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Immunology and Infection

La culture et entretien Published: September 14, 2013 doi: 10.3791/50787
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Emory University School of Medicine

Summary

Clostridium difficile est une bactérie pathogène qui est une bactérie anaérobie stricte et provoque la diarrhée associée aux antibiotiques (DAA). Ici, des méthodes d'isolement, la culture et le maintien C. des cellules et des spores végétatives difficile sont décrits. Ces techniques nécessitent une chambre anaérobie, qui nécessite un entretien régulier pour assurer des conditions adéquates pour optimale C. culture difficile.

Abstract

Clostridium difficile est un anaérobie, bactérie à Gram positif sporogène qui est principalement responsable de la diarrhée associée aux antibiotiques (DAA) et est un agent pathogène nosocomial important. C. difficile est notoirement difficile à isoler et à cultiver et est extrêmement sensible à même les niveaux d'oxygène dans l'environnement faibles. Ici, les procédés d'isolement de C. difficile à partir d'échantillons fécaux et la culture de la suite C. difficile pour la préparation des stocks de glycérol pour le stockage à long terme sont présentés. Des techniques pour la préparation et l'énumération des stocks de spores dans le laboratoire pour une variété d'applications en aval, y compris des études de microscopie et animaux sont également décrits. Ces techniques nécessitent une chambre anaérobie, qui maintient un milieu anaérobie cohérente afin de garantir des conditions adéquates pour optimale C. croissance difficile. Nous fournissons des protocoles pour le transfert de matériaux dans et hors de la chambre sans caen utilisant une contamination importante de l'oxygène ainsi que des suggestions pour l'entretien régulier nécessaire pour préserver l'environnement anaérobie approprié pour efficace et cohérente C. culture difficile.

Introduction

Clostridium difficile est une bactérie sporulée Gram positif qui est un anaérobie strict et un agent pathogène gastro-intestinal potentiellement mortelle de l'homme et les animaux. Initialement décrit en 1935 comme un organisme commensal trouvé dans les échantillons de selles des nouveau-nés 1, C. difficile a été démontré plus tard d'être l'agent causal de la colite pseudomembraneuse associée à un traitement antibiotique 2. C. infections difficile (ICD) sont généralement précédés par un traitement antibiotique qui se traduit par la perturbation de la flore colique normale, la création d'une niche pour C. difficile de prospérer 2. C. difficile est transmis sous forme d'une spore dormante par l'intermédiaire de la voie fécale-orale et par la suite germe dans le tractus gastro-intestinal, la production de cellules végétatives capable de générer plusieurs toxines et provoquer une maladie grave et la colite 3. CDI sont souvent réfractaires aux traitements conventionnels et ceux-ci enperfections sont souvent récurrentes 4. En conséquence, le CDI sont responsables de jusqu'à 4,8 milliards de dollars en coûts de soins de santé aux États-Unis 5-7.

C. difficile est très sensible même pour les niveaux d'oxygène dans l'environnement de faibles. Pour C. difficile de persister dans l'environnement et être efficacement transmis d'hôte à hôte, la formation d'une spore métaboliquement inactif est critique 8. Étant donné que le maintien et la manipulation de laboratoire de C. difficile nécessite un environnement anaérobie contrôlée, ces techniques nécessitent l'utilisation d'une chambre anaérobie. L'utilisation de chambres d'anaérobie a abouti à la récupération accrue et l'isolement des anaérobies stricts 9-11, et a permis un certain nombre de techniques moléculaires devant être exécutés dans une atmosphère anaérobie.

En plus de C. difficile, l'anaérobie utilisation de la chambre et l'entretien décrits ici sont applicablesà d'autres anaérobies stricts tels que d'autres espèces de Clostridium (par exemple C. perfringens), d'autres espèces gastro-intestinaux (par exemple, les espèces Bacteroides 12) et pathogènes parodontaux (par exemple, les espèces Peptostreptococcus 13).

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Protocol

Remarque: C. difficile est un agent pathogène humain et animal qui peut provoquer une maladie gastro-intestinale. Les expériences impliquant C. difficile doit être effectué avec des précautions appropriées de biosécurité (BSL-2).

Une. Anaérobie Chambre utilisation et d'entretien

C. difficile est une bactérie anaérobie stricte et est extrêmement sensible à de faibles concentrations d'oxygène dans l'atmosphère. Par conséquent, un environnement anaérobie contrôlée est nécessaire pour sa manipulation réussie. L'utilisation d'une chambre anaérobie (figure 1A) fournit l'environnement le plus stable et les conditions idéales pour la culture efficace de C. difficile et d'autres bactéries anaérobies 14. Ici, une atmosphère contenant un mélange gazeux (5% de CO 2, 10% H 2, 85% N 2) peut être maintenu de manière stable.

