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Immunology and Infection

Cultivar e Manter Published: September 14, 2013 doi: 10.3791/50787
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Emory University School of Medicine

Summary

Clostridium difficile é uma bactéria patogênica que é um anaeróbio estrito e causa diarreia associada a antibióticos (DAA). Aqui, os métodos para o isolamento, a cultura e manter C. As células vegetativas difficile e esporos são descritos. Essas técnicas necessitam de uma câmara de anaerobiose, o que requer uma manutenção regular para garantir condições adequadas para melhor C. cultivo difficile.

Abstract

Clostridium difficile é um, anaeróbico, esporogênico bactéria Gram-positiva que é a principal responsável pela diarreia associada a antibióticos (DAA) e é um agente patogénico nosocomial significativa. C. difficile é notoriamente difícil de isolar e cultivar e é extremamente sensível ao mesmo níveis baixos de oxigênio no ambiente. Aqui, os métodos para isolar C. difficile em amostras de fezes e subsequentemente cultura C. difficile para a preparação de ações de glicerol para o armazenamento de longo prazo são apresentados. As técnicas para a preparação e enumerando estoques de esporos em laboratório para uma variedade de aplicações a jusante, incluindo estudos de microscopia e animais, também são descritos. Essas técnicas necessitam de uma câmara de anaerobiose, que mantém um ambiente anaeróbico consistente para assegurar condições adequadas para melhor C. crescimento difficile. Nós fornecemos protocolos para a transferência de materiais dentro e fora da câmara sem causando contaminação significativa de oxigênio, juntamente com sugestões para a manutenção regular necessária para sustentar o ambiente anaeróbico adequado para eficiente e consistente C. cultivo difficile.

Introduction

Clostridium difficile é uma bactéria formadora de esporos, Gram-positiva que é um anaeróbio obrigatório e um agente patogénico gastrointestinal potencialmente fatal dos seres humanos e animais. Inicialmente descrita em 1935 como um organismo comensal encontrada em amostras de fezes de recém-nascidos 1, C. difficile foi mais tarde demonstrado ser o agente causador de colite pseudomembranosa associada ao tratamento com antibióticos 2. C. infecções difficile (CDI) são tipicamente precedido por tratamento com antibióticos, que resulta na interrupção da flora do cólon normais, criando um nicho para C. difficile prosperar 2. C. difficile é transmitida como um esporo dormente através da via fecal-oral e, posteriormente, germina no interior do trato gastrintestinal, produzindo células vegetativas capazes de gerar diversas toxinas e causar doença grave e colite 3. CDI são muitas vezes refractária aos tratamentos convencionais e estes emperfeições são freqüentemente recorrentes 4. Como resultado, o CDI é responsável por até US $ 4,8 bilhões em custos de saúde nos Estados Unidos 5-7.

O C. difficile é muito sensível mesmo a baixos níveis de oxigénio no ambiente. Para C. difficile a persistir no meio ambiente e ser eficientemente transmitida de um hospedeiro para outro, a formação de um esporo metabolicamente inativas é fundamental 8. Porque a manutenção de laboratório e manipulação de C. difficile requer um ambiente anaeróbio controlada, estas técnicas requerem a utilização de uma câmara anaeróbica. O uso de câmaras anaeróbias resultou num aumento da recuperação e isolamento de anaeróbios obrigatórios 9-11, e permitiu que um número de técnicas de biologia molecular para ser realizado em uma atmosfera anaeróbia.

Além C. difficile, o uso da câmara anaeróbia e manutenção descritas aqui são aplicáveispara outros anaeróbios obrigatórios, como outras espécies Clostridium (por exemplo, C. perfringens), outras espécies gastrointestinais (por exemplo, espécies de Bacteroides 12) e patógenos periodontais (por exemplo, espécies Peptostreptococcos 13).

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Protocol

Nota: C. difficile é um agente patogénico humano ou animal, que pode causar a doença gastrointestinal. Experimentos envolvendo C. difficile deve ser realizada com medidas de biossegurança adequadas (BSL-2).

1. Anaerobic Câmara Uso e Manutenção

O C. difficile é um anaeróbio estrito e é extremamente sensível mesmo a baixas concentrações de oxigénio na atmosfera. Portanto, um ambiente anaeróbio controlada é necessária para a sua manipulação com sucesso. A utilização de uma câmara anaeróbica (Figura 1A) proporciona o ambiente mais estável e as condições ideais para a cultura eficaz de C. difficile e outras bactérias anaeróbicas 14. Aqui, numa atmosfera contendo uma mistura de gás (5% de CO 2, 10% de H 2, 85% N 2) pode ser mantida de forma estável.

