- 37 ℃에서 혐기성 하룻밤 접시를 품어 개별 격리 된 식민지 하룻밤 성장 후 관찰해야한다.
4. C.에서 정화 포자 남과 어울리지 않는
포자는 산소가 풍부한 환경에서 생존을 위해 질병 (8)의 효율적인 전송을 위해 필요한 경우에, 포자 주식의 준비 ofte입니다현미경과 동물 연구에 국한되지 다운 스트림 애플리케이션에 N 필요. 이 포자를 열거하는 카운트의 재현성을 보장하기 위해 반복을 필요로하는 것이 중요합니다. 포자는 물론 플라스틱을 준수하기 때문에 희석 사이에 피펫 아래로 여러 번하면 손실을 줄일 수 있습니다.
C.의 포자 형성 남과는 다른 sporogenic 종만큼 빠른 또는 균일하지 않습니다. , 포자 및 복구를 최적화하기 위해 포자 형성 매체 (SMC) 17,25 또는 70:30 매체 (26) 중 하나를 사용하는 것이 좋습니다. 성장의 72 시간 후 - (밀리리터 당 10 8 포자 10 7) 일반적으로 사용되는 다른 미디어를 효율적으로 포자는 27를 볼 수 있습니다 전에 성장의 4 ~ 5 일이 필요 BHIS, 및 Clospore, 포자의 높은 역가를 생산하는 액체 배지입니다. 다른 프로토콜 오히려 PBS 20 1x는보다 빙 냉수를 사용하지만, 등장 성 용액의 사용은 서로에 및 성형 표면에 붙지 포자를 감소시킬 수있다. 또한,일부 연구자들은 또한 완전히 식물 세포와 파편 29을 제거하는 자당 기울기를 사용하여 포자를 정화.
시작하기 전에 다음과 같은 항목은 혐기성 챔버에 배치해야합니다 :
- 멸균 접종 루프
- BHIS, SMC 및 / 또는 70:30 플레이트 (자료 참조)
- BHIS 국물은 (자료 참조)
- 1X PBS, 필터 살균 (자료 참조)
- 문화 사전 감소 BHIS 판에 냉동 글리세롤 주식에서 변종 및 37 ℃에서 하룻밤 혐기성 배양
- 여러 사전 감소 SMC 또는 70:30 판에 Restreak 24-48 시간 동안 37 ° C에서 혐기성 배양. 포자 형성은 위상차 현미경을 통해 이어 할 수있다. 포자 단계 밝은 동안의 식물과 어머니 세포 단계 어둡게 나타납니다 나타납니다. * 다른 방법으로, 포자 strai에 따라 밀리리터 당 10 5 -10 6 포자를 생성하는 24-48 시간 후 70:30 액체 매체에서 정제 할 수있다N 사용됩니다.
- 무균 접종 루프를 사용하여, 플레이트를 긁어 10 ㎖ 멸균 1X PBS에 세포를 재현 탁.
- 번호판을 취소하고 혐기성 챔버에서 포자 현탁액을 제거합니다. 15 분 동안 3,000 XG에서 세포 펠렛. 완전히 세포 펠렛 매번 재현 탁, 1X PBS로 두 번 세포를 씻어.
- 식물과 어머니 세포의 용해에 도움 4 ° C에서 하룻밤을 품어.
- 남아있는 식물 세포를 죽이는 20 분 동안 70 ° C에서 알을 품다.
- 밀리리터 당 단위 (CFU)를 형성 식민지를 확인하려면 직렬 + 0.1 % 나트륨 타우로 콜레이트 BHIS 각 포자 1X PBS의 준비와 플레이트를 희석. 식민지를 열거하기 전에 24 시간의 최소 번호판을 품어.
- 포자는 장기간 저장을 위해 실내 온도 4 ° C의 하나에 1X PBS에 저장할 수 있습니다. 4 ° C에 저장하면 효율적으로 발아를 복원하기 위해 15 분 동안 55 ° C에서 포자 준비를 재가열하는 데 유용 할 수 있습니다.
