Summary
Clostridium difficile er en patogen bakterie, der er en streng anaerob og forårsager antibiotika associeret diarré (AAD). Her, fremgangsmåder til isolering, dyrkning og vedligeholdelse C. difficile vegetative celler og sporer er beskrevet. Disse teknikker kræver en anaerob kammer, der kræver regelmæssig vedligeholdelse for at sikre ordentlige forhold for optimal C. difficile dyrkning.
Abstract
Clostridium difficile er en Gram-positiv, anaerob, sporogenic bakterie, der er hovedansvarlig for antibiotika associeret diaré (AAD) og er en betydelig nosokomiel patogen. C. difficile er notorisk vanskeligt at isolere og dyrke og er yderst følsom over for selv lave niveauer af ilt i miljøet. Her metoder til isolering C. difficile fra fækale prøver og efterfølgende dyrkning af C. difficile til forberedelse af glycerolstamopløsninger til langtidsopbevaring præsenteres. Teknikker til at forberede og optælle Spore lagre i laboratoriet til en række downstream-applikationer, herunder mikroskopi og dyreforsøg er også beskrevet. Disse teknikker kræver en anaerob kammer, som opretholder en konsekvent anaerobt miljø for at sikre ordentlige forhold for optimal C. difficile vækst. Vi giver protokoller til overførsel af materialer ind og ud af kammeret uden CAhjælp betydelig forurening ilt sammen med forslag til regelmæssig vedligeholdelse kræves for at opretholde den rette anaerobt miljø for effektiv og konsekvent C. difficile dyrkning.
Introduction
Clostridium difficile er en Gram-positiv, sporedannende bakterie, der er en obligat anaerob og en potentielt fatal gastrointestinal patogen for mennesker og dyr. Oprindeligt beskrevet i 1935 som en kommensal organisme findes i fækale prøver fra nyfødte 1 C. difficile blev senere påvist at være det agens af pseudomembranøs colitis forbundet med antibiotisk behandling 2. C. difficile infektioner (CDI) er kendetegnet typisk ved antibiotisk behandling, der resulterer i forstyrrelse af normale colonflora, at skabe en niche for C. difficile at trives 2. C. difficile sendes som en hvilende spore via fækal-orale vej og derefter spirer i mave-tarmkanalen, der producerer vegetative celler i stand til at generere flere toksiner og forårsage alvorlig sygdom og colitis 3. CDI er ofte resistente over for konventionelle behandlinger, og disse iinfektioner er ofte gentaget 4. Som et resultat, CDI er ansvarlige for op til 4,8 milliarder dollar i udgifterne til sundhedsvæsenet i USA 5-7.
C. difficile er meget følsomt over for selv lave niveauer af oxygen i miljøet. For C. difficile at forblive i miljøet og effektivt overføres fra vært til vært, dannelsen af en metabolisk inaktive spore er kritisk 8. Fordi laboratoriet vedligeholdelse og manipulation af C. difficile kræver en kontrolleret anaerobt miljø, disse teknikker kræver anvendelse af et anaerobt kammer. Brug af anaerobe kamre har resulteret i øget nyttiggørelse og isolering af obligate anaerober 9-11, og har givet en række molekylære teknikker, der skal udføres i en anaerob atmosfære.
Ud over C. difficile, den anaerobe kammer brug og vedligeholdelse beskrevet her gældertil andre obligate anaerobe såsom andre Clostridium arter (f.eks C. perfringens), andre gastrointestinale arter (f.eks Bacteroides arter 12) og parodontale patogener (f.eks Peptostreptococcus arter 13).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: C. difficile er en menneskers og dyrs patogen, der kan forårsage mave-tarmsygdom. Forsøg med C. difficile skal udføres med passende forholdsregler vedrørende biosikkerheden (BSL-2).
1.. Anaerob Chamber Brug og vedligeholdelse
C. difficile er en streng anaerob og er yderst følsom over for selv lave koncentrationer af ilt i atmosfæren. Derfor er der behov for en kontrolleret, anaerobt miljø for dens vellykkede manipulation. Brugen af en anaerob kammer (figur 1A) giver den mest stabile miljø og de ideelle betingelser for en effektiv dyrkning af C. difficile og andre anaerobe bakterier 14. Her kan en atmosfære indeholdende en gasblanding (5% CO2, 10% H2, 85% N2) opretholdes stabilt.
At introducere nogen produkter ind i kammeret uden væsentlig forurening ilt,en luftsluse skal anvendes (figur 1B). Denne enhed fungerer som en gas udveksling og fungerer automatisk, semi-manuelt eller manuelt. Luftslusen har to døre: en, der giver adgang til ydersiden af luftslusen og det andet giver adgang til det indre af den anaerobe kammer. Afhængigt af modellen kan luftslusen have en ekstra dør, som kan tilbyde adgang til et tilstødende anaerob kammer, og dermed spare udgifterne til en særskilt luftsluse. Medmindre aktivt bevægelige elementer i eller ud af kammeret, bør begge døre holdes lukket på alle tidspunkter for at undgå forurening ilt. Luftslusen har en tænd / sluk-knap på forsiden og et panel med fire knapper. Det anbefales, gasledninger og vakuumpumpe slange er forbundet i den bageste del af luftslusen, nær panel, hvor kontakterne for fuld manuel betjening af apparatet er placeret. At to gennemblæsningscyklusser, anvendelse af nitrogengas (N2) anvendes inden påfyldning udveksling med gasblanding (5% CO 2, 10% H2, 85% N2) for at reducere mængden af oxygen indføres i kammeret. Det er også vigtigt at aldrig forlade enten døren åben i længere tid end den mængde tid, der kræves til at flytte emner ind og ud af udveksling og omhyggeligt planlægge eksperimenter at reducere hyppigheden af omsættelige varer ind og ud af kammeret. De forskellige operationelle procedurer for vinyl anaerobe kamre er skitseret nedenfor. Før du følger disse protokoller, sikre, at disse er forenelige med fabrikantens anvisninger, der følger med kammeret.