Para apresentar todos os itens para a câmara sem contaminação significativa de oxigênio,uma câmara de vácuo devem ser usadas (Figura 1B). Este dispositivo funciona como um intercâmbio de gás e funciona automaticamente, semi-manual ou manualmente. A câmara de vácuo tem duas portas: uma que dá acesso ao lado de fora da câmara de compressão e o outro fornecendo acesso ao interior da câmara de anaerobiose. Dependendo do modelo, a câmara pode ter uma porta adicional, que pode oferecer acesso a uma câmara de anaerobiose adjacente, economizando assim o custo de uma câmara separada. A menos que os itens dentro ou fora da câmara movendo ativamente, ambas as portas devem permanecer fechadas em todos os momentos para evitar a contaminação de oxigênio. A câmara possui um botão liga / desliga na parte frontal e um painel contendo quatro botões. As linhas de gás e mangueira da bomba de vácuo está ligada na parte de trás da câmara de ar, próximo do painel, onde os interruptores para a operação manual completa da unidade estão localizados. Recomenda-se que dois ciclos de purga, a utilização de gás de azoto (N 2), são usados antes de encher o intercâmbio com mistura de gás (5% de CO 2, 10% de H 2, 85% N 2), para reduzir a quantidade de oxigénio introduzida no interior da câmara. Também é importante para não deixar qualquer porta aberta durante mais tempo do que o tempo total necessário para mover itens dentro e para fora do intercâmbio e planejar cuidadosamente experimentos para reduzir a freqüência de mover itens dentro e para fora da câmara. Os diferentes procedimentos operacionais para câmaras anaeróbias vinil são descritos abaixo. Antes de seguir estes protocolos, assegurar que estas sejam compatíveis com as instruções do fabricante fornecidas com a câmara.

  1. Modo Automático
    Este é um modo programável e personalizável e é realizada inteiramente pela câmara. Para programar a câmara, consulte as instruções do fabricante. Um programa recomendado para entrada típica para a câmara envolve dois ciclos de purga usando gás nitrogênio seguido de recarga a câmara com uma mistura de gases que se aproxima a atmosfera mantida dentro da chamber. Durante cada ciclo de vácuo, os procedimentos industriais padrão sugerem que puxa um vácuo de 20 Hg e purgar a 1 Hg.
    1. Certifique-se de que a porta da câmara interna é totalmente fechado.
    2. Abra a porta da câmara exterior.
    3. Coloque os itens em câmara e fechar a porta câmara exterior. Se a introdução de líquidos, retire as tampas no meio do caminho para garantir a troca gasosa eficiente. Embalagens e recipientes fechados deve ser aberto antes de começar o ciclo, abstendo-se de fazê-lo pode entortar e danos plasticware e containers. Para manter a esterilidade, abra os pacotes suficientes para permitir que apenas a troca gasosa eficiente.
    4. Pressione o botão Iniciar.
    5. Aguarde até que a câmara tem um ciclo através do programa eo visor apresenta "Anaeróbica".
    6. Abra a porta câmara interior.
    7. Mover itens para a câmara.
    8. Feche a porta interior.
  2. Modo Semi-manual
    Este modo pode ser usado quando se desloca itens dentro ou para fora da câmara, e é necessário, quando cycling o gás no interior da câmara é necessária.
    1. Certifique-se de que a porta da câmara interna é totalmente fechado.
    2. Abra a porta da câmara exterior.
    3. Coloque os itens em câmara e fechar a porta câmara exterior. Se a introdução de líquidos, retire as tampas no meio do caminho para garantir a troca gasosa eficiente. Pacotes fechados, tais como ansas de inoculação e as placas de 96 poços, tem de ser aberto antes de se iniciar o ciclo.
    4. Prima Menu.
    5. Press Start. A câmara irá mostrar a função de cada botão e não responderá até que isso seja concluído:
      • Seta para cima: ativa a bomba de vácuo.
      • Seta para baixo: inicia o nitrogênio (expurgo) fluxo de gás.
      • Início: inicia o fluxo de mistura de gás.
      • Menu: retornar à tela padrão.
    6. Pressione o botão "Up", a remoção de gás da câmara, até que seja exibido 20 inHg.
    7. Pressione o botão "Down", enchendo a câmara com nitrogênio, até que o display lê menos de 1 inHg. Não overshoot, pois isso irá criar uma pressão positiva dentro da câmara de vácuo, que pode afetar a sua integridade.
    8. Repita os passos 6 e 7 para executar um ciclo de purga adicional.
    9. Pressione o botão "Up" até que seja exibido 20 inHg.
    10. Pressione o botão "Iniciar", enchendo o intercâmbio com mistura de gás, até que o display lê menos de 1 inHg.
    11. Abra a porta câmara interior.
    12. Mover itens para a câmara.
    13. Feche a porta interior.
  3. Modo Manual
    Este modo pode ser usado sempre que os modos automáticos ou semi-manuais não estão funcionando ou não há energia para a câmara. Este modo não funcionar quando a câmara está em, portanto, é difícil de determinar a pressão no interior da câmara de vácuo. Porque o vácuo puxa e os tempos de purga de gás depende de taxas de vácuo e fluxo de gás, respectivamente, o uso de um medidor de pressão dentro do intercâmbio é necessário para controlar a pressão e reduzir o risco de danos pessoais e danos na câmara.
    1. Certifique-se de que a porta da câmara interna é totalmente fechado.
    2. Abra a porta da câmara exterior.
    3. Coloque itens, incluindo o medidor de pressão, em câmara de vácuo e feche a porta câmara exterior. Se a introdução de líquidos, retire as tampas no meio do caminho para garantir a troca gasosa eficiente. Pacotes fechados, tais como ansas de inoculação e as placas de 96 poços, tem de ser aberto antes de se iniciar o ciclo.
    4. Localize os três interruptores na parte de trás da câmara denominada "Chaves de Controle Manual". Estes são rotulados individualmente como:
      • Para Vácuo
      • Nitrogênio
      • Mix Gas
    5. Acione o interruptor para aspirar alternância até o medidor de pressão lê aproximadamente 20 inHg.
    6. Virar o interruptor de nitrogênio até que o manômetro lê aproximadamente 1 inHg.
    7. Acione o interruptor para aspirar alternância até o medidor de pressão lê aproximadamente 20 inHg.
    8. Virar o interruptor de nitrogênio até que o manômetro lê aproximadamente 1 inHg.
    9. Acione o interruptor para aspirar alternância até o medidor de pressão lê aproximadamente 20 inHg.
    10. Virar o interruptor Mix gás até que o medidor de pressão lê aproximadamente 1 inHg.
    11. Abra a porta câmara interior.
    12. Mover itens para a câmara.
    13. Feche a porta interior.