D'introduire des éléments dans la chambre sans contamination importante de l'oxygène,un sas doit être utilisé (figure 1B). Ce dispositif fonctionne comme un échangeur gaz et fonctionne automatiquement, semi-manuellement ou manuellement. Le sas comporte deux portes: une fourniture d'accès à l'extérieur du sas à air et l'autre fournissant un accès à l'intérieur de la chambre anaérobie. Selon le modèle, le sas peut avoir une porte supplémentaire, ce qui peut offrir l'accès à une chambre anaérobie adjacent, ce qui économise le coût d'un sas séparé. À moins de déplacer activement articles dans ou hors de la chambre, les deux portes doivent rester fermées en tout temps pour éviter la contamination de l'oxygène. Le sas possède un interrupteur marche / arrêt sur la face avant et un panneau contenant quatre boutons. Les conduites de gaz et la pompe à vide tuyau sont reliées à l'arrière du sas, à proximité de la face où se trouvent les commutateurs pour un fonctionnement entièrement manuel de l'appareil. Il est recommandé que les deux cycles de purge, en utilisant de l'azote gazeux (N 2), on utilise avant remplissage de l'échangeur avec un mélange de gaz (5% de CO 2, 10% H 2, 85% de N 2) pour réduire la quantité d'oxygène introduite dans la chambre. Il est également important de ne jamais laisser soit la porte ouverte plus longtemps que la quantité de temps nécessaire pour déplacer des éléments dans et hors de l'échange et de planifier soigneusement expériences pour réduire la fréquence des éléments mobiles dans et hors de la chambre. Les procédures d'exploitation différents pour les chambres d'anaérobie de vinyle sont décrits ci-dessous. Avant de suivre ces protocoles, veiller à ce que ceux-ci sont compatibles avec les instructions du fabricant fournies avec la chambre.

  1. Mode Automatique
    Il s'agit d'un mode programmable et personnalisable et est entièrement réalisée par le sas. Pour programmer le sas, reportez-vous aux instructions du fabricant. Un programme recommandé pour entrée typique dans la chambre comporte deux cycles de purge avec de l'azote, suivie par le remplissage du sas avec un mélange de gaz qui correspond le mieux à l'atmosphère maintenue dans la chambre debre. Au cours de chaque cycle de vide, les procédures standard d'usine proposent un vide à 20 inHg et purge à 1 inHg.
    1. Assurez-vous que la porte du sas intérieur est complètement fermée.
    2. Ouvrez la porte du sas extérieur.
    3. Placer des éléments dans le sas et fermer la porte du sas extérieur. Si l'introduction de liquides, dévisser les bouchons à mi-chemin pour assurer l'échange efficace de gaz. Emballages et récipients scellés doivent être ouvertes avant le début du cycle, en s'abstenant de le faire peut se déformer et dommages en plastique et des conteneurs. Pour maintenir la stérilité, ouvrir les emballages suffisamment pour permettre que les échanges gazeux efficace.
    4. Appuyez sur le bouton Démarrer.
    5. Attendez jusqu'à ce que le sas a pédalé à travers le programme et l'écran affiche "anaérobie".
    6. Ouvrir la porte du sas intérieur.
    7. Déplacer des éléments dans la chambre.
    8. Fermez la porte intérieure.
  2. Mode semi-manuel
    Ce mode peut être utilisé lors du déplacement des éléments dans ou hors de la chambre et est si nécessaire cycling le gaz dans la chambre est nécessaire.
    1. Assurez-vous que la porte du sas intérieur est complètement fermée.
    2. Ouvrez la porte du sas extérieur.
    3. Placer des éléments dans le sas et fermer la porte du sas extérieur. Si l'introduction de liquides, dévisser les bouchons à mi-chemin pour assurer l'échange efficace de gaz. Des emballages scellés, tels que des boucles d'inoculation et des plaques à 96 puits, doivent être ouvertes avant le début du cycle.
    4. Appuyez sur Menu.
    5. Appuyez sur Start. Le sas indique la fonction de chaque bouton et ne répond pas jusqu'à ce que cela est terminé:
      • Flèche vers le haut: active la pompe à vide.
      • Flèche vers le bas: lance l'azote (purge) du débit de gaz.
      • Lancer: lance le flux de mélange de gaz.
      • Menu: revenir à l'affichage par défaut.
    6. Appuyez sur «Up», éliminer le gaz dans le sas, jusqu'à ce que l'écran affiche 20 inHg.
    7. Appuyez sur "Down", le remplissage du sas avec de l'azote, jusqu'à ce que l'écran affiche moins de 1 inHg. Ne pas overshoot, car cela créera une pression positive dans le sas, qui peut affecter son intégrité.
    8. Répétez les étapes 6 et 7 pour effectuer un cycle de purge supplémentaire.
    9. Appuyez sur "Up" jusqu'à ce que l'écran affiche 20 inHg.
    10. Appuyez sur "Démarrer", remplissant l'échange avec un mélange de gaz, jusqu'à ce que l'écran affiche moins de 1 inHg.
    11. Ouvrir la porte du sas intérieur.
    12. Déplacer des éléments dans la chambre.
    13. Fermez la porte intérieure.
  3. Mode manuel
    Ce mode peut être utilisé chaque fois que les modes automatiques ou semi-manuels ne fonctionnent pas ou il n'y a pas le pouvoir de le sas. Ce mode ne fonctionne pas lorsque le sas est, par conséquent, il est difficile de déterminer la pression à l'intérieur du sas. Parce que le vide tirer et temps de purge de gaz dépend de taux de vide et de flux de gaz, respectivement, l'utilisation d'une jauge de pression à l'intérieur de l'échangeur est nécessaire pour surveiller la pression et réduire le risque de blessures et de dommages à la sas.
    1. Assurez-vous que la porte du sas intérieur est complètement fermée.
    2. Ouvrez la porte du sas extérieur.
    3. Placez les articles, y compris la jauge de pression, dans le sas et fermer la porte du sas extérieur. Si l'introduction de liquides, dévisser les bouchons à mi-chemin pour assurer l'échange efficace de gaz. Des emballages scellés, tels que des boucles d'inoculation et des plaques à 96 puits, doivent être ouvertes avant le début du cycle.
    4. Repérez les trois interrupteurs situés à l'arrière du sas intitulée «aiguillages à commande manuelle." Ceux-ci sont marqués individuellement en tant que:
      • Pour aspirateur
      • Azote
      • Gaz Mix
    5. Basculez l'interrupteur à bascule au vide jusqu'à ce que le manomètre indique environ 20 inHg.
    6. Basculez l'interrupteur de l'azote à bascule jusqu'à ce que le manomètre indique environ 1 inHg.
    7. Basculez l'interrupteur à bascule au vide jusqu'à ce que le manomètre indique environ 20 inHg.
    8. Basculez l'interrupteur de l'azote à bascule jusqu'à ce que le manomètre indique environ 1 inHg.
    9. Basculez l'interrupteur à bascule au vide jusqu'à ce que le manomètre indique environ 20 inHg.
    10. Basculez l'interrupteur à bascule de gaz jusqu'à ce que le mélange manomètre indique environ 1 inHg.
    11. Ouvrir la porte du sas intérieur.
    12. Déplacer des éléments dans la chambre.
    13. Fermez la porte intérieure.