- Automatisk tilstand
Dette er en programmerbar og kan tilpasses tilstand og er udelukkende udføres af luftslusen. For at programmere luftslusen, henvises til producentens anvisninger. En anbefalet program for typiske indrejse i kammeret involverer to gennemblæsningscyklusser anvender nitrogengas efterfulgt af genpåfyldning luftslusen med en gas-mix, der nøje svarer til atmosfæren holdes inden for chamber. Under hver vakuum cyklus, foreslår de standard fabriksbygninger procedurer trækker et vakuum til 20 Hg og udrensning til 1. Hg.- Sørg for, at den indvendige luftsluse døren er helt lukket.
- Åbn ydre luftsluse døren.
- Placer elementer i luftslusen og luk ydre luftsluse døren. Hvis indføre væsker, skru lågene halvvejs at sikre en effektiv udveksling af gas. Forseglede pakker og beholdere bør åbnes forud for starten af cyklussen; afstå fra at gøre det, kan slå sig og skader plastvarer og containere. For at opretholde sterilitet, åbne pakker nok til kun at tillade en effektiv udveksling af gas.
- Tryk på knappen Start.
- Vent til luftslusen har cyklet gennem programmet, og displayet viser "Anaerob".
- Åbne indre luftsluse døren.
- Flytte elementer ind i kammeret.
- Luk indvendig dør.
- Semi-manuel mode
Denne tilstand kan bruges, når du flytter elementer i eller ud af kammeret og er nødvendig, når cycling gassen inden i kammeret er påkrævet.- Sørg for, at den indvendige luftsluse døren er helt lukket.
- Åbn ydre luftsluse døren.
- Placer elementer i luftslusen og luk ydre luftsluse døren. Hvis indføre væsker, skru lågene halvvejs at sikre en effektiv udveksling af gas. Forseglede pakker, såsom inokulering loops og 96 brønde, skal åbnes, før der begynder cyklussen.
- Tryk på Menu.
- Tryk på Start. Luftslusen vil vise funktionen af hver knap og vil ikke reagere, før denne er afsluttet:
- Pil op: aktiverer vakuumpumpen.
- Pil ned: initierer kvælstof (udrensning) gas flow.
- Start: initierer gasblanding flow.
- Menu: vende tilbage til standard-displayet.
- Tryk på "Up", fjernelse af gas fra luftsluse, indtil displayet viser 20 Hg.
- Tryk på "Ned", fylde luftslusen med nitrogen, indtil displayet viser mindre end 1 Hg. Må ikke overshoot, da dette vil skabe overtryk i luftsluse, hvilket kan påvirke dets integritet.
- Gentag trin 6 og 7 for at udføre en supplerende gennemblæsningscyklus.
- Tryk på "Up" indtil displayet viser 20 Hg.
- Tryk på "Start", fylde udveksling med gas mix, indtil displayet viser mindre end 1 Hg.
- Åbne indre luftsluse døren.
- Flytte elementer ind i kammeret.
- Luk indvendig dør.
- Manuel tilstand
Denne tilstand kan anvendes, når de automatiske eller semi-manuelle indstillinger ikke fungerer, eller der er ingen strøm til luftslusen. Denne tilstand fungerer ikke, når luftslusen er på, og derfor er det vanskeligt at bestemme trykket i luftslusen. Fordi vakuum trække og gasudluftning tider er afhængig af vakuum-og gasstrømningshastigheder henholdsvis, er brugen af en trykmåler i udveksling kræves for at overvåge trykket og reducere risikoen for personskade og beskadigelse af luftslusen.- Sørg for, at den indvendige luftsluse døren er helt lukket.
- Åbn ydre luftsluse døren.
- Placer poster, herunder manometeret, i luftslusen og lukke ydre luftsluse døren. Hvis indføre væsker, skru lågene halvvejs at sikre en effektiv udveksling af gas. Forseglede pakker, såsom inokulering loops og 96 brønde, skal åbnes, før der begynder cyklussen.
- Find de tre kontakter på bagsiden af luftslusen mærket "Manuelle Kommando." Disse individuelt mærket som:
- At støvsuge
- Nitrogen
- Gas Mix
- Vend at støvsuge vippekontakt indtil manometeret læser cirka 20 Hg.
- Vend Nitrogen vippekontakt indtil manometeret læser cirka 1 Hg.
- Vend at støvsuge vippekontakt indtil manometeret læser cirka 20 Hg.
- Vend Nitrogen vippekontakt indtil manometeret læser cirka 1 Hg.
- Vend at støvsuge vippekontakt indtil manometeret læser cirka 20 Hg.
- Vend Gas Mix vippekontakt indtil manometeret læser cirka 1 Hg.
- Åbne indre luftsluse døren.
- Flytte elementer ind i kammeret.
- Luk indvendig dør.