2. A cultura, enumerando e Armazenamento C. difficile a partir de amostras de fezes

Este procedimento destina-se a recuperar C. difficile a partir de amostras fecais contendo esporos e, posteriormente, manter colônias isoladas como as células vegetativas ou esporos em armazenamento a longo prazo como ações de glicerol. Em alternativa, este processo pode ser usado para enumerar o número de C. presente difficile em amostras de fezes (por exemplo, de estudos em animais). Para seletivamente e diferencialmente para enriquecer C. difficile, taurocolato-cefoxitina-frutose cicloserina-agar (TCCFA) é usado para inibir o crescimento da flora fecal normais 15-16. A cicloserina é bacteriostática para as bactérias Gram-negativas, enquanto cefoxitina inibe mais amplamente o crescimento de bactérias Gram-negativas e positivas, com a excepção de C. difficile e mais entrar cepas cocos. Um indicador de pH, de vermelho neutro, pode ser incluída no meio, como a fermentação de frutose resultarão numa diminuição do pH e uma subsequente mudança de cor do vermelho / laranja para amarelo. Para recuperar eficientemente esporos de C. difficile como bactérias vegetativas, o taurocolato de sódio sal de bile é utilizado para induzir a germinação 17-18. Porque C. difficile forma esporos, o álcool ou o tratamento térmico de amostras pode ser utilizada para reduzir ou eliminar as células vegetativas, limitar o crescimento de contaminantes flora, o que pode aumentar a eficiência de C. recuperação difficile 19. Como mencionado acima, é fundamental para a pré-reduzir todas as placas durante pelo menos 1-2 horas na câmara anaeróbica antes da utilização para assegurar a remoção do oxigénio residual. Secagem de arng as placas antes da utilização na câmara pode reduzir a condensação. O meio líquido pode necessitar de até 24 horas para reduzir dependendo do volume e da proporção superfície-de-ar do recipiente utilizado.

Antes de começar, os seguintes itens devem ser colocados na câmara anaeróbia:

  • Amostra de fezes
  • Compressas estéreis
  • Loops de inoculação estéril
  • 1x PBS (ver Materiais)
  • Placas TCCFA (veja Materiais)
  • BHIS (Brain Heart Infusion meio com extrato de levedura) placas e caldo (veja Materiais)
  • Glicerol a 50% (esterilizada)
  • 10% de L-cisteína (esterilizada)
  • Frascos de armazenamento criogênico

* Alternativamente, as colónias isoladas podem ser espalhadas em placas de agar BHIS, e subsequentemente raspadas e ressuspensas em meio líquido BHIS com glicerol a 15% para o armazenamento a longo prazo a -80 ° C. ** É importante notar que a coloração de Gram não é uma estratégia eficaz para identificar C. difficile diretamente de amostras de fezes 23 C. difficile deve primeiro ser isolado a partir de outros flora presente nas fezes.

