Summary
المطثية العسيرة هي نوع من البكتيريا المسببة للأمراض التي هي احيوائية صارمة ويسبب الإسهال المضادات الحيوية المرتبطة بها (AAD). هنا، طرق عزل، زراعة والحفاظ على C. وصفت الخلايا والجراثيم الخضري صعب. هذه التقنيات يحتم على غرفة اللاهوائية، الأمر الذي يتطلب صيانة دورية لضمان الظروف المناسبة لأفضل C. زراعة صعب.
Abstract
المطثية العسيرة هو، اللاهوائية، البكتيريا إيجابية الجرام مولد الأبواغ التي هي المسؤولة في المقام الأول عن المضادات الحيوية المرتبطة الاسهال (AAD) وهو الممرض المستشفيات كبيرة. C. صعب أمر بالغ الصعوبة لعزل وزراعة وحساس للغاية حتى مستويات منخفضة من الأوكسجين في البيئة. هنا، وأساليب لعزل C. صعب من عينات البراز وزراعة احقا C. يتم عرض صعب لإعداد مخزون الجلسرين للتخزين على المدى الطويل. وكما وصفت تقنيات لإعداد وتعداد الأسهم بوغ في المختبر لمجموعة متنوعة من التطبيقات بما في ذلك المصب المجهري والدراسات على الحيوانات. هذه التقنيات يحتم على غرفة اللاهوائية، والتي تحافظ على البيئة اللاهوائية متسقة لضمان الظروف المناسبة لأفضل C. النمو صعب. نحن نقدم بروتوكولات لنقل المواد داخل وخارج الغرفة دون كاليفورنياباستخدام تلوث الأكسجين كبيرة جنبا إلى جنب مع اقتراحات للصيانة العادية المطلوبة للحفاظ على البيئة اللاهوائية المناسبة لكفاءة ومتسقة C. زراعة صعب.
Introduction
المطثية العسيرة هو، بكتيريا تشكيل بوغ الغرام الإيجابية التي هو احيوائية تلزم والممرض الجهاز الهضمي قاتلة للبشر والحيوانات. وصفت في البداية في عام 1935 كما كائن المتعايشة وجدت في عينات البراز من الأطفال حديثي الولادة 1، C. وقد تجلى صعب في وقت لاحق أن يكون العامل المسبب لالتهاب القولون الغشائي الكاذب المرتبطة العلاج بالمضادات الحيوية 2. C. وعادة ما يسبق الالتهابات صعب (CDI) عن طريق العلاج بالمضادات الحيوية مما يؤدي إلى اختلال النباتات القولون العادية، وخلق مكانة لC. صعب أن تزدهر 2. C. تبث صعب باعتبارها بوغ نائمة من طريق البراز إلى الفم، وتنبت في وقت لاحق داخل القناة الهضمية، وإنتاج الخلايا النباتية قادرة على توليد العديد من السموم وتسبب أمراض شديدة والتهاب القولون 3. CDI غالبا ما تكون العلاجات التقليدية لصهر وهذه فيوكثيرا ما تكرر ذكر fections 4. ونتيجة لذلك، CDI هي مسؤولة عن ما يصل إلى 4.8 مليار دولار في تكاليف الرعاية الصحية في الولايات المتحدة الأمريكية 5-7.
C. صعب حساس جدا لحتى مستويات منخفضة من الأوكسجين في البيئة. لC. صعب أن تستمر في البيئة وأن تنتقل بكفاءة من المضيف إلى المضيف، وتشكيل بوغ غير نشط أيضي حرجة 8. لأن صيانة المختبرات والتلاعب C. يتطلب صعب بيئة اللاهوائية التي تسيطر عليها، هذه التقنيات تتطلب استخدام حجرة اللاهوائية. وقد أدى استخدام غرف اللاهوائية في زيادة الانتعاش والعزلة من اللاهوائيات تلزم 9-11، وسمحت لعدد من التقنيات الجزيئية التي يتعين القيام بها في جو اللاهوائية.
بالإضافة إلى C. صعب، واستخدام غرفة اللاهوائية والصيانة وصفها هنا قابلة للتطبيقلاللاهوائيات تلزم أخرى مثل الأنواع الأخرى اللاهوائية (مثل المطثية الحاطمة)، والأنواع الأخرى الهضمي (مثل الأنواع باكتيرويديز 12) ومسببات الأمراض اللثة (مثل الأنواع الهضمونية العقدية 13).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: C. صعب هو الممرض الإنسان والحيوان التي يمكن أن تسبب أمراض الجهاز الهضمي. التجارب التي تنطوي على C. صعب يجب القيام بها مع احتياطات السلامة الأحيائية المناسبة (BSL-2).
1. اللاهوائية غرفة الاستخدام والصيانة
C. صعب هو احيوائية صارمة وحساسة للغاية حتى تركيزات منخفضة من الأوكسجين في الغلاف الجوي. وبالتالي، هناك حاجة إلى والبيئة اللاهوائية الخاضعة للرقابة لمعالجة ناجحة. استخدام حجرة اللاهوائية (الشكل 1A) يوفر البيئة الأكثر استقرارا وظروفا مثالية لزراعة الفعال C. صعب والبكتيريا اللاهوائية الأخرى 14. هنا، جو تحتوي على خليط الغاز (5٪ CO 2، 10٪ H 2، 85٪ N 2) يمكن الحفاظ على ثابت.