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Representative Results
C.의 예 BHIS 컬럼비아 혐기성 양의 혈액 한천 매체에 성장 어울리지는 그림 2에서 볼 수 있습니다. C. 어울리지는 평면이며 모두 미디어에 분명하다 지상 유리 외관을 가지고 불규칙한 식민지를 형성한다. 여기에, C.의 에리스로 마이신에 민감한 임상 분리 남과 어울리지 않는, 630E (30)는 37 ° C (그림 2A)에서 24 시간 동안, BHIS 한천, 농축, 비 선택 배지에서 재배된다. 컬럼비아 혐기성 양의 혈액 한천에 식민지 흰색 빛 (그림 2B)에서 BHIS에 성장 것과 유사하게 나타납니다하지만,이 매체의 사용은 C.에 의해 전시 된 녹색 또는 연두색 형광 검출을 제공한다 남과 어울리지 장파 자외선에서 (UV) 빛 (15) (그림 2C). C. TCCFA 한천에 어울리지 식민지 BHIS 한천의 성장과 유사. 때문에 TCCFA 매질, 포 두 항생제의 존재48 시간 성장의 E 기간은 식민지를 열거하기 전에 필요합니다.
그림 1. 수줍어 연구소 C 형 비닐 실 및 해당 구성 요소. (인치 × 32 사십이인치) 한 번에 하나의 개인에 대한 작업 공간을 제공합니다 (A) 수줍어 연구소 C 형 비닐 실. 그것은 순환 공기를 가열하고, STAK - 팩은 산소 오염을 줄이기 위해 필요한 팔라듐 촉매를 함유하는 보유 촉매 팬 상자 (확대 좌측 코너)를 포함한다. (B)는 에어 록 교환 역할 및 혐기성 환경에서 상당한 산소 오염을 방지하면서, 및 챔버로부터 재료의 전달을위한 메커니즘을 제공한다. 하나는 에어 록의 외측 및 번째의 내부에 제공되는 다른 액세스에 대한 액세스를 제공 : 에어 록은 두 문을 가지고 전자 혐기성 챔버. 에어 락은 프로그래밍이 가능하며 실에 항목에 대한 사용자 정의 사이클 수 있습니다. 그것은 자동 반자동 및 수동 모드에서 동작 할 수있다. (C)가 부속 유연한 라텍스 장갑은 운동의 전체 범위를 허용하고 챔버 내에 도달하는 제공됩니다. 장갑은 챔버의 혐기성 분위기를 방해하지 않고 장갑의 교체를 허용, 비닐 접착제로 비닐 소매에 부착 된 전문 팔목에 고정되어있다. 네오프렌 장갑도 사용할 수 있습니다. (D) 모델 가스 분석기 (10)는 연속적으로 산소 및 상기 챔버 내부의 분위기의 즉각적인 판독을 제공하는 수소 농도를 모두 감시한다. 이 장치는 수 누출이 발생하면 즉시 경보를 들어, 잘못된 가스 혼합 사용하거나 추가적인 문제가 경보 음과 번쩍이는 LED 빛을 통해 발생한다.
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그림 2. C.의 모양 다양한 미디어에 어울리지 식민지. 특징 평면, 불규칙한, 지상 유리 외관 C.의 에리스로 마이신에 민감한 임상 분리에 분명하다 남과 어울리지 않는, 630E (30), 24 시간 (A) 및 48 백색 빛 (B)에서 시간과 장파 자외선 (C)에 대한 컬럼비아 혐기성 양의 혈액 한천 BHIS 한천에 성장합니다.
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Discussion
여기에서 설명하는 방법은 C의 간단하고 신속하게 복구 할 수 인간, 마우스, 햄스터, C. 등의 장기 저장을 포함한 분변 시료의 다양한에서 디피 글리세롤 또는 포자 주식으로 어울리지. C. 어울리지 경작하기 어려운 유기체가 될 수 있지만주의 혐기성 환경의 유지 보수 및 무균 기술의 응용 프로그램은 강력한 성장과 오염의 감소를 제공 할 수 있습니다.