  1. Ressuspender a amostra de fezes em 1x PBS (este pode ser realizado em condições aeróbicas), e assegurar que a amostra de fezes é totalmente ressuspenso em PBS 1x com vórtex. Se enumerar C. difficile das fezes, pesar a amostra de fezes antes da adição de PBS 1x.
  2. Faça diluições em série das amostras de fezes ressuspenso em 1x PBS para o isolamento ou enumeração apropriado de unidades formadoras de colônia (UFC) por grama de fezes.
  3. Utilizando uma técnica asséptica, aplicar 100 ml de cada diluição em série de placas TCCFA.
  4. Usando uma série de laços de inoculação estéril, raia da cultura aplicado para colónias isoladas ou espalhar uniformemente a cultura aplicado sobre a superfície da placa TCCFA por enumeração de colónias.
  5. Incubar a placa anaerobicamente durante 48 horas a 37 ° C. É possível detectar e identificar C. difficile colónias dentro de 24 horas com base nao irregular, aparência plana, em vidro fosco das colônias 15, apesar de identificação mais precisa e enumeração é alcançado após 48 horas.
  6. Usando loops de inoculação estéreis, subcultura quaisquer colônias que parecem ser C. difficile em pré-reduzidos placas de agar BHIS, suplementado com 0,03% de L-cisteína 20. Escolha uma colônia individual, e raia para a placa em quadrantes, utilizando um novo ciclo de inoculação estéril para cada quadrante, para obter colônias isoladas. Alternativamente, contar o C. difficile colónias de cada diluição (este pode ser realizado em condições aeróbicas), e calcular o número de unidades formadoras de colónias por grama de amostra de fezes.
  7. Confirme C. identificação difficile através coloração de Gram. Após a coloração de Gram, C. difficile aparecerá como hastes roxas e algumas células podem conter endospores terminais. Reacção em cadeia da polimerase (PCR), a identificação dos genes que codificam a toxina B pode proporcionar uma confirmação adicionalcepas toxigênicas de C. difficile 21 enquanto digitação seqüência multilocus (MLST) é bem-sucedida para a identificação e tipagem de cepas precisas desconhecidas e nontoxigenic de C. difficile 22.
  8. Para manter um estoque de C. difficile a -80 ° C, escolher um indivíduo, isolado de colónias da placa de agar BHIS usando uma ansa de inoculação estéril e ressuspender a colónia em 10 ml de BHIS pré-reduzidos meio líquido suplementado com 0,03% de L-cisteína. *
  9. Incubar durante a noite em condições anaeróbias a 37 ° C, ou até que a cultura se torna turva.
  10. Adicionar 333 ul de glicerol a 50% e 666 ul da C. difficile cultura para um tubo de 1,8 ml criogénico para criar um stock de glicerol de 15% da estirpe isolada.
  11. Tapar bem o tubo criogênico, misture bem e retire imediatamente as ações da câmara anaeróbia e coloque em um congelador -80 ° C para armazenamento de longo prazo.

3. Cultivar C. difficile

Este procedimento prevê recuperação de C. difficile de estoques de glicerol armazenada a -80 ° C. Porque os ciclos de congelamento e descongelamento repetidos podem matar as células vegetativas, é importante para manter os stocks de glicerol congelado em todos os momentos. Nós não recomendamos o uso de gelo seco para a transferência de tensões dentro e fora da câmara como a evaporação de gelo seco podem mudar o ambiente dentro da câmara. Em vez disso, recomendamos o uso de racks de refrigeração congelados para manter os estoques de glicerol congelados durante o transporte. Para várias finalidades selectivos e diferenciais, três meios são vulgarmente utilizados para a cultura de C. difficile. TCCFA, como discutido acima, é selectiva para C. difficile e contém taurocolato de sódio, um germinativo. Infusão de cérebro e coração suplementado com extracto de levedura (BHIS) é um, com meio de enriquecimento normalmente utilizados, não selectivo que permita o crescimento de uma grande variedade de organismos (Figura 2A) 24. Freqüentemente, L-cisteínae é adicionado à BHIS como um agente redutor 20. Finalmente, a adição de sangue para o meio (Figura 2B) permite a esporulação mais eficiente do que em TCCFA e fornece para a detecção da fluorescência esverdeada ou chartreuse única exibiu por C. difficile sob luz ultravioleta de onda longa (UV) 15 (Figura 2C). Quando cultura C. difficile de estoques de esporos, é importante lembrar que o taurocolato de sódio deve ser adicionado ao meio para assegurar a germinação.

Antes de começar, os seguintes itens devem ser colocados na câmara anaeróbia:

  • Estoque de glicerol congelado (em rack de arrefecimento)
  • Loops de inoculação estéril
  • Placas TCCFA ou BHIS (veja Materiais)
  • BHIS caldo (veja Materiais)
  • Glicerol a 50% (esterilizada)
  • Frascos de armazenamento criogênico
  1. Coloque o estoque de glicerol congelado de C. difficile num suporte de arrefecimento que foi armazenado a -80 ° C prior a usar para prevenir o descongelamento.
  2. Trazer o estoque de glicerol congelado em gelo seco na câmara anaeróbia.
  3. Utilizando uma técnica asséptica e uma ansa de inoculação estéril, colocar uma pequena quantidade do material sobre a placa e riscam um quadrante da placa.
  4. Gire a placa de 90 ° e, usando um novo loop inoculação estéril, continuar a raia em todo o segundo quadrante.
  5. Repetir para os terceiro e quarto quadrantes para assegurar o isolamento de colónias individuais.
  6. Imediatamente remover o stock de glicerol congelado da câmara anaeróbica e retornar para o -80 ° C.
  7. Incubar a placa durante a noite em condições anaeróbias a 37 ° C. Colônias individuais isolados devem ser observados após o crescimento durante a noite.