لإدخال أي سلع في غرفة دون تلوث الأوكسجين كبيرة،يجب استخدام غرفة معادلة الضغط (الشكل 1B). وظائف هذا الجهاز بمثابة تبادل الغاز، وتعمل تلقائيا، وشبه يدويا أو يدويا. غرفة معادلة الضغط لديها اثنين من الأبواب: واحد توفير الوصول إلى خارج غرفة معادلة الضغط، والآخر توفير سبل الوصول إلى المناطق الداخلية من غرفة اللاهوائية. اعتمادا على نموذج، قد يكون باب غرفة معادلة الضغط إضافية، والتي يمكن أن توفر إمكانية الوصول إلى الغرفة المجاورة اللاهوائية، وبالتالي توفير تكلفة غرفة معادلة الضغط منفصلة. ما لم تتحرك بنشاط العناصر داخل أو خارج الغرفة، يجب أن تبقى كل الأبواب مغلقة في جميع الأوقات لتجنب تلوث الأوكسجين. غرفة معادلة الضغط تمتلك مفتاح تشغيل / إيقاف على الجبهة وتحتوي على أربعة أزرار لوحة. يتم توصيل خطوط الغاز وفراغ خرطوم مضخة في الجزء الخلفي من غرفة معادلة الضغط، بالقرب من لوحة حيث توجد مفاتيح لتشغيل اليدوي الكامل للوحدة. من المستحسن أن دورتين تطهير، وذلك باستخدام غاز النيتروجين (N 2)، وتستخدم قبل ملء تبادل مع مزيج الغاز (5٪ CO 2، 10٪ H 2، 85٪ N 2) للحد من كمية الأوكسجين التي أدخلت على الغرفة. ومن المهم أيضا أن لا يترك الباب مفتوحا إما لفترة أطول من الوقت المبلغ المطلوب لنقل العناصر داخل وخارج للتبادل و تخطط بعناية التجارب للحد من وتيرة نقل العناصر داخل وخارج القاعة. وترد أدناه الإجراءات التشغيلية المختلفة للغرف الفينيل اللاهوائية. قبل اتباع هذه البروتوكولات، وضمان أن هذه هي متوافقة مع تعليمات الشركة المصنعة قدمت مع الغرفة.
- الوضع التلقائي
هذا هو وضع برمجة وقابلة للتخصيص، ويتم تنفيذها بالكامل من قبل غرفة معادلة الضغط. لبرمجة القفل، راجع إرشادات الشركة المصنعة. برنامج الموصى بها للدخول إلى غرفة نموذجية تتضمن دورتين تطهير باستخدام غاز النيتروجين تليها إعادة تعبئة غرفة معادلة الضغط مع مزيج الغاز الذي يطابق عن كثب أجواء المحافظة داخل شامالبر. خلال كل دورة فراغ، وإجراءات مصنع القياسية أقترح سحب فراغ إلى 20 بوصة زئبقية وتطهير إلى 1 زئبقية.- تأكد من أن باب غرفة معادلة الضغط الداخلي مغلقة تماما.
- فتح باب غرفة معادلة الضغط الخارجي.
- وضع العناصر في غرفة معادلة الضغط وإغلاق باب غرفة معادلة الضغط الخارجي. إذا إدخال السوائل، فك القبعات في منتصف الطريق لضمان كفاءة تبادل الغازات. يجب فتح الطرود والحاويات مختومة قبل بداية الدورة؛ الامتناع عن القيام بذلك قد تشوه وتلف بلستيكور والحاويات. للحفاظ على العقم، وفتح الحزم بما يكفي للسماح فقط تبادل الغازات كفاءة.
- اضغط على زر ابدأ.
- الانتظار حتى تدوير غرفة معادلة الضغط من خلال البرنامج والعرض يقرأ "اللاهوائي".
- فتح باب غرفة معادلة الضغط الداخلي.
- نقل العناصر إلى غرفة.
- إغلاق الباب الداخلي.
- الوضع شبه اليدوي
هذا الوضع يمكن استخدامها عند نقل العناصر داخل أو خارج الغرفة وعند الضرورة جycling الغاز داخل غرفة هو مطلوب.- تأكد من أن باب غرفة معادلة الضغط الداخلي مغلقة تماما.
- فتح باب غرفة معادلة الضغط الخارجي.
- وضع العناصر في غرفة معادلة الضغط وإغلاق باب غرفة معادلة الضغط الخارجي. إذا إدخال السوائل، فك القبعات في منتصف الطريق لضمان كفاءة تبادل الغازات. حزم مختومة، مثل بتلقيح الحلقات و96 لوحات جيدا، يجب فتح قبل بداية الدورة.
- اضغط على القائمة.
- ابدأ الصحافة. فإن كوة عرض وظيفة كل زر ولن تستجيب حتى يتم الانتهاء من هذه:
- يصل السهم: ينشط مضخة فراغ.
- السهم للأسفل: يبدأ النيتروجين (تطهير) تدفق الغاز.
- بدء: يبدأ تدفق الغاز المزيج.
- القائمة: العودة إلى العرض الافتراضي.
- اضغط على "أعلى"، إزالة الغاز من غرفة معادلة الضغط، حتى يقرأ العرض 20 بوصة زئبقية.
- اضغط على "داون" ملء غرفة معادلة الضغط مع النيتروجين، حتى يقرأ العرض أقل من 1 بوصة زئبقية. لا اوفershoot، حيث سيؤدي ذلك إلى خلق ضغط إيجابي داخل غرفة معادلة الضغط، والتي قد تؤثر على سلامتها.
- كرر الخطوات 6 و 7 لإجراء دورة تطهير إضافية.
- اضغط على "أعلى" حتى يقرأ العرض 20 بوصة زئبقية.
- اضغط على "ابدأ"، وملء التبادل مع مزيج الغاز، حتى يقرأ العرض أقل من 1 بوصة زئبقية.
- فتح باب غرفة معادلة الضغط الداخلي.
- نقل العناصر إلى غرفة.
- إغلاق الباب الداخلي.
- دليل الوضع
هذا الوضع يمكن استخدامها كلما وسائط التلقائي أو شبه دليل لا تعمل أو ليس هناك سلطة لغرفة معادلة الضغط. هذا الوضع لا يعمل عندما غرفة معادلة الضغط على، وبالتالي، فإنه من الصعب تحديد الضغط داخل غرفة معادلة الضغط. لأن الفراغ سحب والأوقات تطهير الغاز تعتمد على معدلات فراغ وتدفق الغاز على التوالي، مطلوب استخدام مقياس الضغط داخل تبادل لمراقبة الضغط ويقلل من خطر الإصابة الشخصية والأضرار التي لحقت غرفة معادلة الضغط.- تأكد من أن باب غرفة معادلة الضغط الداخلي مغلقة تماما.
- فتح باب غرفة معادلة الضغط الخارجي.