2. Dyrkning, og der opremses og lagring C. difficile fra afføringsprøver
Denne procedure er designet til at genvinde C. difficile fra fækale prøver, der indeholder sporer og efterfølgende fastholde isolerede kolonier som vegetative celler eller sporer i langtidsopbevaring som glycerolstamopløsninger. Alternativt kan denne fremgangsmåde anvendes til at optælle antallet af C. difficile stede i afføringsprøver (fx fra dyreforsøg). For selektivt og differentielt berige for C. difficile er taurocholat-cefoxitin-cycloserin-fructose agar (TCCFA) anvendes til at hæmme væksten af normale fecal flora 15-16. Cycloserin er bakteriostatisk for Gram-negative bakterier, mens cefoxitin mere bredt inhiberer vækst af både Gram-negative og-positive bakterier, med undtagelse af C. difficile og mest træder cocci stammer. Et pH-indikator, neutral rød, kan inkluderes i mediet, som fermentering af fructose vil resultere i et fald i pH og en efterfølgende farveændring fra rød / orange til gul. Til effektivt at gendanne sporer af C. difficile som vegetative bakterier, er galdesaltet natriumtaurocholat anvendes til at inducere spiring 17-18. Fordi C. difficile danner sporer, alkohol eller varmebehandling af prøver kan anvendes til at reducere eller eliminere vegetative celler, der begrænser væksten af kontaminerende flora, hvilket kan øge effektiviteten af C. difficile opsving 19.. Som nævnt ovenfor, er det afgørende at pre-reducere alle pladerne i mindst 1-2 timer i det anaerobe kammer før brug for at sikre fjernelse af tilbageværende oxygen. Air drying pladerne før brug i kammeret kan reducere kondens. Flydende medium kan have brug for op til 24 timer for at reducere afhængigt af mængden og jord-til-luft-forholdet af beholderen anvendes.
Inden du begynder, skal følgende punkter placeres i den anaerobe kammer:
- Afføringsprøve
- Sterile vatpinde
- Sterile inokulering sløjfer
- 1x PBS (se Materialer)
- TCCFA plader (se Materialer)
- BHIS (Brain Heart Infusion medium med gærekstrakt) plader og bouillon (se Materialer)
- 50% glycerol (steriliseret)
- 10% L-cystein (steriliseret)
- Kryogen lagring hætteglas
* Alternativt kan isolerede kolonier spredes på BHIS agarplader og derefter skrabet og resuspenderet i BHIS flydende medium med 15% glycerol til langvarig opbevaring ved -80 ° C. ** Det er vigtigt at bemærke, at Gram-farvning er ikke en effektiv strategi til at identificere C. difficile direkte fra afføringsprøver 23 C. difficile skal først isoleres fra de øvrige flora, der findes i afføringen.
- Resuspender afføringsprøve i 1x PBS (dette kan udføres i aerobe betingelser), og sikre, at afføringsprøve er fuldt resuspenderes i 1x PBS ved hvirvelblanding. Hvis optælle C. difficile fra taburetten, vejer afføringsprøve før tilsætning af 1x PBS.
- Gør seriefortyndinger genopslæmmet afføringsprøve i 1x PBS passende isolering eller tælling af kolonidannende enheder (CFU) per gram afføring.
- Anvendelse af aseptisk teknik anvendes 100 pi af hver seriefortynding til TCCFA plader.
- Ved hjælp af en række sterile pode loops, streak den anvendte kultur for isolerede kolonier eller jævnt fordelt anvendte kultur på overfladen af TCCFA plade til tælling af kolonier.
- Inkubér pladen anaerobt i 48 timer ved 37 ° C. Det er muligt at detektere og identificere C. difficile kolonier inden for 24 timer baseret påden flade, uregelmæssige, slebet udseende kolonierne 15, selv om mere præcis identifikation og tælling opnås efter 48 timer.
- Brug sterile pode loops, videredyrke eventuelle kolonier, der synes at være C. difficile på pre-nedsatte BHIS agarplader suppleret med 0,03% L-cystein 20. Pick en individuel koloni, og streak på pladen i kvadranter ved hjælp af en ny steril pode loop for hver kvadrant, for at opnå isolerede kolonier. Alternativt tælle C. difficile kolonier af hver fortynding (dette kan udføres i aerobe betingelser), og beregne antallet af kolonidannende enheder pr gram afføringsprøve.
- Bekræft C. difficile identifikation via Gram-farvning. Efter Gram-farvning, C. difficile vises som lilla stænger og nogle celler kan indeholde terminal endosporer. Polymerasekædereaktion (PCR) identifikation af de gener, der koder for toksin B kan give yderligere bekræftelse aftoksigene stammer af C. difficile 21 mens multilocus sekvens typning (MLST) er en succes for identifikation og præcis indtastning af ukendte og ikke-toksigene stammer af C. difficile 22..
- For at opretholde en bestand af C. difficile ved -80 ° C, vælge en enkelt, isoleret koloni fra BHIS agarplade anvendelse af en steril inokulation løkke og resuspender koloni i 10 ml præ-reduceret BHIS flydende medium suppleret med 0,03% L-cystein. *
- Inkuber natten over anaerobt ved 37 ° C, eller indtil kulturen bliver uklar.
- Tilføj 333 pi af 50% glycerol og 666 ul af C. difficile kultur til en 1,8 ml kryogene rør for at skabe en glycerol lager 15% af den isolerede stamme.
- Stramt cap kryogene rør, bland godt og straks fjerne den bestand fra den anaerobe kammer og sted i en -80 ° C fryser i langtidsopbevaring.