2. La culture, l'énumération et l'entreposage C. difficile à partir des échantillons de selles

Cette procédure vise à récupérer C. difficile à partir d'échantillons fécaux contenant des spores et maintient par la suite des colonies isolées que les cellules végétatives ou de spores dans le stockage à long terme des stocks de glycérol. Sinon, cette procédure peut être utilisée pour énumérer le nombre de C. présent difficile dans les échantillons de selles (par exemple provenant d'études animales). Pour enrichir sélective et différentielle pour C. difficile, l'agar-taurocholate céfoxitine-cyclosérine-fructose (TCCFA) est utilisé pour inhiber la croissance de la flore fécale normale de 15 à 16. Cyclosérine est bactériostatique pour les bactéries Gram-négatives, tandis que la céfoxitine inhibe de façon plus générale la croissance des bactéries à la fois Gram-négatifs et positifs, à l'exception de C. difficile et plus entrent souches de cocci. Un indicateur de pH, le rouge neutre, peut être incluse dans le milieu, comme la fermentation du fructose se traduira par une diminution du pH et un changement de couleur ultérieur du rouge / orange au jaune. Pour récupérer efficacement les spores de C. difficile que les bactéries végétatives, le taurocholate de sodium et de sel biliaire est utilisée pour induire la germination de 17 à 18. Parce C. forme des spores difficile, l'alcool ou le traitement thermique des échantillons peut être utilisée pour réduire ou éliminer les cellules végétatives, ce qui limite la croissance de la flore contaminante, ce qui peut augmenter l'efficacité de C. récupération difficile 19. Comme mentionné ci-dessus, il est essentiel d'effectuer une pré-réduire toutes les plaques pendant au moins 1-2 heures dans la chambre anaérobie avant l'utilisation pour assurer l'élimination de l'oxygène résiduel. dryi de l'airng les plaques avant de les utiliser dans la chambre peuvent réduire la condensation. Le milieu liquide peut nécessiter jusqu'à 24 heures pour réduire en fonction du volume et le rapport surface-air du récipient utilisé.

Avant de commencer, les éléments suivants doivent être placés dans la chambre anaérobie:

  • échantillon de selles
  • Écouvillons
  • Boucles d'inoculation stériles
  • 1x PBS (voir Matériaux)
  • Plaques TCCFA (voir Matériaux)
  • BHIS (Brain Heart Infusion milieu d'extrait de levure) plaques et le bouillon (voir Matériaux)
  • 50% de glycérol (stérilisé)
  • 10% de L-cystéine (stérilisé)
  • Flacons de stockage cryogéniques

* En variante, des colonies isolées peuvent être étalés sur des plaques de gélose BHIS, et ensuite raclées et remises en suspension dans un milieu liquide BHIS avec 15% de glycerol pour stockage à long terme à -80 ° C. ** Il est important de noter que la coloration de Gram n'est pas une stratégie efficace pour identifier C. Difficile directement à partir d'échantillons de selles 23 C. difficile doit d'abord être isolé des autres flore présente dans les selles.