4. Purificando Esporos de C. difficile

Como esporulação é necessário para a sobrevivência em ambientes ricos em oxigênio e para a transmissão eficiente da doença 8, a preparação de ações de esporos é often necessário para aplicações a jusante, não se limitando a estudos de microscopia e animais. É importante notar que enumerando esporos requer repetição para assegurar a reprodutibilidade das contagens. Pipetando para cima e para baixo várias vezes, entre diluições também reduz a perda desde esporos aderem ao plástico também.

A esporulação de C. difficile não é tão rápida ou homogêneo como outras espécies esporogênico. Para otimizar a produção e recuperação de esporos, ou meio de esporulação (SMC) 17,25 ou 70:30 médio 26 é recomendado. Outros meios de comunicação utilizados são BHIS, que requer 4-5 dias de crescimento, antes de esporulação eficiente é visto 27, e Clospore, um meio líquido que produz títulos elevados de esporos (10 julho-10 agosto esporos por mililitro), após 72 horas de crescimento. Outros protocolos de usar água gelada em vez de 1x PBS 20, no entanto, o uso de uma solução isotónica pode reduzir os esporos se colem umas às outras e de plástico superfícies. Alternativamente,alguns investigadores purificar ainda mais os seus esporos, usando um gradiente de sacarose de remover completamente as células vegetativas e de detritos 29.

Antes de começar, os seguintes itens devem ser colocados na câmara anaeróbia:

  • Loops de inoculação estéril
  • BHIS, SMC e / ou 70:30 placas (veja Materiais)
  • BHIS caldo (veja Materiais)
  • 1x PBS, filtro esterilizado (veja Materiais)
  1. Cultura cepas do estoque de glicerol congelado em pré-reduzidos placas BHIS e incubar em condições anaeróbias durante a noite a 37 ° C.
  2. Restreak para vários pré-reduzida ou SMC 70:30 placas e incubar em condições anaeróbias a 37 ° C durante 24-48 horas. A formação de esporos pode ser seguido através de microscopia de contraste de fase. Esporos aparecerá fase vegetativa e brilhante, enquanto células-mãe aparecerá escuro fase. * Como uma alternativa, os esporos podem ser purificados a partir de 70:30 meio líquido, após 24-48 horas, o que produz 10 5 -10 6 esporos por mililitro, dependendo do strain usado.
  3. Utilizando uma ansa de inoculação estéril, raspar placas e ressuspender as células em 10 ml estéril 1x PBS.
  4. Descartar as placas e retirar a suspensão de esporos a partir da câmara de anaerobiose. Agregar as células a 3000 xg durante 15 minutos. Lave as células duas vezes em 1x PBS, ressuspender completamente o sedimento celular de cada vez.
  5. Incubar durante a noite a 4 ° C para ajudar na lise de células-mãe e vegetativo.
  6. Incubar a 70 ° C durante 20 minutos para matar quaisquer células vegetativas residuais.
  7. Para determinar unidades formadoras de colónias (CFU) por mililitro, em série diluir cada preparação de esporos em 1x PBS e placa BHIS + 0,1% de taurocolato de sódio. Incubar as placas durante um período mínimo de 24 horas antes de enumerar as colónias.
  8. Os esporos podem ser armazenados em 1x PBS a quer à temperatura ambiente ou a 4 ° C para armazenamento a longo prazo. Se for armazenada a 4 ° C, pode ser útil para reaquecer a preparação de esporos a 55 ° C durante 15 min para recuperar a germinação eficiente.

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Representative Results

Um exemplo de C. difficile cultivadas em BHIS e Columbia anaeróbio ovelhas meios de agar de sangue pode ser visto na Figura 2. C. difficile forma colônias irregulares que são planas e possuem uma aparência de vidro fosco que é evidente em ambos os meios. Aqui, um isolado clínico sensível à eritromicina de C. difficile, 630E 30, é cultivada em BHIS agar, num meio não-selectivo enriquecido, durante 24 horas a 37 ° C (Figura 2A). As colónias no ágar Columbia sangue de carneiro anaeróbio parecem semelhantes às cultivadas em BHIS sob luz branca (Figura 2B), no entanto, o uso deste meio também prevê a detecção da fluorescência esverdeada ou chartreuse exibiu por C. difficile sob luz ultravioleta de onda longa (UV) 15 (Figura 2C). C. difficile colônias em ágar TCCFA semelhante ao crescimento em agar BHIS. Por causa da presença de dois antibióticos no meio TCCFA, um timé necessário e período de 48 horas antes de enumerar crescimento colônias.