3. Dyrkning C. difficile
Denne procedure giver mulighed for inddrivelse af C. difficile fra glycerolstamopløsninger opbevaret ved -80 ° C. Fordi gentagne fryse-tø-cykler kan dræbe vegetative celler, er det vigtigt at holde glycerolstamopløsninger frosne på alle tidspunkter. Vi anbefaler ikke brug af tøris til overførsel af stammer i og ud af kammeret, da fordampning af tøris kan ændre miljøet i kammeret. Vi anbefaler i stedet at bruge frosne køling stativer til at holde glycerolstamopløsninger frosset under transporten. Af forskellige selektive og differentierede årsager er tre medier almindeligt anvendt til dyrkning af C. difficile. TCCFA som diskuteret ovenfor, er selektiv for C. difficile og indeholder natriumtaurocholat, en germinant. Hjerne-hjerte-infusion suppleret med gærekstrakt (BHIS) er et almindeligt anvendt, beriget, ikke-selektivt medium, som giver mulighed for vækst af en bred vifte af organismer (figur 2A) 24. Ofte, L-cysteine føjes til BHIS som reduktionsmiddel 20. Endelig tilsætning af blod til mediet (figur 2B) giver mulighed for en mere effektiv sporulering end TCCFA og giver mulighed for påvisning af den unikke grønlige eller chartreuse fluorescens udvist af C. difficile under langbølget ultraviolet lys (UV) 15 (figur 2C). Når dyrkning C. difficile fra spore lagre, er det afgørende at huske, at natriumtaurocholat skal tilsættes til mediet for at sikre spiring.
Inden du begynder, skal følgende punkter placeres i den anaerobe kammer:
- Frosne glycerolstamopløsning (køling rack)
- Sterile inokulering sløjfer
- TCCFA eller BHIS plader (se Materialer)
- BHIS bouillon (se Materialer)
- 50% glycerol (steriliseret)
- Kryogen lagring hætteglas
- Placer den frosne glycerolstamopløsning C. difficile i en afkøling rack, der er blevet opbevaret ved -80 ° C prIOR at bruge til at forhindre optøning.
- Bring den frosne glycerolstamopløsning på tøris i den anaerobe kammer.
- Anvendelse af aseptisk teknik og en steril inokulation løkke, placere en lille mængde af den bestand på pladen og uden striber på tværs af en kvadrant af pladen.
- Drej pladen 90 ° og ved hjælp af en ny steril pode loop, fortsætte med at stribe på tværs af anden kvadrant.
- Gentag for tredje og fjerde kvadranter for at sikre isolering af enkelte kolonier.
- Fjern omgående frosset glycerol bestand fra det anaerobe kammer og vende tilbage til -80 ° C.
- Inkubér pladen anaerobt natten over ved 37 ° C. Individuelle isolerede kolonier skal observeres efter vækst natten.
4.. Rensende sporer fra C. difficile
Som det kræves sporulation for overlevelse i iltrige miljøer og effektiv overførsel af sygdomme 8, udarbejdelse af Spore bestande er oftenn er nødvendigt for downstream-applikationer, ikke begrænset til mikroskopi og dyr studier. Det er vigtigt at bemærke, at opremse sporer kræver gentagelse at sikre reproducerbarhed tæller. Pipettering op og ned adskillige gange mellem fortyndinger reducerer også tab, da sporer overholde plast godt.
Sporulering C. difficile er ikke så hurtig eller homogen som andre sporogenic arter. For at optimere spore produktion og nyttiggørelse enten sporulationsmedium (SMC) 17,25 eller 70:30 medium 26 anbefales. Andre medier hyppigst anvendte BHIS, hvilket kræver 4-5 dages vækst, før effektiv sporulation ses 27, og Clospore, en lage, der producerer høje titre af sporer (juli 10 - AUGUST 10 sporer per milliliter) efter 72 timers vækst. Andre protokoller anvender iskoldt vand snarere end 1x PBS 20, men kan brugen af en isotonisk opløsning reducere sporer klistrer til hinanden og plastoverflader. Alternativtnogle forskere yderligere rensning deres sporer ved hjælp af en saccharosegradient fuldt ud at fjerne vegetative celler og rester 29.
Inden du begynder, skal følgende punkter placeres i den anaerobe kammer:
- Sterile inokulering sløjfer
- BHIS, SMC og / eller 70:30 plader (se Materialer)
- BHIS bouillon (se Materialer)
- 1x PBS, filter-steriliseret (se Materialer)
- Kultur stammer fra frossen glycerolstamopløsning på præ-reducerede BHIS plader og inkuberes anaerobt natten over ved 37 ° C.
- Restreak på flere præ-reduceret SMC eller 70:30 plader og inkuberes anaerobt ved 37 ° C i 24-48 timer. Sporedannelse kan følges via fasekontrastmikroskopi. Sporer vises fase lyse mens vegetative og mor celler vises fase mørke. * Som et alternativ kan sporer oprenses fra 70:30 flydende medium efter 24-48 timer, hvilket giver 10 5 -10 6 sporer per milliliter, afhængigt af strain anvendes.
- Ved hjælp af en steril inokulere loop, skrabe-plader, og cellerne resuspenderes i 10 ml sterilt 1x PBS.
- Kassér pladerne og fjerne sporesuspension fra den anaerobe kammer. Pelletere cellerne ved 3.000 xg i 15 minutter. Vask cellerne to gange i 1x PBS, fuldt resuspendere cellepelleten hver gang.
- Der inkuberes natten over ved 4 ° C til støtte i lyse af vegetative og mor celler.
- Inkuber ved 70 ° C i 20 min for at dræbe eventuelle resterende vegetative celler.