혐기성 챔버 : 고려 사항 및 유지 보수
단단한 챔버 또는 비닐 실 : 혐기성 챔버의 두 가지 유형이 있습니다. 초대형 챔버는 전형적 가성 화학 물질의 사용을 허용하는, 알루미늄 또는 경질 중합체 (예 : 플렉시 유리 또는 아크릴 재질)로 만든다. 엄밀한 챔버 gloveless 스타일로 변환 자국에 덜 경향이 될 수 있지만, 누수 감지하고 발견하기 어렵고 딱딱한 챔버는 몇 가지 방법이 필요사용중 가스 변위를 보상. 폴리머 단위는 종종 작동하는 더 많은 비용을 수있는 퍼지 전용 출입구를 갖추고 있습니다. 엄격한 대기 조건, 비용, 유연성, 실험실 공간 요구 사항 및 쉬운 유지 보수의 유지 보수를 위해, 비닐 혐기성 챔버 (코이 연구소 제품, 그림 1A)를 추천합니다. 이 혐기성 챔버는 관형 알루미늄 구조에 의해지지되고 라텍스 또는 네오프렌 장갑을 사용하여, (도 1b) 및 챔버로부터 재료의 이동을위한 교환로서 기능 출입구에 접속되어 비닐 글로브 박스로 구성된다 비닐 슬리브 (그림 1C)에 부착. 그것은 정확하게 혐기성 챔버의 적절한 셋업에 대한 제조 업체의 지침을 따르는 것이 중요합니다. 그것은 (챔버의 크기에 따라, 또는 그 이상) 팔라듐 촉매를 통해 공기 순환을 제공하는 히터 박스 단위 온도 제어 하나 일 수있다. 팔라듐 캘리포니아talyst을 물에 수소와 산소를 변환하여 교환을 통해 도입 된 산소의 오염을 감소시키는 역할을한다. 이상적으로, 모두 산소와 수소 농도는 백분율로 (PPM) 및 수소 농도 백만 당 부분에서 산소 농도를 표시하는, 가스 분석 (도 1D)를 사용하여 모니터링된다.
액체 및 고체 미디어를 사용하기 전에 혐기성 챔버에 미리 줄여야한다. 배양 접시 (직경 100mm)가 31을 사용하기 전에 2 시간 밖에 저감 할 수 있지만, 액체 매질 밤새 감소시켜야한다. 중요한 것은 미디어는 에어 록 대피하는 동안 액체 깜박임을 방지하기 위해 챔버로 전송하기 전에 냉각되어야한다. 예컨대 96 - 웰 플레이트 등의 성형 용 재료는, 플라스틱이 다공질이므로, 사용 전에 밤새 미리 감소되어야하고, 산소 분자 32을 저장할 수있다. 응용 프로그램에 따라 일부 플라스틱 사용을 33 전에 최대 48 시간 동안 사전에 줄일 수 있어야합니다. 방사성 폐기물은 ㄱ한다전자 적절하게 처리. 작은 생물 가방 챔버 내부에 유지 될 수 있지만, 자주 교체해야합니다.
이것은 C. 좋은 성장을 모두 보장하므로, 적어도 3 %의 수소 농도는 챔버 내부에서 유지되어야 어울리지 효율적인 산소 제거. 수소 농도가 3 % 이하로 떨어지면 또는 챔버 며칠 동안 사용하지 않은 경우는, 챔버 사이클은 바람직한 수준의 수소 농도를 복원하기 위해 실행되어야한다. 여기에서, 챔버 내의 가스의 약 3 분의 밖으로 진공 청소기 (비닐 상자가 크게 수축한다) 신선한 가스 혼합으로 대체됩니다. 에어 록이 시작하기 전에 혐기성 있는지 확인합니다. 챔버 내에 너무 많은 가스를 펌핑이 비닐 봉투에 불필요한 스트레스를 배치뿐만로 피해야한다, 또한 챔버의이면에 도달하는 사용자를 배제하는 것이다. 항상 환기가 잘되는 곳에서이 절차를 수행합니다. 추가 예방 조치를 취하면 차mber는 작은 환기가 실내에 보관됩니다. 챔버 내부의 가스 내용물 사용자 질식 수 방 어떤 문을 연다.