Figura 1
Figura 1. A câmara de Coy Laboratories Tipo C vinil e seus componentes. (A) A câmara de vinil Coy Laboratories Tipo C que fornece espaço de trabalho para um único indivíduo de uma vez (42 pol x 32 pol.) Ele contém uma caixa de fã catalisador (canto traseiro esquerdo), que circula e aquece o ar, e detém o Stak-Pak contendo o catalisador de paládio necessário para reduzir a contaminação de oxigênio. (B) A câmara de ar funciona como um intercâmbio e fornece um mecanismo para a transferência de materiais de dentro e para fora da câmara, evitando a contaminação significativa de oxigénio no ambiente anaeróbico. A câmara tem duas portas: uma que dá acesso ao lado de fora da câmara e outro acesso proporcionando ao interior do th e câmara de anaerobiose. A câmara é programável e permite ciclos personalizadas para a entrada na câmara. É operável em modos automáticos, semi-manual e manual. (C) anexada, luvas de látex flexíveis são fornecidos que permitem gama completa de movimento e chegar dentro da câmara. As luvas são fixadas a um manguito especializado ligado às luvas de vinil com adesivo de vinilo, que permite a substituição de luvas sem perturbar a atmosfera anaeróbia da câmara. Luvas de neoprene também estão disponíveis. (D) O Modelo 10 Gas Analyzer monitora continuamente oxigênio e níveis de hidrogênio proporcionando uma leitura instantânea da atmosfera dentro da câmara. Esta unidade permite alertas imediatos se ocorrer um vazamento, uma mistura de gás incorreto é usado ou problemas adicionais surgem através de alarmes sonoros e uma luz de LED piscando.

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Figura 2. O aparecimento de C. colônias difficile em vários meios de comunicação. A, irregular, aparência chão de vidro plano característica é evidente com um isolado clínico sensível à eritromicina de C. difficile, 630E 30, cultivada em agar BHIS durante 24 h (A) e Columbia anaeróbio de agar de sangue de ovelha durante 48 h sob uma luz branca (B) e luz ultravioleta de comprimento de onda (C).

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Discussion

Os métodos descritos aqui permitir a recuperação simples e rápida de C. difficile a partir de uma variedade de amostras fecais, incluindo seres humanos, ratos e hamsters, bem como o armazenamento a longo prazo de C. difficile como ações de glicerol ou de esporos. C. difficile pode ser um organismo difíceis de cultivar, mas a manutenção cuidadosa de um ambiente anaeróbico e a aplicação de técnicas de assepsia pode proporcionar para um crescimento robusto e uma redução na contaminação.

Câmaras anaeróbias: Considerações e manutenção

Existem dois tipos de câmaras anaeróbias: câmaras rígidos ou câmaras de vinil. Câmaras rígidas são normalmente feitas de alumínio ou de um polímero rígido (por exemplo, acrílico ou materiais acrílicos), permitindo a utilização de químicos cáusticos. Câmaras rígidas pode ser convertido para um estilo gloveless e são menos propensas a furos, no entanto, as fugas são difíceis de detectar e localizar e câmaras rígidas requerem algum método paracompensar o deslocamento de gás durante a sua utilização. As unidades de polímeros muitas vezes estão equipados com uma câmara só de purga, que pode custar mais para operar. Para a manutenção de condições rigorosas atmosféricas, custo, flexibilidade, os requisitos de espaço de laboratório e de fácil manutenção, câmaras anaeróbias vinil são recomendados (Coy Laboratory Products, Figura 1A). Esta câmara anaeróbia é composta por uma caixa de luvas de vinilo que é suportado por uma estrutura tubular de alumínio e está ligado a uma câmara, que funciona como um intercâmbio para a transferência de materiais de dentro e para fora da câmara (Figura 1B), usando látex ou neoprene ligado à manga de vinil (Figura 1C). É importante seguir precisamente as instruções do fabricante para a configuração adequada da câmara de anaerobiose. Ele pode ser com uma temperatura controlada (ou mais, dependendo do tamanho da câmara de) unidades de caixa de aquecedor que fornecem a circulação de ar através de um catalisador de paládio. O ca paládioTalyst serve para reduzir a contaminação de oxigênio introduzido através do intercâmbio através da conversão de hidrogênio e oxigênio em água. O ideal é que ambos os níveis de oxigênio e hidrogênio são monitorados através de um analisador de gases (Figura 1D), mostrando a concentração de oxigênio em partes por milhão (ppm) e concentração de hidrogênio como uma porcentagem.

Meios líquidos e sólidos devem ser pré-reduzida na câmara anaeróbica, antes da utilização. As placas de Petri (100 mm de diâmetro) podem ser reduzidos para apenas duas horas antes da utilização 31, no entanto, meios líquidos deve ser reduzida durante a noite. É importante ressaltar que a mídia deve ser resfriado antes da transferência para a câmara para evitar a piscar líquido durante a câmara de evacuação. Consumíveis de plástico, tais como placas de 96 poços, devem ser pré-reduzida durante a noite antes da utilização, como é de plástico poroso e pode armazenar as moléculas de oxigénio 32. Dependendo da aplicação, alguns plásticos devem ser pré-reduzidos para até 48 horas antes da utilização 33. Resíduos de risco biológico deve be disposta de forma apropriada. Um pequeno saco de risco biológico podem ser mantidos no interior da câmara, mas deve ser substituído com freqüência.