  1. Reprendre l'échantillon de selles dans PBS 1x (ce peut être réalisée dans des conditions aérobies), et veiller à ce que l'échantillon de selles est entièrement remis en suspension dans du PBS 1x par vortex. Si l'énumération C. difficile dans les selles, peser l'échantillon de selles, avant l'addition de 1 x PBS.
  2. Faire des dilutions en série de l'échantillon de selles remis en suspension dans du PBS 1x pour l'isolement ou l'énumération approprié d'unités formant des colonies (UFC) par gramme de selles.
  3. En utilisant une technique aseptique, appliquer 100 ul de chaque dilution en série de plaques TCCFA.
  4. Grâce à une série de boucles d'inoculation stériles, série la culture appliqué des colonies isolées ou diffuser la culture appliquée sur la surface de la plaque TCCFA pour le dénombrement des colonies uniformément.
  5. Incuber la plaque pendant 48 h en anaérobiose à 37 ° C. Il est possible de détecter et d'identifier C. DIFFICILE colonies dans les 24 heures basées surl'appartement irrégulière, l'apparence, rez-de-verre des colonies de 15, bien que l'identification et l'énumération plus précise est obtenue après 48 heures.
  6. Utilisation des boucles d'inoculation stériles, repiquer des colonies qui semblent C. difficile sur pré-réduits des plaques d'agar BHIS, complété par 0,03% de L-cystéine 20. Choisissez une colonie individuelle, et une rayure sur la plaque dans les quadrants, en utilisant une nouvelle anse stérile pour chaque quadrant, à obtenir des colonies isolées. Sinon, compter le C. DIFFICILE colonies de chaque dilution (ce peuvent être effectuées dans des conditions aérobies), et calculer le nombre de colonie unités par gramme d'échantillon de selles former.
  7. Confirmez C. identification difficile par la coloration de Gram. Après coloration de Gram, C. difficile apparaît que des tiges pourpres et certaines cellules peut contenir des endospores terminaux. réaction en chaîne de la polymérase (PCR) l'identification des gènes qui codent pour la toxine B peut fournir une confirmation supplémentaire desouches toxinogènes de C. difficile alors que 21 multilocus sequence typing (MLST) est un succès pour l'identification et le typage précis des souches inconnues et non toxigènes de C. Difficile 22.
  8. Afin de maintenir un stock de C. difficile à -80 ° C, choisissez un individu, colonie isolée de la plaque de gélose BHIS utilisant une anse stérile et remettre en suspension la colonie dans 10 ml de BHIS pré-réduits milieu liquide complété avec 0,03% de L-cystéine. *
  9. Incuber une nuit en anaérobiose à 37 ° C, ou jusqu'à ce que la culture devient trouble.
  10. Ajouter 333 ul de glycérol à 50% et 666 pi de la C. culture difficile à un tube cryogénique de 1,8 ml à créer un stock de glycérol de la souche isolée de 15%.
  11. Bien plafonner le tube cryogénique, bien mélanger et retirer immédiatement le stock de la chambre anaérobie et le placer dans un congélateur -80 C ° pour le stockage à long terme.

3. La culture de C. difficile

Cette procédure prévoit le recouvrement de C. difficile à partir des stocks de glycerol stockées à -80 ° C. Parce que des cycles répétés de gel-dégel peuvent tuer les cellules végétales, il est important de garder les stocks de glycérol congelés en tout temps. Nous ne recommandons pas l'utilisation de la glace sèche pour le transfert de souches dans et hors de la chambre que l'évaporation de la glace sèche peut modifier l'environnement dans la chambre. Au lieu de cela, nous vous recommandons d'utiliser des supports de refroidissement congelés de conserver des stocks de glycérol congelés pendant le transport. Pour diverses fins sélectives et différentielles, trois médias sont couramment utilisés pour la culture de C. difficile. TCCFA, tel que discuté ci-dessus, est sélectif pour C. difficile et contient le taurocholate de sodium, un germinant. l'infusion de coeur de cerveau supplémenté avec de l'extrait de levure (BHIS) est un milieu enrichi couramment utilisé, non sélectif qui permet la croissance d'une grande variété d'organismes (figure 2A) 24. Foire, L-cystéinee est ajouté à BHIS comme agent réducteur 20. Enfin, l'addition de sang dans le milieu (figure 2B) permet de sporulation plus efficace que sur TCCFA et permet la détection de la fluorescence verdâtre ou chartreuse uniques présentée par C. difficile sous ultraviolet à onde longue (UV) 15 (figure 2C). Lorsque la culture de C. difficile à partir des stocks de spores, il est essentiel de rappeler que le taurocholate de sodium doit être ajouté au milieu pour assurer la germination.

Avant de commencer, les éléments suivants doivent être placés dans la chambre anaérobie:

  • Frozen stock de glycérol (en rack de refroidissement)
  • Boucles d'inoculation stériles
  • Plaques TCCFA ou BHIS (voir Matériaux)
  • BHIS bouillon (voir Matériaux)
  • 50% de glycérol (stérilisé)
  • Flacons de stockage cryogéniques
  1. Placez le glycérol stock congelé de C. difficile dans un support de refroidissement qui a été stocké à -80 ° C prIOR à utiliser pour éviter la décongélation.
  2. Apportez le stock de glycérol congelés sur glace sèche dans la chambre anaérobie.
  3. En utilisant une technique aseptique et une anse stérile, placez une petite quantité du stock sur la plaque et zèbrent un quadrant de la plaque.
  4. Faites pivoter la plaque de 90 ° et, en utilisant une nouvelle anse stérile, continuer à zèbrent le deuxième quadrant.
  5. Répéter pour les troisième et quatrième quadrants pour assurer l'isolement de colonies individuelles.
  6. Enlever immédiatement le stock de glycérol congelés de la chambre anaérobie et revenir à -80 ° C.
  7. Incuber la plaque par voie anaérobie pendant une nuit à 37 ° C. Colonies isolées individuelles doivent être observées après une nuit de croissance.