- For at bestemme kolonidannende enheder (CFU) per milliliter, serielt fortyndes forberedelse spore i 1x PBS og plade på BHIS + 0,1% natriumtaurocholat. Pladerne inkuberes i mindst 24 timer før optælle kolonier.
- Sporer kan opbevares i 1x PBS ved enten stuetemperatur eller 4 ° C til langtidsopbevaring. Hvis opbevaret ved 4 ° C, kan det være nyttigt at genopvarme fremstillingen spore ved 55 ° C i 15 minutter for at genoprette en effektiv spiring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et eksempel på C. difficile dyrket på BHIS og Columbia anaerob fåreblod agar medier kan ses i figur 2. C. difficile danner uregelmæssige kolonier, der er flad og besidder en slebet udseende, der er tydeligt på begge medier. Her et erythromycin-følsomme klinisk isolat C. difficile, 630e 30, dyrkes på BHIS agar, en beriget, ikke-selektivt medium, i 24 timer ved 37 ° C (figur 2A). Kolonier på Columbia anaerob får blodagar ligne dem, der dyrkes på BHIS under hvidt lys (figur 2B), men brugen af dette medie giver også mulighed for påvisning af den grønlige eller chartreuse fluorescens udstillet af C. difficile under langbølget ultraviolet lys (UV) 15 (figur 2C). C. difficile kolonier på TCCFA agar ligner vækst på BHIS agar. På grund af tilstedeværelsen af to antibiotika i TCCFA medium, en time periode på 48 hr vækst er nødvendig, før opremse kolonier.
Figur 1. Den Coy Laboratories Type C vinyl kammer og dets komponenter. (A) A Coy Laboratories Type C vinyl kammer, der giver arbejdsområde for et enkelt individ på én gang (42 i. x 32 tommer). Den indeholder en katalysator fan boks (bageste venstre hjørne), der cirkulerer, og opvarmer luften, og holder Stak-Pak, der indeholder palladium katalysator kræves for at reducere eventuel forurening ilt. (B) Luftslusen tjener som en udveksling og giver en mekanisme til overførsel af materialer ind og ud af kammeret og samtidig forhindre betydelig forurening ilt i det anaerobe miljø. Luftslusen har to døre: én, der giver adgang til ydersiden af luftslusen og det andet giver adgang til det indre af th e anaerobe kammer. Luftslusen er programmerbar og giver mulighed for tilpassede cykler til indrejse i kammeret. Den kan betjenes i automatiske, semi-manuelle og manuelle indstillinger. (C) Attached, fleksible latexhandsker leveres som giver fuld vifte af bevægelse og nå i kammeret. Handskerne er fastgjort til en specialiseret manchet fastgjort til vinyl ærmer med vinyl klæbemiddel, tillader udskiftning af handskerne uden at forstyrre den anaerobe atmosfære i kammeret. Neopren er også tilgængelige. (D) Model 10 Gas Analyzer overvåger løbende både ilt og brint niveauer giver en øjeblikkelig udlæsning af atmosfæren i kammeret. Denne enhed giver mulighed for umiddelbare advarsler, hvis der opstår en lækage, er en forkert gasblanding anvendes eller yderligere problemer opstår via hørbare alarmer og en blinkende LED-lys.
ig2.jpg "/>
Figur 2. Udseendet af C. difficile kolonier på forskellige medier. Den karakteristiske flade, uregelmæssige, slebet udseende er tydeligt med en erythromycin-følsomme klinisk isolat af C. difficile, 630e 30 dyrket på BHIS agar i 24 timer (A) og Columbia anaerob får blodagar i 48 timer under hvidt lys (B) og langbølget ultraviolet lys (C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De her beskrevne metoder giver mulighed for enkel og hurtig genopretning af C. difficile fra en række fækale prøver, herunder mennesker, mus og hamstere, samt langtidsopbevaring C. difficile glycerol eller spore bestande. C. difficile kan være en vanskelig organisme at dyrke, men omhyggelig vedligeholdelse af et anaerobt miljø og anvendelse af aseptiske teknikker kan give for robust vækst og en reduktion i forurening.
Anaerobe kamre: Overvejelser og vedligeholdelse
Der er to typer af anaerobe kamre: stive kamre eller vinyl kamre. Stive kamre er typisk fremstillet af aluminium eller en stiv polymer (f.eks plexiglas eller acrylmaterialer), der tillader brugen af ætsende kemikalier. Stive kamre kan konverteres til en gloveless stil og er mindre tilbøjelige til punkteringer, men er utætheder vanskelige at opdage og finde og stive kamre kræver nogle metode tilkompensere for gas forskydning under brug. Polymerenhederne ofte er udstyret med en udrensning kun luftsluse, hvilket kan koste mere at betjene. Til vedligeholdelse af strenge atmosfæriske forhold, omkostninger, fleksibilitet, laboratorie pladskrav og nem vedligeholdelse, er vinyl anaerobe kamre anbefales (Coy Laboratory Products, figur 1A). Denne anaerobe kammer består af en vinyl handskerum, der understøttes af en rørformet aluminium struktur og er forbundet til en luftsluse, som fungerer som en udveksling til overførsel af materialer ind og ud af kammeret (figur 1B) under anvendelse af latex-eller neopren-handsker knyttet til vinyl ærmer (jf. figur 1c). Det er vigtigt at præcist at følge producentens anvisninger for korrekt opsætning af den anaerobe kammer. Det kan være temperaturreguleret med en (eller flere, afhængigt af størrelsen af kammeret) varmelegeme box enheder, der leverer luftcirkulation gennem en palladiumkatalysator. Palladium catalyst tjener til at reducere ilt forurening indført gennem udveksling ved at konvertere brint og ilt i vandet. Ideelt set er begge ilt og brint niveauer overvåges ved hjælp af en gas analysator (figur 1D), viser iltkoncentrationen i dele per million (ppm) og brint koncentration som en procentdel.