- وضع العناصر، بما في ذلك قياس الضغط، في غرفة معادلة الضغط وإغلاق الباب غرفة معادلة الضغط الخارجي. إذا إدخال السوائل، فك القبعات في منتصف الطريق لضمان كفاءة تبادل الغازات. حزم مختومة، مثل بتلقيح الحلقات و96 لوحات جيدا، يجب فتح قبل بداية الدورة.
- حدد موقع مفاتيح ثلاثة على الجزء الخلفي من غرفة معادلة الضغط المسمى "مفاتيح التحكم اليدوي". وصفت هذه بشكل فردي على النحو التالي:
- إلى فراغ
- نتروجين
- ميكس الغاز
- الوجه التحول إلى تبديل فراغ حتى يقرأ مقياس الضغط ما يقرب من 20 بوصة زئبقية.
- الوجه التبديل تبديل النيتروجين حتى يقرأ قياس الضغط حوالي 1 بوصة زئبقية.
- الوجه التحول إلى تبديل فراغ حتى يقرأ مقياس الضغط ما يقرب من 20 بوصة زئبقية.
- الوجه التبديل تبديل النيتروجين حتى يقرأ قياس الضغط حوالي 1 بوصة زئبقية.
- الوجه التحول إلى تبديل فراغ حتى يقرأ مقياس الضغط ما يقرب من 20 بوصة زئبقية.
- الوجه التبديل تبديل الغاز ميكس حتى يقرأ قياس الضغط حوالي 1 بوصة زئبقية.
- فتح باب غرفة معادلة الضغط الداخلي.
- نقل العناصر إلى غرفة.
- إغلاق الباب الداخلي.
2. زراعة، تعداد وتخزين C. صعب من عينات البراز
تم تصميم هذا الإجراء لاسترداد C. صعب من عينات البراز التي تحتوي على الجراثيم والحفاظ على احقا مستعمرات منعزلة الخلايا النباتية أو الجراثيم في التخزين على المدى الطويل كما أسهم الجلسرين. بدلا من ذلك، يمكن استخدام هذا الإجراء لتعداد عدد من C. الحاضر صعب في عينات البراز (مثل من الدراسات على الحيوانات). لإثراء انتقائي وبشكل مختلف عن C. صعب، ويستخدم توروكولات-سيفوكسيتين-سيكلوسيرين الفركتوز أجار (TCCFA) لمنع نمو النباتات البراز العادي 15-16. سيكلوسيرين هو جراثيم للبكتيريا سالبة الجرام، في حين سيفوكسيتين يمنع بشكل أوسع نمو البكتيريا سالبة الجرام على حد سواء وإيجابية، باستثناء C. صعب ومعظم سلالات المكورات دخول. مؤشر الرقم الهيدروجيني، أحمر محايدة، يمكن تضمينها في المتوسط، كما تخمير الفركتوز سينتج عنه انخفاض في درجة الحموضة وتغيير لون اللاحقة من أحمر / البرتقالي إلى الأصفر. لاستعادة كفاءة أبواغ C. صعب كما البكتيريا الخضري، يتم استخدام الملح الصفراوية توروكولات الصوديوم للحث على إنبات 17-18. لأن C. صعب تشكل جراثيم، والكحول أو المعالجة الحرارية للعينات التي يمكن استخدامها لخفض أو القضاء على الخلايا النباتية، والحد من نمو النباتات الملوثة، والتي قد تزيد من كفاءة C. انتعاش صعب 19. كما ذكر أعلاه، فإن من الأهمية بمكان لمرحلة ما قبل خفض جميع لوحات لمدة 1-2 على الأقل ساعة في غرفة اللاهوائية قبل استخدامها لضمان إزالة الأكسجين المتبقية. تحفيف الهواءنانوغرام لوحات قبل استخدامها في غرفة يمكن أن تقلل من التكثيف. متوسطة السائل قد تحتاج ما يصل الى 24 ساعة للحد اعتمادا على حجم ونسبة السطح إلى الجو من الحاويات المستخدمة.
قبل البداية، يجب وضع العناصر التالية في غرفة اللاهوائية:
- عينة البراز
- مسحات معقمة
- حلقات بتلقيح العقيمة
- برنامج تلفزيوني 1X (انظر المواد)
- لوحات TCCFA (انظر المواد)
- BHIS (الدماغ القلب تسريب المتوسطة مع خلاصة الخميرة) لوحات ومرق (انظر المواد)
- 50٪ الجلسرين (تعقيمها)
- 10٪ L-السيستين (تعقيمها)
- قارورة التخزين المبردة
* بدلا من ذلك، مستعمرات معزولة يمكن أن ينتشر على لوحات أجار BHIS، وبعد ذلك كشطت ومعلق في BHIS المتوسطة السائل مع 15٪ الجلسرين للتخزين الطويل الأجل في -80 درجة مئوية. ** ومن المهم أن نلاحظ أن الجرام تلطيخ ليس استراتيجية فعالة لتحديد C. صعب مباشرة من عينات البراز 23 C. صعب يجب أولا أن تكون معزولة من النباتات الأخرى الموجودة في البراز.
- resuspend وعينة البراز في برنامج تلفزيوني 1X (و يمكن أن يؤديها في الظروف الهوائية)، والتأكد من أن عينة البراز هو معلق بشكل كامل في برنامج تلفزيوني 1X من قبل vortexing. إذا تعداد C. صعب من البراز، وتزن عينة البراز قبل إضافة برنامج تلفزيوني 1X.
- جعل التخفيفات التسلسلي للعينة البراز معلق في برنامج تلفزيوني 1X لعزل أو التعداد المناسب من الوحدات المكونة للمستعمرة (كفو) لكل غرام من البراز.
- باستخدام تقنية العقيم، وتطبيق 100 ميكرولتر من كل تخفيف المسلسل لوحات TCCFA.
- باستخدام سلسلة من حلقات بتلقيح العقيمة، خط ثقافة بطلب للحصول على مستعمرات معزولة أو بالتساوي نشر ثقافة تطبيقها على سطح لوحة TCCFA لتعداد المستعمرات.