4. Purifiant spores de C. difficile

Comme sporulation est nécessaire pour la survie dans des environnements riches en oxygène et pour une transmission efficace de la maladie 8, la préparation des stocks de spores est Often nécessaire pour les applications en aval, ne se limitant pas à des études de microscopie et animaux. Il est important de noter que l'énumération des spores nécessite répétition pour assurer la reproductibilité de la numération. Introduire à la pipette de haut en bas plusieurs fois entre dilutions réduit également la perte depuis spores adhèrent au plastique bien.

La sporulation de C. difficile n'est pas aussi rapide ou homogène que d'autres espèces sporogènes. Pour optimiser la production de spores et de récupération, soit du milieu de sporulation (SMC) 17,25 ou 26 70:30 moyenne est recommandée. D'autres médias couramment utilisés sont BHIS, qui nécessite 4-5 jours de croissance avant la sporulation efficace est considéré 27, et Clospore, un milieu liquide qui produit des titres élevés de spores (10 juillet-10 août spores par millilitre) après 72 heures de croissance. D'autres protocoles utilisent de l'eau refroidie à la glace, plutôt que du PBS 1x 20, mais l'utilisation d'une solution isotonique peut réduire les spores de coller les uns aux autres et des surfaces plastiques. Autrement,certains chercheurs purifier davantage leurs spores en utilisant un gradient de saccharose à supprimer complètement les cellules végétatives et les débris 29.

Avant de commencer, les éléments suivants doivent être placés dans la chambre anaérobie:

  • Boucles d'inoculation stériles
  • BHIS, SMC et / ou 70:30 plaques (voir Matériaux)
  • BHIS bouillon (voir Matériaux)
  • 1x PBS, stérilisée par filtration (voir Matériaux)
  1. Souches Culture congelé stock de glycérol sur des plaques BHIS pré-réduits et incuber en anaérobiose nuit à 37 ° C.
  2. Restreak sur plusieurs pré-réduit ou SMC 70:30 plaques et incuber en anaérobiose à 37 ° C pendant 24 à 48 heures. formation de spores peut être suivie par microscopie à contraste de phase. Les spores apparaissent phase tout lumineux végétative et cellules mères apparaîtront phase sombre. * En variante, les spores peuvent être purifiés à partir de 70:30 milieu liquide après 24 à 48 heures, ce qui donne 10 5 -10 6 spores par ml, en fonction de la strain utilisé.
  3. En utilisant une boucle d'inoculation stérile, racler les plaques et remettre en suspension les cellules dans 10 ml stérile 1x PBS.
  4. Jeter plaques et retirer la suspension de spores de la chambre anaérobie. Sédimenter les cellules à 3000 g pendant 15 minutes. Laver les cellules deux fois dans du PBS 1x, la remise en suspension entièrement le culot de cellules à chaque fois.
  5. Incuber pendant une nuit à 4 ° C pour faciliter la lyse des cellules végétatives et maternelles.
  6. Incuber à 70 ° C pendant 20 min pour tuer toutes les cellules végétatives résiduelles.
  7. Pour déterminer colonie unités (CFU) par millilitre, diluer en série chaque préparation de spores dans PBS 1x et la plaque sur BHIS + de taurocholate de sodium à 0,1%. Incuber les plaques pendant au moins 24 heures avant d'énumérer les colonies.
  8. Les spores peuvent être stockées dans du PBS 1x, soit à température ambiante ou à 4 ° C pour stockage à long terme. Si elles sont stockées à 4 ° C, il peut être utile de réchauffer la préparation de spores à 55 ° C pendant 15 minutes pour rétablir la germination efficace.

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Representative Results

Un exemple de C. difficile cultivé sur BHIS Britannique et anaérobie moutons milieux de gélose au sang peut être vu sur la figure 2. C. difficile forme des colonies irrégulières qui sont à plat et possèdent un aspect de verre dépoli qui est évident sur ​​les deux médias. Ici, un isolat clinique érythromycine sensible de C. difficile, 630E 30, est cultivé sur gélose BHIS, un milieu non sélectif enrichi, pendant 24 heures à 37 ° C (Figure 2A). Colonies sur gélose Columbia anaérobie moutons artérielle semblent similaires à celles qui sont cultivées sur BHIS sous une lumière blanche (figure 2B), mais l'utilisation de ce milieu permet aussi la détection de la fluorescence verdâtre ou chartreuse présenté par C. difficile sous ultraviolet à onde longue (UV) 15 (figure 2C). C. DIFFICILE colonies sur gélose TCCFA ressemblent à la croissance sur gélose BHIS. En raison de la présence de deux antibiotiques dans un milieu TCCFA, un timpériode de 48 croissance de h e est nécessaire avant d'énumérer les colonies.