Flydende og faste medier skal være præ-reducerede i det anaerobe kammer før brug. Petriskåle (100 mm i diameter) kan reduceres til kun to timer før brug 31, men bør flydende medier reduceres natten over. Vigtigere er det, bør afkøles medier før overførsel ind i kammeret for at forhindre væske blinke under luftsluse evakuering. Plastic hjælpematerialer, såsom plader med 96 brønde, skal være præ-reducerede natten inden brug, da plast er porøs og kan gemme oxygenmolekyler 32. Afhængigt af programmet, nogle plast må være præ-reduceret i op til 48 timer før brug 33.. Biohazard affald skal be bortskaffes på passende vis. En lille biohazard taske kan holdes inde i kammeret, men bør udskiftes hyppigt.
En brint koncentration på mindst 3% skal opretholdes inde i kammeret, da dette vil sikre både god vækst af C. difficile og effektiv ilt fjernelse. Hvis koncentrationen hydrogen falder til under 3%, eller hvis kammeret ikke har været brugt i flere dage, bør et kammer cyklus udføres for at genoprette hydrogenkoncentrationen til ønskelige niveauer. Her er cirka en tredjedel af gassen i kammeret støvsuges ud (vinyl boks vil punktere betydeligt) og erstattet med frisk gas mix. Sørg for, at luftslusen er anaerob, før du begynder. Pumping for meget gas ind i kammeret, bør undgås, da dette ikke kun lægger unødig stress på vinyl taske, men vil også til hinder for, at brugeren i at nå ind i bagsiden af kammeret. Altid udføre denne procedure i et godt ventileret område. Tag ekstra forholdsregler, hvis chamber er holdt i en lille, dårligt ventileret rum. Åbne nogen døre til rum som gas indholdet inde i kammeret kan blive kvalt brugeren.
Ekstra vedligeholdelse omfatter regenerering af palladiumkatalysatoren at sikre en effektiv fjernelse ilt i kammeret. Som ilt og brint reduceres med katalysatoren kan vand samle sig på overfladen af palladium-dækket aluminium pellets reducerer deres effektivitet over tid. For at overvinde dette, bør palladiumkatalysatorer regenereres mindst en gang om ugen ved bagning ved mindst 230 ° C i en time. Derudover, som et resultat af både reduktion ilt og fordampning af vand fra plader og medier, ophobning vand er et fælles problem i anaerobe kamre. For at sikre en komfortabel manipulation og øge halveringstiden af udstyret i kammeret, kan dehydrerende packs bruges, men skal tørres ud ofte efter den samme procedure, der anvendes til palladiumkatalysatorer. Alternativt en deBefugteren kan anvendes som cirkulerer luft gennem en metalblok, der kondenserer vand og opsamles i en beholder. Enheden forhindrer overløb af vandbeholdere, men skal affugtere overvåges og beholdere skal tømmes, når tæt på fuld. For at rense vinyl kammer, er brugen af en blød klud og et andet kommercielt rengøringsmiddel anbefales til PVC (polyvinylchlorid) tilrådes (f.eks Plastic Magic Cleaner, del-nr. 1.600.480, Coy Laboratories). For at undgå at ridse eller beskadige vinyl kammer, skal du ikke bruge papirservietter, Kim-klude eller produkter indeholdende ketoner eller andre forbindelser, der vil skade PVC.
Endelig C. difficile producerer hydrogensulfidgas (H2S), som er yderst reaktivt og ætsende. Hydrogensulfid kan skade til instrumentering, palladiumkatalysatoren og eventuelle udsatte metaller. Hvis det er muligt, ikke efterlade nogen instrumentering, såsom homogenisatorer og spektrofotometre i Chambare i lange perioder af gange for at undgå korrosion forårsaget af hydrogensulfid. På grund af produktionen af hydrogensulfid, vil emner såsom palladium katalysator og gas analysator skal udskiftes periodisk som en del af regelmæssig kammer vedligeholdelse. Alternativer til reduktion af hydrogensulfid niveauer i kammeret, som ved hjælp af aktivt kul, blyacetat, sølvchlorid eller sølvsulfat til at absorbere eller kemisk fjerne hydrogensulfid er blevet beskrevet 34 og kan anvendes til at bremse korrosion af udstyr.
Yderligere forholdsregler
Åbn aldrig en dør til luftslusen uden at sikre, at den anden dør er lukket og låst for at forhindre forurening af ilt. Derudover undgå brug af skarpe genstande i kammeret for at reducere risikoen for punktering af vinyl.
Det er vigtigt at bemærke, at brint er en brændbar gas i tilstedeværelse af ilt. Vær forsigtig, når de indfører varer into kammeret, at høje niveauer af forurening ilt ikke forekommer (større end 999 ppm). Det er vigtigt kun at bruge færdigblandede ikke-brandfarlige anaerob gas mix og nøje overvåge gas analysator i kammeret, især når du bruger en ny benzintank. Hvis begge brint og ilt koncentrationer over 4% forekommer, at sikre, at de relevante nødprocedurer, som bør skitseres i laboratoriets standardprocedurer (SOP), følges.