- احتضان لوحة هوائيا لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية. فمن الممكن لكشف وتحديد C. المستعمرات صعب في غضون 24 ساعة على أساسالشقة، وعدم انتظام، ومظهر من الزجاج الأرضي من المستعمرات 15، على الرغم من أن يتحقق تحديد أكثر دقة والتعداد بعد 48 ساعة.
- باستخدام حلقات بتلقيح العقيمة، أي ثقافة فرعية المستعمرات التي تبدو C. صعب على انخفاض قبل لوحات أجار BHIS، على أن تستكمل مع 0.03٪ L-السيستين 20. اختيار مستعمرة الفردية، ومسحة على لوحة في الأرباع، وذلك باستخدام حلقة عقيمة بتلقيح جديدة لكل رباعي، للحصول على مستعمرات معزولة. بدلا من ذلك، عد C. المستعمرات صعب من كل تخفيف (و يمكن أن يؤديها في الظروف الهوائية)، وحساب عدد مستعمرة لكل جرام من عينة البراز.
- تأكيد C. تحديد العسيرة عبر الجرام تلطيخ. بعد الجرام تلطيخ، C. ستظهر صعب كما قضبان الأرجواني وربما تحتوي على بعض الخلايا الأبواغ المحطة. سلسلة تفاعل البلمرة (PCR) وتحديد الجينات التي تكود السم B قد توفر مزيد من التأكيد منتسمم سلالات من C. صعب 21 بينما الكتابة تسلسل multilocus (MLST) ناجحا لتحديد والكتابة دقيقة من سلالات غير معروفة وnontoxigenic من C. صعب 22.
- للحفاظ على المخزون من C. صعب في -80 درجة مئوية، واختيار الفرد، مستعمرة معزولة من لوحة BHIS أجار باستخدام بتلقيح حلقة عقيمة و resuspend مستعمرة في 10 مل من تخفيض قبل BHIS المتوسطة السائل تستكمل مع 0.03٪ L-السيستين. *
- احتضان بين عشية وضحاها لا هوائيا في 37 درجة مئوية، أو حتى يصبح ثقافة عكر.
- إضافة 333 ميكرولتر من الجلسرين 50٪ و 666 ميكرولتر من C. ثقافة صعب إلى 1.8 مل أنبوب المبردة لإنشاء 15٪ من الأسهم الجلسرين سلالة معزولة.
- الغطاء بإحكام أنبوب المبردة، وتخلط جيدا وعلى الفور بإزالة الأوراق المالية من غرفة اللاهوائية ومكان في الفريزر -80 ° C لتخزين على المدى الطويل.
3. زراعة C. صعب
يوفر هذا الإجراء لاسترداد C. صعب من المخزونات الجلسرين تخزينها في -80 درجة مئوية. لأن تكرار تجميد أذاب دورات قد قتل الخلايا الخضرية، فمن المهم للحفاظ على مخزون الجلسرين المجمدة في جميع الأوقات. نحن لا ننصح استخدام الثلج الجاف لنقل سلالات داخل وخارج الغرفة كما تبخر الثلج الجاف يمكن تغيير البيئة داخل الغرفة. بدلا من ذلك، نوصي باستخدام رفوف التبريد المجمدة للحفاظ على مخزون الجلسرين المجمدة أثناء النقل. لمختلف أغراض انتقائية والتفضيلية، وتستخدم عادة ثلاثة وسائل الإعلام لزراعة C. صعب. TCCFA، كما نوقش أعلاه، هو انتقائية لC. صعب ويحتوي توروكولات الصوديوم، وهو germinant. ضخ القلب الدماغ تستكمل مع خلاصة الخميرة (BHIS) هي التي يشيع استخدامها، مما أثرى والمتوسطة غير انتقائي الذي يسمح لنمو مجموعة واسعة من الكائنات الحية (الشكل 2A) 24. في كثير من الأحيان، L-سياستينيضاف إلى البريد BHIS كعامل مختزل 20. أخيرا، إضافة الدم إلى المتوسطة (الشكل 2B) يسمح للتبوغ أكثر كفاءة من على TCCFA ويوفر للكشف عن مضان مخضر أو أخضر مصفر الفريدة التي أظهرتها C. صعب في ظل موجة طويلة للأشعة فوق البنفسجية (UV) ضوء 15 (الشكل 2C). عندما زرع C. صعب من المخزونات بوغ، فمن الأهمية بمكان أن نتذكر يجب أن يضاف أن توروكولات الصوديوم إلى المتوسطة لضمان الإنبات.
قبل البداية، يجب وضع العناصر التالية في غرفة اللاهوائية:
- الأسهم الجلسرين المجمدة (في رف التبريد)
- حلقات بتلقيح العقيمة
- TCCFA أو BHIS لوحات (انظر المواد)
- BHIS مرق (انظر المواد)
- 50٪ الجلسرين (تعقيمها)
- قارورة التخزين المبردة
- وضع المخزون الجلسرين المجمدة من C. صعب في رفوف التبريد التي تم تخزينها في -80 درجة مئوية العلاقات العامةIOR لاستخدامها لمنع ذوبان الجليد.
- إحضار الأوراق المالية الجلسرين المجمدة على الثلج الجاف في غرفة اللاهوائية.
- باستخدام تقنية معقمة وعقيمة بتلقيح حلقة، ضع كمية صغيرة من الأسهم على لوحة واحدة متتالية عبر رباعي من لوحة.
- تدوير لوحة 90 درجة و، وذلك باستخدام العقيمة بتلقيح حلقة جديدة، والاستمرار في خط عبر رباعي الثاني.
- تكرار لالأرباع الثالثة والرابعة لضمان عزل المستعمرات الفردية.
- على الفور إزالة الأسهم الجلسرين المجمدة من الغرفة اللاهوائية والعودة إلى -80 درجة مئوية.
- احتضان لوحة هوائيا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. ينبغي مراعاة المستعمرات المعزولة الفردية بعد نمو بين عشية وضحاها.