Figure 1
Figure 1. La chambre Coy laboratoires de type C de vinyle et de ses composants. (A) chambre de vinyle A Coy laboratoires de type C qui fournit l'espace de travail pour une seule personne à la fois (42 po x 32 po). Il contient une boîte de ventilateur de catalyseur (coin arrière gauche) qui circule et réchauffe l'air, et détient le Stak-Pak contenant le catalyseur de palladium nécessaire pour réduire la contamination de l'oxygène. (B) Le sas sert d'échangeur et fournit un mécanisme pour le transfert des matériaux dans et hors de la chambre, tout en empêchant une contamination importante de l'oxygène dans l'environnement anaérobie. Le sas comporte deux portes: une permettant l'accès à l'extérieur du sas à air et l'autre fournissant un accès à l'intérieur de th e chambre anaérobie. Le sas est programmable et permet de cycles personnalisés pour entrée dans la chambre. Il peut fonctionner en modes automatiques, semi-manuels et manuelles. (C) attenant, des gants en latex flexibles sont fournis qui permettent gamme complète de mouvement et d'atteindre l'intérieur de la chambre. Les gants sont fixés sur une manchette spécialisé attaché aux manchons de vinyle avec de la colle vinylique, ce qui permet le remplacement de gants sans perturber l'atmosphère de la chambre anaérobie. Les gants en néoprène sont également disponibles. (D) L'analyseur de gaz Modèle 10 surveille en continu les deux niveaux d'hydrogène fournissant une lecture instantanée de l'atmosphère à l'intérieur de la chambre et de l'oxygène. Cette unité permet des alertes immédiates en cas de fuite, un mélange de gaz incorrect est utilisé ou autres problèmes surgissent par des alarmes sonores et une lumière LED clignotante.

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Figure 2. L'apparition de C. DIFFICILE colonies sur divers supports. L'appartement, irrégulière, aspect caractéristique rez-de-verre est évident avec un isolat clinique érythromycine sensible de C. difficile, 630E 30, cultivé sur gélose BHIS pendant 24 heures (A) et Columbia anaérobie moutons gélose au sang pendant 48 heures sous une lumière blanche (B) et à long lumière ultraviolette d'onde (C).

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Discussion

Les méthodes décrites ici permettent de récupération simple et rapide de C. difficile à partir d'une variété d'échantillons de matières fécales, y compris les humains, les souris et les hamsters, ainsi que le stockage à long terme de C. difficile comme le glycérol ou spores des stocks. C. difficile peut être un organisme difficile à cultiver, mais une maintenance rigoureuse d'un environnement anaérobie et l'application des techniques d'asepsie peut prévoir une forte croissance et une réduction de la contamination.

chambres anaérobies: Considérations et entretien

Il existe deux types de chambres d'anaérobie: chambres rigides ou chambres de vinyle. Chambres rigides sont généralement faites d'aluminium ou d'un polymère semi-rigide (par exemple en plexiglas ou de matériaux acryliques), permettant l'utilisation de produits chimiques caustiques. Chambres rigides peuvent être convertis en un style de gloveless et sont moins sujettes à la crevaison, mais les fuites sont difficiles à détecter et à trouver et chambres rigides nécessitent une méthode pourcompenser le déplacement de gaz pendant l'utilisation. Les motifs polymères sont souvent équipés d'un sas de purge seule, ce qui peut coûter plus cher à utiliser. Pour le maintien de conditions strictes atmosphériques, le coût, la flexibilité, les besoins d'espace de laboratoire et d'entretien facile, les chambres d'anaérobie de vinyle sont recommandées (Coy produits de laboratoire, figure 1A). Cette chambre anaérobie est constituée d'une boîte à gants de vinyle qui est supporté par une structure tubulaire en aluminium, et est reliée à une poche d'air qui fonctionne comme un échangeur pour le transfert des matériaux dans et hors de la chambre (figure 1B), en utilisant des latex ou néoprène attaché à manches de vinyle (figure 1C). Il est important de suivre précisément les instructions du fabricant pour le bon ensemble jusqu'à la chambre anaérobie. Il peut être à une température contrôlée (ou plus, selon la taille de la chambre) unités de la boîte de chauffage qui assurent la circulation de l'air à travers un catalyseur au palladium. Le palladium catalyst sert à réduire la contamination de l'oxygène introduit par le biais de l'échangeur par la conversion de l'hydrogène et de l'oxygène dans l'eau. Idéalement, les deux niveaux d'oxygène et d'hydrogène sont surveillés à l'aide d'un analyseur de gaz (Figure 1D), l'affichage de la concentration en oxygène, en parties par million (ppm) et la concentration d'hydrogène exprimée en pourcentage.

Les milieux liquides et solides doivent être pré-réduits dans la chambre anaérobie avant utilisation. Boîtes de Pétri (100 mm de diamètre) peuvent être réduites pour seulement deux heures avant d'utiliser le 31, mais les milieux liquides devraient être réduites pendant la nuit. Surtout, les médias doivent être refroidis avant de transférer dans la chambre pour empêcher clignotant liquide pendant sas d'évacuation. Consommables en plastique, tels que des plaques à 96 puits, doivent être pré-réduits pendant une nuit avant l'utilisation, en tant que matière plastique est poreuse et peut stocker des molécules d'oxygène 32. Selon l'application, certaines matières plastiques doivent être pré-réduits jusqu'à 48 h 33 avant l'utilisation. Déchets Biohazard doit be éliminés de manière adéquate. Un petit sac de risque biologique peut être gardé à l'intérieur de la chambre, mais il doit être remplacé fréquemment.