추가로 유지 챔버 내의 효율적인 산소 제거를 보장하기 위해 팔라듐 촉매의 재생을 포함한다. 산소와 수소가 촉매에 의해 감소되기 때문에, 물은 시간에 따른 자신의 효율을 감소 팔라듐 덮인 알루미늄 펠렛의 표면에 축적 할 수있다. 이 문제를 극복하기 위해, 팔라듐 촉매를 1 시간 동안 적어도 230 ° C의 베이킹에 의해 적어도 일주일에 한 번 재생해야합니다. 또한, 플레이트 및 매체에서 산소 환원과 물의 증발 모두의 결과로서, 물 축적은 혐기성 챔버 내에서 공통된 문제이다. 락 조작을 확인하고 챔버 내부의 장비의 반감기를 증가시키기 위해 건조제 팩이 사용될 수 있지만, 종종 팔라듐 촉매에 사용되는 동일한 조작으로 건조한다. 대안으로, 레드가습기는 물을 응축 물과 용기에 수집 된 금속 블록을 통해 공기를 순환하는 사용될 수있다. 이 장치는 물 용기의 오버 플로우를 방지하지만, 제습기 모니터링해야하고 완전에 가까운 때 용기를 비워야한다. 비닐 챔버를 청소하려면, 폴리 염화 비닐 (PVC)을 권장 부드러운 천 시중에서 청소기의 사용 (예 : 플라스틱 매직 클리너, 부품 명. 1,600,480, 수줍어 연구소) 권장합니다. 비닐 실을 긁거나 손상을 방지하기 위해, 종이 수건, 김 와이프 또는 케톤 또는 PVC가 손상 될 다른 화합물을 함유하는 제품을 사용하지 마십시오.
마지막으로, C. 어울리지는 매우 민감하고 부식성이 황화수소 (H 2 S)를 생성한다. 황화수소는 계측, 팔라듐 촉매 및 노출 된 금속에 손상을 입을 수 있습니다. 가능하면 chamb, 이러한 균질 및 분광 광도계로, 어떤 장비를 두지 마십시오ER 배 긴 기간 동안 황화수소에 기인 한 부식을 방지한다. 때문에 황화수소의 생산, 예컨대 팔라듐 촉매, 가스 분석기 등의 항목이 주기적 정규 챔버 정비의 일환으로 교체해야한다. 예컨대 황화수소를 흡수 또는 화학적으로 제거하는 활성탄, 아세트산 납,은 클로라이드 또는 황산은을 사용하는 것과 챔버 내의 황화수소 농도를 감소시키기위한 대안은, (34)를 설명 하였다 및 장비의 부식 속도를 느리게하기 위해 이용 될 수있다.
추가주의 사항
다른 문이 닫히고 산소 오염을 방지하기 위해 잠겨 있는지 확인하지 않고 에어 락에 하나의 문을 열지 마십시오. 또한, 비닐 천공의 위험을 줄이기 위해 챔버 내에서 샤프한 항목 사용을 피한다.
이것은 수소는 산소의 존재하에 가연성 가스 인 것을주의하는 것이 중요하다. 항목을 도입 할 때 아이를 돌볼챔버 NTO 산소 오염의 높은 수준 (이상 999 PPM)를 발생하지 않습니다. 그것은 새로운 가스 탱크를 사용하는, 특히, 전용 예비 혼합 불연성 무산소 혼합 가스를 사용하고 밀접 챔버 내에 가스 분석기를 모니터링하는 것이 중요하다. 4 % 이상 모두 수소와 산소 농도가 발생하는 경우, 기관의 표준 운영 절차 (SOP)에 설명해야 적절한 응급 절차를 따르지되어 있는지 확인합니다.