4. تنقية الجراثيم من C. صعب
كما هو مطلوب تبوغ من أجل البقاء في بيئات الغني بالأكسجين وفعالة لنقل المرض 8، وإعداد مخزونات بوغ هو ofteن اللازمة للتطبيقات المصب، لا تقتصر على الدراسات المجهري والحيوانات. من المهم أن نلاحظ أن تعداد الجراثيم ويتطلب التكرار لضمان استنساخ التهم الموجهة إليه. pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات بين التخفيفات أيضا يقلل من فقدان منذ جراثيم التمسك البلاستيك أيضا.
تبوغ من C. صعب ليس السريع كما متجانسة أو كأنواع مولد الأبواغ الأخرى. لتحسين إنتاج بوغ والانتعاش، فمن المستحسن إما تبوغ متوسطة (SMC) 17،25 أو 26 70:30 المتوسطة. وسائل الإعلام الأخرى المستخدمة شيوعا هي BHIS، الأمر الذي يتطلب 4-5 أيام من النمو قبل أن ينظر تبوغ كفاءة 27، وClospore، وسيلة السائل الذي ينتج التتر عالية من الجراثيم (10 يوليو - 10 أغسطس الجراثيم في الملليمتر الواحد) بعد 72 ساعة من النمو. البروتوكولات الأخرى استخدام الماء المثلج بدلا من برنامج تلفزيوني 1X 20، إلا أن استخدام محلول متساوي التوتر يمكن أن تقلل من الجراثيم من الالتصاق على كل الأسطح الأخرى والبلاستيك. بدلا من ذلك،بعض المحققين المزيد من تنقية الجراثيم وذلك باستخدام التدرج السكروز لإزالة بالكامل الخلايا النباتية والحطام 29.
قبل البداية، يجب وضع العناصر التالية في غرفة اللاهوائية:
- حلقات بتلقيح العقيمة
- BHIS، SMC و / أو 70:30 لوحات (انظر المواد)
- BHIS مرق (انظر المواد)
- فلتر تعقيم-1X PBS، (انظر المواد)
- سلالات الثقافة من الأسهم المجمدة الجلسرين على انخفاض قبل وحات BHIS واحتضان بين عشية وضحاها لا هوائيا في 37 درجة مئوية.
- Restreak على عدة خفضت قبل SMC أو 70:30 لوحات واحتضان هوائيا في 37 درجة مئوية لمدة 24-48 ساعة. يمكن أن يتبع تشكيل بوغ عبر النقيض من المرحلة المجهري. سوف تظهر أبواغ سوف المرحلة بينما مشرق الخضري والخلايا الأم تظهر مرحلة مظلمة. * وكبديل لذلك، جراثيم يمكن تنقيته من 70:30 المتوسطة السائل بعد 24-48 ساعة، والتي ينتج 10 -10 5 6 الجراثيم في الملليمتر الواحد، اعتمادا على الاجهاداستخدام ن.
- باستخدام حلقة عقيمة بتلقيح، كشط لوحات و resuspend الخلايا في 10 مل العقيمة برنامج تلفزيوني 1X.
- تجاهل لوحات وإزالة الجراثيم تعليق من غرفة اللاهوائية. بيليه الخلايا في 3،000 x ج لمدة 15 دقيقة. غسل الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني 1X، إعادة التعليق الكامل لبيليه خلية في كل مرة.
- احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية للمساعدة في تحلل من الخضري والخلايا الأم.
- احتضان عند 70 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لقتل أي خلايا الخضري المتبقية.
- لتحديد مستعمرة (كفو) في الملليمتر الواحد، وتمييع متسلسل لكل إعداد بوغ في برنامج تلفزيوني 1X وعلى لوحة BHIS + 0.1٪ توروكولات الصوديوم. احتضان لوحات مدة لا تقل عن 24 ساعة قبل تعداد المستعمرات.
- ويمكن تخزين جراثيم في برنامج تلفزيوني 1X في درجة حرارة الغرفة أو إما 4 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل. إذا تخزينها في 4 درجة مئوية، قد يكون من المفيد لتسخين إعداد بوغ في 55 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لاستعادة كفاءة الإنبات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مثال على C. صعب نمت على BHIS وكولومبيا اللاهوائية الأغنام وسائل الإعلام أجار الدم يمكن أن ينظر إليه في الشكل 2. C. صعب تشكل مستعمرات غير النظامية التي هي شقة وتمتلك مظهر من الزجاج الأرضي الذي هو واضح على كل وسائل الإعلام. هنا، وهو عزل السريرية للC. الحساسة للالاريثروميسين صعب، 630E 30، ويزرع على BHIS أجار، وهو المخصب والمتوسطة غير انتقائية، لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية (الشكل 2A). تظهر المستعمرات في كولومبيا اللاهوائية الأغنام أجار الدم مماثلة لتلك التي نمت على BHIS تحت الضوء الأبيض (الشكل 2B)، إلا أن استخدام هذه الوسيلة يوفر أيضا للكشف عن مضان مخضر أو أخضر مصفر التي أظهرتها C. صعب في ظل موجة طويلة للأشعة فوق البنفسجية (UV) ضوء 15 (الشكل 2C). C. المستعمرات صعب على TCCFA أجار مشابها للنمو في BHIS أجار. بسبب وجود اثنين من المضادات الحيوية في TCCFA المتوسطة، تيم(ه) من فترة النمو 48 ساعة ضروري قبل تعداد المستعمرات.