Problemløsning C. difficile vækst
Hvis dårlig vækst af C. difficile kulturer er observeret i rigt medium, det er oftest på grund af forurening ilt i kammeret. Tilføjelsen af et reduktionsmiddel (fx L-cystein eller thioglycolat) til mediet kan forbedre vækst, men spørgsmålet om forurening ilt i kammeret vil skulle løses. Overvågning ilt og brint niveauer i kammeret ved hjælp af en gas analysator kan hurtigt etLert brugeren til spørgsmål, før en forsinkelse i fremgang og fald i produktiviteten opstår. Hvis forurening ilt opstår, hurtigt identificere kilden med en gaslækage detektor (tilgængelig fra Coy Laboratories) tilrådes. For at øge chancen for at finde placeringen af en lækage, kan en klud dyppet i alkohol skal placeres i kammeret, da gaslækage detektor kan identificere forhøjede niveauer af kulbrinter samt forhøjet indhold af brint. Når kilden til lækage, kan den repareres ved hjælp af lim eller silikone efter fabrikantens anvisninger.
En række organismer let vokse i anaerobe miljøer, herunder andre almindelige Clostridium arter (f.eks Clostridium perfringens), og den fakultative anaerobe, Escherichia coli. Aseptisk teknik og andre strategier, kan reducere risikoen for forurening. Relevante organisationer i kammeret, såsom at placere elementer inden for rækkevidde for at mindske den potentielle feller spild og hurtig fjernelse af ophobede biologisk farligt affald, kan reducere risikoen for forurening. Derudover kan papirservietter fugtet med en fortyndet blegemiddel løsning regelmæssigt bringes ind i kammeret for at tørre ned overflader og latex eller neopren handsker. Det er afgørende ikke at forlade blegemiddel eller alkohol-løsninger inde i kammeret for lange perioder, da disse kan gennemtrænge atmosfæren og faste og flydende medier, dræbte C. difficile samt beskadige vinyl 34. Derudover kan løbende udskiftning af latex eller neopren handsker også reducere risikoen for forurening. Som nævnt ovenfor, hvis du er usikker, hvis en organisme er C. difficile eller et forurenende stof, kan en test for tilstedeværelsen af tdcB genet ved hjælp af PCR hurtigt afgøre, om organismen er C. difficile 21.. Endelig, hvis dyrke flere organismer inden for samme anaerobe kammer, er det vigtigt at bemærke, at C. difficile kan producere metaboliske biprodukter (e. Gram. Hydrogensulfid), som hæmmer væksten af andre anaerobe organismer og vice versa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Coy Laboratories for venligt at levere billeder af den anaerobe kammer. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health tilskud DK087763 (SMM) og en STEP / HHMI Curriculum Development Fellowship (ANE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Proteose Peptone no. 2 | BD | 212120 | |
| Na2HPO4 | Fisher | S373 | |
| KH2PO4 | Fisher | BP362 | |
| NaCl | Fisher | S27 | |
| MgSO4 (anhydrous) | Fisher | M65 | |
| á´…-Fructose | Fisher | L96 | |
| Sodium taurocholate | Sigma | T4009 | |
| á´…-cycloserine | Sigma | C6880 | |
| Cefoxitin | Fluka | C4786 | |
| Brain heart infusion medium | BD | 237300 | |
| Proteose Peptone | BD | 211684 | |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A5132 | |
| Tris base | Fisher | BP152 | |
| Agar | BD | 214010 | |
| L-cysteine | Sigma | C7755 | |
| BactoPeptone | BD | 211684 | |
| Columbian sheep blood agar | Fisher | L21928 | |
| NaCl | Fisher | S27 | |
| KCl | Fisher | P217 | |
| Glycerol | Fisher | BP2291 | |
| Sterile inoculating loops | Fisher | 22363596 | |
| Sterile swabs | Fisher | 1495990 | |
| Coy Vinyl Anaerobic Chamber and Accessories | Coy Laboratory Products, Inc | Customer Specified | These items are custom ordered per laboratory needs |
| Materials | |||
| TCCFA agar Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g Na2HPO4 5 g KH2PO4 1 g NaCl 2 g MgSO4 (anhydrous) 0.1 g Fructose 6 g Agar 20 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add: 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 0.1%) 25 ml of 10 mg/ml á´…-cycloserine, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 250 μg/ml) 1.6 ml of 10 mg/ml cefoxitin, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 16 μg/ml) BHIS Medium Brain heart infusion 37 g Yeast extract 5 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate (dissolve in water; final concentration, 0.1%) SMC Sporulation Medium BactoPeptone 90 g Protease peptone 5 g (NH4)2SO4 1 g Tris base 1.5 g Agar 15 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 70:30 Medium BactoPeptone 63 g Protease peptone 3.5 g Brain heart infusion 11.1 g Yeast extract 1.5 g (NH4)2SO4 0.7 g Tris base 1.06 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (final concentration, 0.03%). Blood agar The use of premade Columbia anaerobic sheep blood agar plates (Fisher Scientific, L21928)35 is recommended. 1X Phosphate buffered saline (PBS) NaCl 8.01 g KCl 0.2 g Na2HPO4 1.44 g KH2PO4 0.27 g Bring to 1 L with deionized water and adjust pH to 7.4 with HCl. Filter sterilize before use. |
|||
References
- Hall, I. C., O'Toole, E. Intestinal flora in new-borin infants - With a description of a new pathogenic anaerobe, Bacillus difficilis. Am. J. Dis. Child. 49, 390-402 (1935).