Une concentration d'hydrogène d'au moins 3% doit être maintenue à l'intérieur de la chambre, car cela permettra d'assurer à la fois une bonne croissance de C. élimination de l'oxygène difficile et efficace. Si la concentration en hydrogène tombe au-dessous de 3% ou si la chambre n'a pas été utilisé pendant plusieurs jours, un cycle de chambre doit être exécutée pour rétablir la concentration d'hydrogène à des niveaux souhaitables. Ici, environ un tiers du gaz dans la chambre est aspiré sur (la boîte de vinyle se dégonfle de manière significative) et remplacé par un mélange de gaz frais. Assurez-vous que le sas est anaérobie avant de commencer. Pompage trop de gaz dans la chambre doit être évitée, car cela non seulement met un stress inutile sur le sac en vinyle, mais seront également empêcher l'utilisateur d'atteindre à l'arrière de la chambre. Toujours effectuer cette procédure dans un endroit bien ventilé. Prendre des précautions supplémentaires si la chambre est conservé dans une petite pièce, mal ventilé. Ouvrez les portes de la pièce que les teneurs en gaz à l'intérieur de la chambre peuvent asphyxier l'utilisateur.

Maintien supplémentaire inclut la régénération du catalyseur à base de palladium pour assurer une élimination efficace de l'oxygène à l'intérieur de la chambre. Que de l'oxygène et de l'hydrogène sont réduits par le catalyseur, l'eau peut s'accumuler sur la surface des pastilles d'aluminium recouvert de palladium, ce qui réduit leur efficacité au fil du temps. Pour surmonter ceci, les catalyseurs au palladium doivent être régénérées au moins une fois par semaine par la cuisson d'au moins 230 ° C pendant une heure. En outre, en raison à la fois de la réduction de l'oxygène et de l'évaporation de l'eau à partir de plaques et des médias, l'accumulation d'eau est un problème commun dans les chambres d'anaérobie. Pour assurer une manipulation confortable et augmenter la demi-vie de l'équipement dans la chambre, les packs de dessiccation peuvent être utilisés, mais doivent être séchés fréquemment en suivant la même procédure utilisée pour les catalyseurs au palladium. Alternativement, un dehumidificateur peut être utilisé, qui fait circuler l'air à travers un bloc de métal qui condense l'eau et est recueilli dans un récipient. Le dispositif empêche le débordement des récipients d'eau, mais les déshumidificateurs doivent être surveillés et les conteneurs doivent être vidés quand presque à plein. Pour nettoyer la chambre de vinyle, l'utilisation d'un chiffon doux et un produit disponible dans le commerce recommandée pour le chlorure de polyvinyle (PVC) est recommandée (par exemple Magic Cleaner en plastique, réf. 1600480, Coy Laboratories). Pour éviter de rayer ou endommager la chambre de vinyle, ne pas utiliser des serviettes en papier, Kim lingettes ou des produits contenant des cétones ou d'autres composés qui pourraient endommager PVC.

Enfin, C. difficile produit du sulfure d'hydrogène (H 2 S), qui est extrêmement réactif et corrosif. Le sulfure d'hydrogène peut être dommageable pour l'instrumentation, le catalyseur de palladium et des métaux exposés. Si possible, ne pas laisser d'instrumentation, comme homogénéisateurs et spectrophotomètres, dans la chamber pendant de longues périodes de temps pour éviter la corrosion provoquée par l'hydrogène sulfuré. En raison de la production de sulfure d'hydrogène, des éléments tels que l'analyseur de catalyseur à base de palladium et de gaz doivent être remplacées périodiquement dans le cadre de l'entretien régulier de la chambre. Différentes solutions pour réduire les niveaux de sulfure d'hydrogène dans la chambre, par exemple en utilisant du charbon activé, de l'acétate de plomb, le chlorure d'argent ou le sulfate d'argent pour absorber chimiquement ou éliminer le sulfure d'hydrogène, ont été décrits 34 et peuvent être utilisés pour ralentir la corrosion du matériel.

Précautions supplémentaires

Ne jamais ouvrir une porte de sas sans s'assurer que l'autre porte est fermée et verrouillée pour empêcher la contamination de l'oxygène. En outre, d'éviter l'utilisation d'éléments coupants dans la chambre pour réduire le risque de perforation du vinyle.

Il est important de noter que l'hydrogène est un gaz inflammable en présence d'oxygène. Prenez soin lors de l'introduction des éléments into la chambre que des niveaux élevés de contamination par l'oxygène ne se produisent pas (supérieure à 999 ppm). Il est important de n'utiliser que prémélangée ininflammable mélange de gaz anaérobie et suivre de près l'analyseur de gaz dans la chambre, en particulier lors de l'utilisation d'un nouveau réservoir de gaz. Si les deux concentrations d'hydrogène et d'oxygène au-dessus de 4% se produisent, s'assurer que les procédures d'urgence appropriées, qui doivent être décrites dans les procédures normalisées d'exploitation du laboratoire (SOP), sont respectées.