الشكل 1. وكوي معامل نوع C الفينيل غرفة ومكوناته. (A) A كوي معامل نوع C الفينيل الغرفة التي توفر مساحة عمل لفرد واحد في وقت واحد (42 بوصة × 32 بوصة). أنه يحتوي على مروحة مربع محفز (الزاوية الظهير الايسر) الذي يدور مع ارتفاع درجات الحرارة والهواء، ويحمل Stak الباكستانية يحتوي على محفز البلاديوم اللازمة للحد من أي تلوث الأوكسجين. (ب) يقدم غرفة معادلة الضغط باعتبارها التبادل ويوفر آلية لنقل المواد داخل وخارج الغرفة في حين منع تلوث الأكسجين كبيرة داخل البيئة اللاهوائية. غرفة معادلة الضغط لديها اثنين من الأبواب: واحد توفير الوصول إلى خارج غرفة معادلة الضغط، والآخر توفير سبل الوصول إلى المناطق الداخلية من ال ه غرفة اللاهوائية. غرفة معادلة الضغط هو برمجة ويسمح لدورات مخصصة للدخول إلى الغرفة. فمن قابلة للتشغيل في وسائط التلقائي، وشبه دليل ودليل. (C) المرفقة، يتم توفير قفازات اللاتكس المرنة التي تسمح مجموعة كاملة من الحركة والوصول إلى داخل الغرفة. يتم تأمين القفازات لصفعة المتخصصة تعلق على الأكمام مع الفينيل الفينيل لاصقة، والسماح استبدال القفازات دون تعطيل الجو اللاهوائي للغرفة. قفازات النيوبرين وتتوفر أيضا. (D) ومحلل الغاز موديل 10 تراقب باستمرار كل من الأكسجين والهيدروجين مستويات توفير قراءات لحظية من الغلاف الجوي داخل الغرفة. يسمح هذا وحدة للتنبيهات فورية في حال حدوث تسرب، يتم استخدام مزيج الغاز غير صحيحة أو مشاكل إضافية تنشأ عن طريق إنذار مسموعة وضوء وامض LED.
ig2.jpg "/>
الشكل 2. ظهور C. المستعمرات صعب على وسائل الإعلام المختلفة. السمة مسطحة، وعدم انتظام، ومظهر من الزجاج الأرض هو واضح مع عزل السريرية C. الحساسة للالاريثروميسين صعب، 630E 30، ونمت على BHIS أجار لمدة 24 ساعة (A) وكولومبيا اللاهوائية الأغنام أجار الدم لمدة 48 ساعة تحت ضوء أبيض (B) والأشعة فوق البنفسجية طويلة الموجة (C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الأساليب المذكورة هنا يسمح للانتعاش بسيط وسريع للC. صعب من مجموعة متنوعة من عينات البراز، بما في ذلك البشر والفئران والهامستر، فضلا عن التخزين الطويل الأمد للC. صعب كما الجلسرين أو بوغ الأسهم. C. صعب يمكن أن يكون كائن من الصعب زراعة، ولكن صيانة حذرا من بيئة اللاهوائية وتطبيق تقنيات العقيم يمكن أن توفر لتحقيق نمو قوي والحد من التلوث.
غرف اللاهوائية: اعتبارات والصيانة
هناك نوعان من غرف اللاهوائية: غرف جامدة أو دوائر الفينيل. تكون عادة مصنوعة من الألمنيوم الغرف جامدة أو جامدة البوليمر (على سبيل المثال زجاجي أو المواد الاكريليك)، مما يتيح استخدام المواد الكيميائية الكاوية. ويمكن تحويل غرف جامدة إلى نمط gloveless وأقل عرضة للثقوب، ولكن التسريبات التي يصعب كشفها والعثور على والغرف جامدة تتطلب بعض الطرق لتعويض عن تشريد الغاز أثناء الاستخدام. غالبا ما يتم تجهيز وحدات البوليمر مع غرفة معادلة الضغط، تطهير فقط، والتي قد تكلف أكثر للعمل. لصيانة شروط صارمة في الغلاف الجوي، والتكلفة، والمرونة، ومتطلبات مساحة المختبر وسهولة الصيانة، وينصح غرف الفينيل اللاهوائية (كوي مختبر المنتجات، الشكل 1A). وتتألف هذه القاعة اللاهوائي للمربع الفينيل القفازات التي تدعمها بنية الألومنيوم أنبوبي وهذا مرتبط إلى غرفة معادلة الضغط الذي يعمل بمثابة تبادل لنقل المواد داخل وخارج الغرفة (الشكل 1B)، وذلك باستخدام قفازات اللاتكس أو النيوبرين تعلق على الأكمام الفينيل (الشكل 1C). من المهم أن تتبع بدقة تعليمات الشركة الصانعة لانشاء السليم للغرفة اللاهوائية. قد يكون مع واحد التحكم في درجة حرارته (أو أكثر، اعتمادا على حجم غرفة) وحدات مربع سخان والتي توفر دوران الهواء من خلال محفز البلاديوم. كاليفورنيا البلاديوميخدم talyst للحد من تلوث الأكسجين قدم من خلال التبادل من خلال تحويل الهيدروجين والأكسجين في الماء. من الناحية المثالية، ويتم رصد كل من الأكسجين والهيدروجين مستويات باستخدام محلل الغاز (الشكل 1D)، وعرض تركيز الأكسجين في أجزاء في المليون (جزء في المليون) وتركيز الهيدروجين كنسبة مئوية.
وسائل الإعلام السائلة والصلبة وينبغي قبل تخفيض في غرفة اللاهوائية قبل الاستخدام. أطباق بتري (100 ملم في القطر) ويمكن تخفيض لساعتين فقط قبل استخدامها 31، ولكن وسائل الاعلام السائل ينبغي خفض بين عشية وضحاها. الأهم من ذلك، يجب أن تبرد وسائل الإعلام قبل نقلها الى غرفة لمنع وامض السائل خلال غرفة معادلة الضغط الإخلاء. المواد الاستهلاكية البلاستيكية، مثل لوحات 96 بشكل جيد، يجب أن تكون مرحلة ما قبل خفض بين عشية وضحاها قبل الاستخدام، كما هو البلاستيكية التي يسهل اختراقها ويمكن تخزين جزيئات الأكسجين 32. اعتمادا على التطبيق، وبعض المواد البلاستيكية يجب قبل تخفيض لمدة تصل إلى 48 ساعة قبل الاستخدام 33. نفايات بيولوجية يجب به التخلص منها بشكل مناسب. يجوز إبقاء حقيبة واقية صغيرة داخل الغرفة، ولكن يجب أن يتم استبدال كثير من الأحيان.