문제 해결 C. 남과 어울리지 성장
만약 C. 가난한 성장 어울리지 않는 문화가 다양한 매체에서 관찰되며,이 챔버 내에서 가장 자주 산소 오염에 의한 것입니다. 매체에 환원제 (예 : L-시스테인 또는 티오 글리콜 산)의 첨가는 성장을 향상시킬 수 있지만, 챔버 내의 산소 오염의 문제가 해결 될 필요가있을 것이다. 신속 가스 분석기를 사용하여 챔버 내의 산소와 수소 농도를 모니터링 할이러 진보와 생산성 감소를 지연하기 전에 문제에 사용자가 발생합니다. 산소 오염이 발생하면 신속하게 (수줍어 연구소에서 구입 가능) 가스 누출 탐지기와 소스를 식별하기가 좋습니다. 가스 누설 감지기가 탄화수소의 증가 수준뿐만 아니라 수소의 증가 수준을 식별 할 수 있기 때문에 누수의 위치를 찾을 수있는 기회를 높이기 위해 알코올에 적신 걸레는 챔버 내에 배치 될 수있다. 누수의 원인이 발견되면, 제조업체의 지침에 따라 접착제 나 실리콘을 사용하여 복구 할 수 있습니다.
유기체의 수는 쉽게 다른 일반적인 클로스 트리 디움 종 (예, 클로 스트 리듐 퍼프 린 젠스)와 통성 혐기성 미생물, 대장균 등 혐기성 환경에서 성장한다. 무균 기법 및 다른 전략은 오염의 위험을 줄일 수있다. 이러한 잠재적 인 F를 줄이기 위해 범위 내에서 항목을 배치로 챔버 내의 적절한 조직,또는 유출과 축적 된 생물 폐기물의 신속한 제거, 오염의 위험을 줄일 수 있습니다. 또한, 희석 표백제 용액으로 적신 종이 타월 주기적으로 표면과 라텍스 또는 네오프렌 장갑을 닦아 챔버로 주어질 수있다. 그것은 C를 죽이고, 이러한 분위기와 고체 및 액체 미디어를 침투 수있는 오랜 시간 동안 챔버 내부에 표백제 나 알코올 솔루션을 떠나지하는 것이 중요합니다 디피는,뿐만 아니라 비닐 (34)을 손상. 또한, 라텍스 또는 네오프렌 장갑의 정기적 인 교체는 오염의 위험을 줄일 수 있습니다. 위에서 언급 한 바와 같이, 만약 확실 유기체 C. 경우 디피 또는 오염물은 PCR을 이용하여 tdcB 유전자의 존재에 대한 검사를 신속 유기체 C. 여부를 결정할 수있다 21 어울리지. 같은 혐기성 챔버 내에서 여러 생물을 배양하는 경우 마지막으로, 그것은주의하는 것이 중요합니다 C. 어울리지는 (대사 부산물을 생성 할 수 있습니다 전자반대로 다른 혐기성 유기체의 성장을 억제한다. g. 황화수소).