Dépannage C. croissance difficile

Si la faible croissance de C. cultures difficile est observé dans un milieu riche, c'est le plus souvent en raison de la contamination de l'oxygène dans la chambre. L'ajout d'un agent réducteur (par exemple la L-cystéine ou thioglycolate) au milieu peut améliorer la croissance, mais aurait besoin de la question de la contamination de l'oxygène dans la chambre pour être traitées. La surveillance des niveaux d'oxygène et d'hydrogène à l'intérieur de la chambre à l'aide d'un analyseur de gaz peut rapidement unLert à l'utilisateur de questions avant un retard en cours et la diminution de la productivité se produit. Si la contamination de l'oxygène se produit, identifier rapidement la source d'un détecteur de fuite de gaz (disponible auprès de la Cie Laboratories) est conseillé. Pour augmenter les chances de trouver l'emplacement d'une fuite, un chiffon imbibé d'alcool peut être placé à l'intérieur de la chambre depuis le détecteur de fuite de gaz peut identifier des niveaux accrus d'hydrocarbures ainsi que des niveaux accrus d'hydrogène. Une fois que la source de la fuite, il peut être réparé à l'aide de colle ou de silicone suivant les instructions du fabricant.

Un certain nombre d'organismes se développer facilement dans les environnements anaérobies, y compris d'autres espèces communes (par exemple Clostridium Clostridium perfringens) et l'anaérobie facultatif, Escherichia coli. Une technique aseptique et d'autres stratégies peuvent réduire le risque de contamination. Organisation appropriée dans la chambre, comme de placer des objets à portée de main afin de réduire le potentiel fou les déversements et l'élimination rapide des déchets biologiques dangereux accumulés, peuvent réduire les risques de contamination. En outre, des serviettes en papier imbibé d'une solution diluée d'eau de Javel peuvent être amenés périodiquement dans la chambre pour nettoyer les surfaces et les latex ou néoprène. Il est essentiel de ne pas laisser l'eau de Javel ou d'alcool à l'intérieur de la chambre pour de longues périodes de temps, car ils peuvent imprégner de l'atmosphère et des milieux solides et liquides, tuant C. difficile, ainsi que d'endommager le vinyle 34. En outre, le remplacement régulier des latex ou néoprène peut aussi réduire le risque de contamination. Comme mentionné ci-dessus, en cas de doute, si un organisme est C. difficile ou un contaminant, un test pour la présence du gène de la tdcB utilisant la PCR peut rapidement déterminer si l'organisme est C. Difficile 21. Enfin, si plusieurs organismes à cultiver à l'intérieur de la même chambre anaérobie, il est important de noter que C. difficile peut produire des sous-produits métaboliques (e. G. Sulfure d'hydrogène) qui inhibent la croissance d'autres organismes anaérobies et vice versa.

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Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier Coy laboratoires pour fournir aimablement des photos de la chambre anaérobie. Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé subvention DK087763 (SMM) et un curriculum STEP / HHMI développement de la fraternité (ANE).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Proteose Peptone no. 2 BD 212120
Na2HPO4 Fisher S373
KH2PO4 Fisher BP362
NaCl Fisher S27
MgSO4 (anhydrous) Fisher M65
á´…-Fructose Fisher L96
Sodium taurocholate Sigma T4009
á´…-cycloserine Sigma C6880
Cefoxitin Fluka C4786
Brain heart infusion medium BD 237300
Proteose Peptone BD 211684
(NH4)2SO4 Sigma A5132
Tris base Fisher BP152
Agar BD 214010
L-cysteine Sigma C7755
BactoPeptone BD 211684
Columbian sheep blood agar Fisher L21928
NaCl Fisher S27
KCl Fisher P217
Glycerol Fisher BP2291
Sterile inoculating loops Fisher 22363596
Sterile swabs Fisher 1495990
Coy Vinyl Anaerobic Chamber and Accessories Coy Laboratory Products, Inc Customer Specified These items are custom ordered per laboratory needs
Materials
TCCFA agar

Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g
Na2HPO4 5 g
KH2PO4 1 g
NaCl 2 g
MgSO4 (anhydrous) 0.1 g
Fructose 6 g
Agar 20 g

Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize.

After autoclaving, add:
10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 0.1%)
25 ml of 10 mg/ml á´…-cycloserine, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 250 μg/ml)
1.6 ml of 10 mg/ml cefoxitin, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 16 μg/ml)

BHIS Medium

Brain heart infusion 37 g
Yeast extract 5 g

For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize.

Optional (add after autoclaving):

3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%)
10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate (dissolve in water; final concentration, 0.1%)

SMC Sporulation Medium

BactoPeptone 90 g
Protease peptone 5 g
(NH4)2SO4 1 g
Tris base 1.5 g
Agar 15 g

Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize.

Optional (add after autoclaving):
3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%)

70:30 Medium

BactoPeptone 63 g
Protease peptone 3.5 g
Brain heart infusion 11.1 g
Yeast extract 1.5 g
(NH4)2SO4 0.7 g
Tris base 1.06 g

For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (final concentration, 0.03%).

Blood agar

The use of premade Columbia anaerobic sheep blood agar plates (Fisher Scientific, L21928)35 is recommended.

1X Phosphate buffered saline (PBS)

NaCl 8.01 g
KCl 0.2 g
Na2HPO4 1.44 g
KH2PO4 0.27 g

Bring to 1 L with deionized water and adjust pH to 7.4 with HCl. Filter sterilize before use.

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References

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Edwards, A. N., Suárez, J. M., McBride, S. M. Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment. J. Vis. Exp. (79), e50787, doi:10.3791/50787 (2013).

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