A concentração de hidrogênio de pelo menos 3% deve ser mantido dentro da câmara, pois isso irá garantir tanto o bem como o crescimento de C. remoção difficile e eficiente de oxigênio. Se a concentração de hidrogénio cair abaixo de 3% ou se a câmara não tem sido utilizado por vários dias, de um ciclo da câmara deve ser executado para restaurar a concentração de hidrogénio para níveis desejáveis. Aqui, aproximadamente um terço do gás na câmara é aspirado para fora (a caixa de vinilo irá esvaziar significativamente) e substituída com mistura de gás fresco. Certifique-se de que a câmara é anaeróbio antes de começar. Bombeamento muito gás para a câmara deve ser evitado, pois isso não só coloca pressão desnecessária sobre o saco de vinil, mas também impede o usuário de chegar na parte de trás da câmara. Sempre executar este procedimento em uma área bem ventilada. Tome precauções adicionais se o chamber é mantido em um quarto pequeno, com pouca ventilação. Abra as portas para o quarto como o conteúdo de gás no interior da câmara pode asfixiar o usuário.

Manutenção adicional inclui a regeneração do catalisador de paládio, para assegurar a remoção eficiente de oxigénio no interior da câmara. Como o oxigénio eo hidrogénio são reduzidos por o catalisador, a água pode acumular-se sobre a superfície dos grânulos de alumínio coberto por paládio, reduzindo a sua eficiência ao longo do tempo. Para superar isto, os catalisadores de paládio deverá ser regenerado, pelo menos uma vez por semana por cozedura, pelo menos 230 ° C durante uma hora. Além disso, como resultado de tanto de redução de oxigênio e evaporação da água a partir de chapas e meios de comunicação, o acúmulo de água é um problema comum dentro de câmaras anaeróbias. Para assegurar a manipulação confortável e aumentar a semi-vida do equipamento no interior da câmara, podem ser usados ​​pacotes de dessecante, mas devem ser frequentemente secas seguindo o mesmo procedimento usado para os catalisadores de paládio. Alternativamente, um deumidificador pode ser usado que faz circular o ar através de um bloco de metal que condensa a água e é coletado em um recipiente. O dispositivo impede transbordamento dos recipientes de água, no entanto, desumidificadores devem ser monitoradas e recipientes devem ser esvaziados quando quase cheio. Para limpar a câmara de vinil, o uso de um pano macio e qualquer produto de limpeza disponível comercialmente recomendada para cloreto de polivinila (PVC) é aconselhada (1.600.480 por exemplo Cleaner Mágico de plástico, parte não., Coy Laboratories). Para evitar riscar ou danificar a câmara de vinil, não use toalhas de papel, Kim-wipes ou produtos que contenham cetonas ou outros compostos que podem danificar PVC.

Finalmente, C. difficile produz gás sulfureto de hidrogénio (H2S), o que é extremamente reactivo e corrosivo. O sulfeto de hidrogênio pode ser prejudicial para a instrumentação, o catalisador de paládio e quaisquer metais expostas. Se possível, não deixe qualquer instrumentação, como homogeneizadores e espectrofotômetros, no chamber por longos períodos de tempo a fim de evitar a corrosão causada por sulfureto de hidrogénio. Devido à produção de sulfureto de hidrogénio, itens, tais como o analisador de catalisador de paládio e de gás terão de ser substituídos periodicamente como parte da manutenção normal da câmara. Alternativas para reduzir os níveis de sulfureto de hidrogénio no interior da câmara, tais como a utilização de carvão activado, acetato de chumbo, cloreto de prata ou sulfato de prata, para absorver ou quimicamente remover o sulfureto de hidrogénio, foram descritas 34 e pode ser utilizada para retardar a corrosão do equipamento.

Precauções adicionais

Nunca abra uma porta para a câmara sem garantir que a outra porta está fechada e trancada para evitar a contaminação de oxigênio. Além disso, evitar a utilização de artigos cortantes dentro da câmara para reduzir o risco de perfurar o vinil.

É importante notar que o hidrogénio é um gás inflamável, na presença de oxigénio. Tome cuidado quando a introdução de itens into da câmara que os altos níveis de contaminação de oxigênio não ocorrem (maior do que 999 ppm). É importante usar apenas pré-misturado mistura de gás não inflamável anaeróbio e acompanhar de perto o analisador de gases no interior da câmara, especialmente quando se utiliza um novo tanque de gás. Se ocorrer ambas as concentrações de hidrogênio e oxigênio acima de 4%, assegurar que os procedimentos de emergência adequados, que devem ser descritas em procedimentos operacionais padrão do laboratório (SOP), são seguidos.