- Tedesco, F. J., Barton, R. W., Alpers, D. H. Clindamycin-Associated Colitis - Prospective Study. Ann. Intern. Med. 81, 429-433 (1974).
- Gerding, D. N. Clostridium difficile 30 years on: what has, or has not, changed and why. Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 2-8 (2009).
- Gerding, D. N., Muto, C. A., Owens, R. C. Treatment of Clostridium difficile infection. Clin. Infect. Dis. 46, Suppl 1. 32-42 (2008).
- Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin. Infect. Dis. 55, 88-92 (2012).
- Bouza, E. Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden. Clin. Microbiol. Infect. 18, 5-12 (2012).
- Peery, A. F., et al. Burden of gastrointestinal disease in the United States: 2012 update. Gastroenterology. 143, 1171-1173 (2012).
- Deakin, L. J., et al. The Clostridium difficile spo0A gene is a persistence and transmission factor. Infect. Immun. 80, 2704-2711 (2012).
- Drasar, B. S. Cultivation of anaerobic intestinal bacteria. J. Pathol. Bacteriol. 94, 417-427 (1967).
- Leach, P. A., Bullen, J. J., Grant, I. D. Anaerobic CO 2 cabinet for the cultivation of strict anerobes. Appl. Microbiol. 22, 824-827 (1971).
- Killgore, G. E., Starr, S. E., Del Bene,, Whaley, V. E., N, D., Dowell, V. R. Comparison of three anaerobic systems for the isolation of anaerobic bacteria from clinical specimens. Am. J. Clin. Pathol. 59, 552-559 (1973).
- Bacic, M. K., Smith, C. J. Laboratory maintenance and cultivation of bacteroides species. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 13, Unit 13C 11 (2008).
- Doan, N., Contreras, A., Flynn, J., Morrison, J., Slots, J. Proficiencies of three anaerobic culture systems for recovering periodontal pathogenic bacteria. J. Clin. Microbiol. 37, 171-174 (1999).
- Socransky, S., Macdonald, J. B., Sawyer, S. The cultivation of Treponema microdentium as surface colonies. Arch. Oral. Biol. 1, 171-172 (1959).
- George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 9, 214-219 (1979).
- Wilson, K. H., Silva, J., Fekety, F. R. Suppression of Clostridium difficile by normal hamster cecal flora and prevention of antibiotic-associated cecitis. Infect. Immun. 34, 626-628 (1981).
- Wilson, K. H., Kennedy, M. J., Fekety, F. R. Use of sodium taurocholate to enhance spore recovery on a medium selective for Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 15, 443-446 (1982).
- Bliss, D. Z., Johnson, S., Clabots, C. R., Savik, K., Gerding, D. N. Comparison of cycloserine-cefoxitin-fructose agar (CCFA) and taurocholate-CCFA for recovery of Clostridium difficile during surveillance of hospitalized patients. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 29, 1-4 (1997).
- Marler, L. M., et al. Comparison of five cultural procedures for isolation of Clostridium difficile from stools. J. Clin. Microbiol. 30, 514-516 (1992).
- Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 1 (2009).
- Bouillaut, L., McBride, S. M., Sorg, J. A. Genetic manipulation of Clostridium difficile. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 2 (2011).
- Lemee, L., Pons, J. L. Multilocus sequence typing for Clostridium difficile. Methods. Mol. Biol. 646, 77-90 (2010).
- Shanholtzer, C. J., Peterson, L. R., Olson, M. N., Gerding, D. N. Prospective study of gram-stained stool smears in diagnosis of Clostridium difficile colitis. J. Clin. Microbiol. 17, 906-908 (1983).
- Smith, C. J., Markowitz, S. M., Macrina, F. L. Transferable tetracycline resistance in Clostridium difficile. Antimicrob. Agents Chemother. 19, 997-1003 (1981).
- Permpoonpattana, P., et al. Surface layers of Clostridium difficile endospores. J. Bacteriol. 193, 6461-6470 (2011).
- Putnam, E. E., Nock, A. M., Lawley, T. D., Shen, A. SpoIVA and SipL are Clostridium difficile spore morphogenetic proteins. J. Bacteriol. , (2013).
- Burns, D. A., Minton, N. P. Sporulation studies in Clostridium difficile. J. Microbiol. Methods. 87, 133-138 (2011).
- Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile. J. AOAC Int. 94, 618-626 (2011).
- Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. Inhibiting the initiation of Clostridium difficile spore germination using analogs of chenodeoxycholic acid, a bile acid. J. Bacteriol. 192, 4983-4990 (2010).
- O'Connor, J. R., et al. Construction and analysis of chromosomal Clostridium difficile mutants. Mol. Microbiol. 61, 1335-1351 (2006).
- Buggy, B. P., Wilson, K. H., Fekety, R. Comparison of methods for recovery of Clostridium difficile from an environmental surface. J. Clin. Microbiol. 18, 348-352 (1983).
- Koch, C. J., Kruuv, J. The release of oxygen from polystyrene Petri dishes. Br. J. Radiol. 45, 787-788 (1972).
- Ethapa, T., et al. Multiple factors modulate biofilm formation by the anaerobic pathogen Clostridium difficile. J. Bacteriol. , (2012).
- Speers, A. M., Cologgi, D. L., Reguera, G. Anaerobic cell culture. Curr. Protoc. Microbiol. Appendix 4, Appendix 4F (2009).
- Lyras, D., et al. Toxin B is essential for virulence of Clostridium difficile. Nature. 458, 1176-1179 (2009).