يجب الحفاظ على تركيز الهيدروجين من 3٪ على الأقل داخل الغرفة، حيث سيؤدي ذلك إلى ضمان نمو جيدة سواء من C. إزالة الأكسجين صعب وكفاءة. في حالة انخفاض تركيز الهيدروجين أقل من 3٪ أو إذا لم تستخدم الغرفة لعدة أيام، يجب أن يتم تنفيذ دورة الغرفة لاستعادة تركيز الهيدروجين إلى المستويات المرغوب فيها. هنا، يتم بالمكنسة الكهربائية ما يقارب ثلث الغاز في غرفة بها (لن مربع الفينيل تنكمش بشكل ملحوظ) واستبدالها مع مزيج الغاز الطازجة. تأكد من أن القفل هو اللاهوائية قبل البدء. ضخ الكثير من الغاز في غرفة يجب تجنبها، وهذا يضع ليس فقط التوتر لا داعي لها على حقيبة الفينيل، ولكن أيضا سوف يمنع المستخدم من الوصول إلى الجزء الخلفي من الغرفة. تنفيذ هذا الإجراء دائما في منطقة جيدة التهوية. اتخاذ احتياطات إضافية إذا كان تشايتم الاحتفاظ mber في غرفة صغيرة سيئة التهوية. فتح أي الأبواب أمام الغرفة مع محتويات الغاز داخل غرفة يمكن خنق المستخدم.
وتشمل صيانة إضافية تجديد المحفز البلاديوم لضمان إزالة الأكسجين كفاءة داخل الغرفة. كما يتم تخفيض الأكسجين والهيدروجين من قبل محفز، يمكن أن تتراكم المياه على سطح الكريات الألمنيوم المغطاة البلاديوم، والحد من فعاليتها مع مرور الوقت. للتغلب على هذا، يجب إعادة إنشاء المحفزات البلاديوم مرة واحدة على الأقل في الأسبوع من قبل الخبز 230 ° م على الأقل لمدة ساعة واحدة. بالإضافة إلى ذلك، نتيجة لتخفيض كل من الأكسجين وتبخر الماء من لوحات ووسائل الإعلام، وتراكم المياه هي قضية مشتركة داخل غرف اللاهوائية. لضمان راحة التلاعب وزيادة نصف العمر للمعدات داخل غرفة، ويمكن استخدام حزم المجففة، ولكن ينبغي أن جفت في كثير من الأحيان باتباع نفس الإجراء المتبع لمحفزات البلاديوم. بدلا من ذلك، ديويمكن استخدام المرطب الذي يدور الهواء من خلال كتلة المعدنية التي المتكثفات والمياه التي يتم جمعها في وعاء. الجهاز يمنع تجاوز من حاويات الماء، ولكن يجب أن تراقب مزيلات الرطوبة، وينبغي أن يتم تفريغ الحاويات عندما يكون قريبا من الكامل. لتنظيف الغرفة الفينيل، وينصح استخدام قطعة قماش ناعمة وأي منظف المتاحة تجاريا أوصت لالبولي فينيل كلورايد (PVC) (مثل البلاستيك ماجيك الأنظف، جزء لا. 1600480، مختبرات كوي). لتجنب خدش أو إتلاف غرفة الفينيل، لا تستخدم المناشف الورقية، كيم مناديل أو المنتجات التي تحتوي على الكيتونات أو مركبات أخرى من شأنها أن تلحق الضرر PVC.
أخيرا، C. صعب تنتج غاز كبريتيد الهيدروجين (H 2 S)، والذي هو رد الفعل للغاية وقابلة للتآكل. كبريتيد الهيدروجين يمكن أن يكون مدمرا للأجهزة، وحافزا البلاديوم وأي المعادن المكشوفة. إذا كان ذلك ممكنا، لا تترك أي الأجهزة، مثل المجانسة وطيفي، في chambإيه لفترات طويلة من الأوقات لتجنب التآكل الناجم عن كبريتيد الهيدروجين. بسبب إنتاج كبريتيد الهيدروجين، ومواد مثل حافزا البلاديوم والغاز محلل تحتاج إلى استبدالها بشكل دوري كجزء من صيانة غرفة العادية. بدائل للحد من مستويات كبريتيد الهيدروجين داخل الغرفة، مثل استخدام الفحم المنشط، خلات الرصاص، كلوريد الفضة أو الفضة أو كبريتات لاستيعاب كيميائيا إزالة كبريتيد الهيدروجين، وقد وصفت 34 ويمكن استخدام لإبطاء التآكل من المعدات.
الاحتياطات الإضافية
أبدا فتح باب واحد للغرفة معادلة الضغط دون التأكد من أن الباب الآخر مغلق ومقفل لمنع تلوث الأوكسجين. بالإضافة إلى ذلك، وتجنب استخدام أدوات حادة داخل غرفة للحد من خطر ثقب الفينيل.
من المهم أن نلاحظ أن الهيدروجين هو غاز قابل للاشتعال في وجود الأكسجين. أخذ الحذر عند إدخال العناصر طn لغرفة أن مستويات عالية من تلوث الأكسجين لا تحدث (أكبر من 999 جزء في المليون). من المهم أن تستخدم فقط غير قابل للاشتعال خلط مزيج الغاز اللاهوائية وعن كثب رصد محلل الغاز داخل غرفة، وخاصة عند استخدام خزان غاز جديدة. إذا تحدث كل من الهيدروجين والاوكسجين تركيز فوق 4٪، تأكد من أن إجراءات الطوارئ المناسبة، والتي ينبغي أن تكون الخطوط العريضة في إجراءات التشغيل القياسية المختبر (SOP)، ويلي.