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 친절하게 혐기성 챔버의 사진을 제공 수줍어 연구소에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 건강 보조금 DK087763 (SMM) 및 STEP / HHMI 교육 과정 개발 원정대 (ANE)의 국립 연구소에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Proteose Peptone no. 2 | BD | 212120 | |
| Na2HPO4 | Fisher | S373 | |
| KH2PO4 | Fisher | BP362 | |
| NaCl | Fisher | S27 | |
| MgSO4 (anhydrous) | Fisher | M65 | |
| á´…-Fructose | Fisher | L96 | |
| Sodium taurocholate | Sigma | T4009 | |
| á´…-cycloserine | Sigma | C6880 | |
| Cefoxitin | Fluka | C4786 | |
| Brain heart infusion medium | BD | 237300 | |
| Proteose Peptone | BD | 211684 | |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A5132 | |
| Tris base | Fisher | BP152 | |
| Agar | BD | 214010 | |
| L-cysteine | Sigma | C7755 | |
| BactoPeptone | BD | 211684 | |
| Columbian sheep blood agar | Fisher | L21928 | |
| NaCl | Fisher | S27 | |
| KCl | Fisher | P217 | |
| Glycerol | Fisher | BP2291 | |
| Sterile inoculating loops | Fisher | 22363596 | |
| Sterile swabs | Fisher | 1495990 | |
| Coy Vinyl Anaerobic Chamber and Accessories | Coy Laboratory Products, Inc | Customer Specified | These items are custom ordered per laboratory needs |
| Materials | |||
| TCCFA agar Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g Na2HPO4 5 g KH2PO4 1 g NaCl 2 g MgSO4 (anhydrous) 0.1 g Fructose 6 g Agar 20 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add: 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 0.1%) 25 ml of 10 mg/ml á´…-cycloserine, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 250 μg/ml) 1.6 ml of 10 mg/ml cefoxitin, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 16 μg/ml) BHIS Medium Brain heart infusion 37 g Yeast extract 5 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate (dissolve in water; final concentration, 0.1%) SMC Sporulation Medium BactoPeptone 90 g Protease peptone 5 g (NH4)2SO4 1 g Tris base 1.5 g Agar 15 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 70:30 Medium BactoPeptone 63 g Protease peptone 3.5 g Brain heart infusion 11.1 g Yeast extract 1.5 g (NH4)2SO4 0.7 g Tris base 1.06 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (final concentration, 0.03%). Blood agar The use of premade Columbia anaerobic sheep blood agar plates (Fisher Scientific, L21928)35 is recommended. 1X Phosphate buffered saline (PBS) NaCl 8.01 g KCl 0.2 g Na2HPO4 1.44 g KH2PO4 0.27 g Bring to 1 L with deionized water and adjust pH to 7.4 with HCl. Filter sterilize before use. |
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References
- Hall, I. C., O'Toole, E. Intestinal flora in new-borin infants - With a description of a new pathogenic anaerobe, Bacillus difficilis. Am. J. Dis. Child. 49, 390-402 (1935).
- Tedesco, F. J., Barton, R. W., Alpers, D. H. Clindamycin-Associated Colitis - Prospective Study. Ann. Intern. Med. 81, 429-433 (1974).
- Gerding, D. N. Clostridium difficile 30 years on: what has, or has not, changed and why. Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 2-8 (2009).
- Gerding, D. N., Muto, C. A., Owens, R. C. Treatment of Clostridium difficile infection. Clin. Infect. Dis. 46, Suppl 1. 32-42 (2008).
- Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin. Infect. Dis. 55, 88-92 (2012).
- Bouza, E. Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden. Clin. Microbiol. Infect. 18, 5-12 (2012).
- Peery, A. F., et al. Burden of gastrointestinal disease in the United States: 2012 update. Gastroenterology. 143, 1171-1173 (2012).
- Deakin, L. J., et al. The Clostridium difficile spo0A gene is a persistence and transmission factor. Infect. Immun. 80, 2704-2711 (2012).
- Drasar, B. S. Cultivation of anaerobic intestinal bacteria. J. Pathol. Bacteriol. 94, 417-427 (1967).
- Leach, P. A., Bullen, J. J., Grant, I. D. Anaerobic CO 2 cabinet for the cultivation of strict anerobes. Appl. Microbiol. 22, 824-827 (1971).
- Killgore, G. E., Starr, S. E., Del Bene,, Whaley, V. E., N, D., Dowell, V. R. Comparison of three anaerobic systems for the isolation of anaerobic bacteria from clinical specimens. Am. J. Clin. Pathol. 59, 552-559 (1973).