Solução de problemas C. crescimento difficile

Se o pobre crescimento de C. culturas difficile é observada em meio rico, este é o mais frequentemente devido à contaminação de oxigênio dentro da câmara. A adição de um agente redutor (por exemplo, L-cisteína, ou o tioglicolato) para o meio pode melhorar o crescimento, no entanto, o problema de contaminação de oxigénio no interior da câmara que têm de ser tratadas. Monitorar os níveis de oxigênio e de hidrogênio no interior da câmara utilizando um analisador de gás pode rapidamente umlert ao usuário questões antes de um atraso no progresso e diminuição da produtividade ocorre. Se ocorrer a contaminação de oxigênio, rapidamente identificar a fonte com um detector de vazamento de gás (disponível a partir de Coy Laboratories) é aconselhada. Para aumentar a probabilidade de encontrar o local de uma fuga, um pano embebido em álcool pode ser colocado no interior da câmara uma vez que o detector de fugas de gás pode identificar um aumento dos níveis de hidrocarbonetos, bem como um aumento dos níveis de hidrogénio. Uma vez que a origem da fuga for encontrada, pode ser reparada usando cola ou silicone, seguindo as instruções do fabricante.

Um número de organismos facilmente crescer em ambientes anaeróbicos, incluindo outras espécies comuns clostridiais (por exemplo, Clostridium perfringens) e a bactéria anaeróbia facultativa, Escherichia coli. A técnica asséptica e outras estratégias podem reduzir o risco de contaminação. Organização adequada dentro da câmara, como a colocação de itens dentro do alcance para diminuir o potencial fou derrames e remoção imediata dos resíduos de risco biológico acumulado, pode reduzir os riscos de contaminação. Além disso, papel toalha umedecido com uma solução diluída de lixívia pode ser periodicamente levados para a câmara para limpar superfícies e as de látex ou neoprene luvas. É crítico para não deixar de branqueamento ou soluções de álcool no interior da câmara durante longos períodos de tempo como estes podem permear a atmosfera e os meios sólidos e líquidos, matando C. difficile, bem como danos no vinil 34. Além disso, a substituição regular das luvas de látex ou neoprene também podem reduzir o risco de contaminação. Como mencionado acima, se não tem certeza se um organismo é C. difficile ou um contaminante, um teste para a presença do gene tdcB utilizando PCR pode rapidamente determinar se o organismo é C. difficile 21. Finalmente, se cultivar vários organismos dentro da mesma câmara anaeróbia, é importante notar que a C. difficile pode produzir subprodutos metabólicos (eSulfureto. G. Hidrogénio) que inibem o crescimento de outros organismos anaeróbios e vice-versa.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer a Coy Laboratories por gentilmente fornecer imagens da câmara de anaerobiose. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health DK087763 concessão (SMM) e um Curriculum STEP / HHMI Desenvolvimento da Irmandade (ANE).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Proteose Peptone no. 2 BD 212120
Na2HPO4 Fisher S373
KH2PO4 Fisher BP362
NaCl Fisher S27
MgSO4 (anhydrous) Fisher M65
á´…-Fructose Fisher L96
Sodium taurocholate Sigma T4009
á´…-cycloserine Sigma C6880
Cefoxitin Fluka C4786
Brain heart infusion medium BD 237300
Proteose Peptone BD 211684
(NH4)2SO4 Sigma A5132
Tris base Fisher BP152
Agar BD 214010
L-cysteine Sigma C7755
BactoPeptone BD 211684
Columbian sheep blood agar Fisher L21928
NaCl Fisher S27
KCl Fisher P217
Glycerol Fisher BP2291
Sterile inoculating loops Fisher 22363596
Sterile swabs Fisher 1495990
Coy Vinyl Anaerobic Chamber and Accessories Coy Laboratory Products, Inc Customer Specified These items are custom ordered per laboratory needs
Materials
TCCFA agar

Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g
Na2HPO4 5 g
KH2PO4 1 g
NaCl 2 g
MgSO4 (anhydrous) 0.1 g
Fructose 6 g
Agar 20 g

Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize.

After autoclaving, add:
10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 0.1%)
25 ml of 10 mg/ml á´…-cycloserine, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 250 μg/ml)
1.6 ml of 10 mg/ml cefoxitin, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 16 μg/ml)

BHIS Medium

Brain heart infusion 37 g
Yeast extract 5 g

For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize.

Optional (add after autoclaving):

3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%)
10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate (dissolve in water; final concentration, 0.1%)

SMC Sporulation Medium

BactoPeptone 90 g
Protease peptone 5 g
(NH4)2SO4 1 g
Tris base 1.5 g
Agar 15 g

Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize.

Optional (add after autoclaving):
3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%)

70:30 Medium

BactoPeptone 63 g
Protease peptone 3.5 g
Brain heart infusion 11.1 g
Yeast extract 1.5 g
(NH4)2SO4 0.7 g
Tris base 1.06 g

For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (final concentration, 0.03%).

Blood agar

The use of premade Columbia anaerobic sheep blood agar plates (Fisher Scientific, L21928)35 is recommended.

1X Phosphate buffered saline (PBS)

NaCl 8.01 g
KCl 0.2 g
Na2HPO4 1.44 g
KH2PO4 0.27 g

Bring to 1 L with deionized water and adjust pH to 7.4 with HCl. Filter sterilize before use.

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Cultivar e Manter<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Em um ambiente anaeróbico
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Edwards, A. N., Suárez, J. M., McBride, S. M. Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment. J. Vis. Exp. (79), e50787, doi:10.3791/50787 (2013).

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