- Bacic, M. K., Smith, C. J. Laboratory maintenance and cultivation of bacteroides species. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 13, Unit 13C 11 (2008).
- Doan, N., Contreras, A., Flynn, J., Morrison, J., Slots, J. Proficiencies of three anaerobic culture systems for recovering periodontal pathogenic bacteria. J. Clin. Microbiol. 37, 171-174 (1999).
- Socransky, S., Macdonald, J. B., Sawyer, S. The cultivation of Treponema microdentium as surface colonies. Arch. Oral. Biol. 1, 171-172 (1959).
- George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 9, 214-219 (1979).
- Wilson, K. H., Silva, J., Fekety, F. R. Suppression of Clostridium difficile by normal hamster cecal flora and prevention of antibiotic-associated cecitis. Infect. Immun. 34, 626-628 (1981).
- Wilson, K. H., Kennedy, M. J., Fekety, F. R. Use of sodium taurocholate to enhance spore recovery on a medium selective for Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 15, 443-446 (1982).
- Bliss, D. Z., Johnson, S., Clabots, C. R., Savik, K., Gerding, D. N. Comparison of cycloserine-cefoxitin-fructose agar (CCFA) and taurocholate-CCFA for recovery of Clostridium difficile during surveillance of hospitalized patients. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 29, 1-4 (1997).
- Marler, L. M., et al. Comparison of five cultural procedures for isolation of Clostridium difficile from stools. J. Clin. Microbiol. 30, 514-516 (1992).
- Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 1 (2009).
- Bouillaut, L., McBride, S. M., Sorg, J. A. Genetic manipulation of Clostridium difficile. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 2 (2011).
- Lemee, L., Pons, J. L. Multilocus sequence typing for Clostridium difficile. Methods. Mol. Biol. 646, 77-90 (2010).
- Shanholtzer, C. J., Peterson, L. R., Olson, M. N., Gerding, D. N. Prospective study of gram-stained stool smears in diagnosis of Clostridium difficile colitis. J. Clin. Microbiol. 17, 906-908 (1983).
- Smith, C. J., Markowitz, S. M., Macrina, F. L. Transferable tetracycline resistance in Clostridium difficile. Antimicrob. Agents Chemother. 19, 997-1003 (1981).
- Permpoonpattana, P., et al. Surface layers of Clostridium difficile endospores. J. Bacteriol. 193, 6461-6470 (2011).
- Putnam, E. E., Nock, A. M., Lawley, T. D., Shen, A. SpoIVA and SipL are Clostridium difficile spore morphogenetic proteins. J. Bacteriol. , (2013).
- Burns, D. A., Minton, N. P. Sporulation studies in Clostridium difficile. J. Microbiol. Methods. 87, 133-138 (2011).
- Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile. J. AOAC Int. 94, 618-626 (2011).
- Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. Inhibiting the initiation of Clostridium difficile spore germination using analogs of chenodeoxycholic acid, a bile acid. J. Bacteriol. 192, 4983-4990 (2010).
- O'Connor, J. R., et al. Construction and analysis of chromosomal Clostridium difficile mutants. Mol. Microbiol. 61, 1335-1351 (2006).
- Buggy, B. P., Wilson, K. H., Fekety, R. Comparison of methods for recovery of Clostridium difficile from an environmental surface. J. Clin. Microbiol. 18, 348-352 (1983).
- Koch, C. J., Kruuv, J. The release of oxygen from polystyrene Petri dishes. Br. J. Radiol. 45, 787-788 (1972).
- Ethapa, T., et al. Multiple factors modulate biofilm formation by the anaerobic pathogen Clostridium difficile. J. Bacteriol. , (2012).
- Speers, A. M., Cologgi, D. L., Reguera, G. Anaerobic cell culture. Curr. Protoc. Microbiol. Appendix 4, Appendix 4F (2009).
- Lyras, D., et al. Toxin B is essential for virulence of Clostridium difficile. Nature. 458, 1176-1179 (2009).