استكشاف الأخطاء وإصلاحها C. النمو صعب
إذا ضعف النمو من C. ويلاحظ الثقافات صعب في المتوسطة الغنية، وهذا هو في معظم الأحيان بسبب تلوث الأكسجين داخل غرفة. إضافة عامل مختزل (مثل L-السيستين أو thioglycolate) إلى وسيلة قد يحسن النمو، ومع ذلك، سوف تحتاج قضية تلوث الأكسجين داخل غرفة لمعالجتها. رصد مستويات الأوكسجين والهيدروجين داخل غرفة باستخدام محلل الغاز يمكن بسرعةlert للمستخدم القضايا المعروضة تأخير في التقدم وانخفاض في الإنتاجية يحدث. في حالة حدوث تلوث الأكسجين، وتحديد المصدر بسرعة مع كاشف تسرب الغاز (المتاحة من معامل كوي) ينصح. لزيادة فرصة في العثور على مكان وجود تسرب، قطعة قماش غارقة في الكحول يمكن وضعها داخل غرفة منذ كاشف تسرب الغاز يمكن تحديد مستويات متزايدة من الهيدروكربونات وكذلك زيادة مستويات الهيدروجين. مرة واحدة تم العثور على مصدر التسرب، فإنه يمكن إصلاحه باستخدام الغراء أو السيليكون باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
وهناك عدد من الكائنات الحية تنمو بسهولة في بيئات لاهوائية، بما في ذلك الأنواع الأخرى الشائعة اللاهوائية (مثل المطثية الحاطمة) واهوائي مخير، الإشريكية القولونية. تقنية العقيم وغيرها من الاستراتيجيات يمكن أن تقلل من خطر التلوث. تنظيم المناسبة داخل الغرفة، مثل وضع بنود في متناول اليد لتخفيف و المحتملةأو الانسكابات والتخلص الفوري من النفايات المتراكمة واقية، يمكن أن تقلل من مخاطر التلوث. بالإضافة إلى ذلك، مناشف ورقية مبللة بمحلول مخفف التبييض لا يمكن أن تتحقق بشكل دوري الى غرفة لمسح أسفل الأسطح واللاتكس أو قفازات النيوبرين. فمن الأهمية بمكان أن لا يترك التبييض أو الكحول الحلول داخل الغرفة لفترات طويلة من الزمن وهذه يمكن أن تتخلل الغلاف الجوي وسائل الاعلام الصلبة والسائلة، مما أسفر عن مقتل C. صعب، فضلا عن إتلاف الفينيل 34. بالإضافة إلى ذلك، واستبدال العادية للاللاتكس أو قفازات النيوبرين يمكن أن يقلل أيضا من خطر التلوث. كما ذكر أعلاه، إذا لم تكن متأكدا ما إذا كان الكائن هو C. صعب أو الملوثة، وهو اختبار لوجود الجين tdcB باستخدام PCR يمكن تحديد ما إذا كان الكائن هو C. صعب 21. أخيرا، إذا زراعة الكائنات متعددة داخل نفس الغرفة اللاهوائية، فمن المهم أن نلاحظ أن C. صعب يمكن أن تنتج مشتقات الأيض (هز. كبريتيد الهيدروجين) التي تمنع نمو الكائنات اللاهوائية الأخرى، والعكس بالعكس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
أعلن عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نود أن نشكر معامل كوي لتوفير يرجى صورا للغرفة اللاهوائية. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح DK087763 (SMM) والمناهج STEP / HHMI زمالة التنمية (ANE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Proteose Peptone no. 2 | BD | 212120 | |
| Na2HPO4 | Fisher | S373 | |
| KH2PO4 | Fisher | BP362 | |
| NaCl | Fisher | S27 | |
| MgSO4 (anhydrous) | Fisher | M65 | |
| á´…-Fructose | Fisher | L96 | |
| Sodium taurocholate | Sigma | T4009 | |
| á´…-cycloserine | Sigma | C6880 | |
| Cefoxitin | Fluka | C4786 | |
| Brain heart infusion medium | BD | 237300 | |
| Proteose Peptone | BD | 211684 | |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A5132 | |
| Tris base | Fisher | BP152 | |
| Agar | BD | 214010 | |
| L-cysteine | Sigma | C7755 | |
| BactoPeptone | BD | 211684 | |
| Columbian sheep blood agar | Fisher | L21928 | |
| NaCl | Fisher | S27 | |
| KCl | Fisher | P217 | |
| Glycerol | Fisher | BP2291 | |
| Sterile inoculating loops | Fisher | 22363596 | |
| Sterile swabs | Fisher | 1495990 | |
| Coy Vinyl Anaerobic Chamber and Accessories | Coy Laboratory Products, Inc | Customer Specified | These items are custom ordered per laboratory needs |
| Materials | |||
| TCCFA agar Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g Na2HPO4 5 g KH2PO4 1 g NaCl 2 g MgSO4 (anhydrous) 0.1 g Fructose 6 g Agar 20 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add: 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 0.1%) 25 ml of 10 mg/ml á´…-cycloserine, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 250 μg/ml) 1.6 ml of 10 mg/ml cefoxitin, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 16 μg/ml) BHIS Medium Brain heart infusion 37 g Yeast extract 5 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate (dissolve in water; final concentration, 0.1%) SMC Sporulation Medium BactoPeptone 90 g Protease peptone 5 g (NH4)2SO4 1 g Tris base 1.5 g Agar 15 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 70:30 Medium BactoPeptone 63 g Protease peptone 3.5 g Brain heart infusion 11.1 g Yeast extract 1.5 g (NH4)2SO4 0.7 g Tris base 1.06 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (final concentration, 0.03%). Blood agar The use of premade Columbia anaerobic sheep blood agar plates (Fisher Scientific, L21928)35 is recommended. 1X Phosphate buffered saline (PBS) NaCl 8.01 g KCl 0.2 g Na2HPO4 1.44 g KH2PO4 0.27 g Bring to 1 L with deionized water and adjust pH to 7.4 with HCl. Filter sterilize before use. |
|||
References
- Hall, I. C., O'Toole, E. Intestinal flora in new-borin infants - With a description of a new pathogenic anaerobe, Bacillus difficilis. Am. J. Dis. Child. 49, 390-402 (1935).
- Tedesco, F. J., Barton, R. W., Alpers, D. H. Clindamycin-Associated Colitis - Prospective Study. Ann. Intern. Med. 81, 429-433 (1974).
- Gerding, D. N. Clostridium difficile 30 years on: what has, or has not, changed and why. Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 2-8 (2009).
- Gerding, D. N., Muto, C. A., Owens, R. C. Treatment of Clostridium difficile infection. Clin. Infect. Dis. 46, Suppl 1. 32-42 (2008).
- Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin. Infect. Dis. 55, 88-92 (2012).
- Bouza, E. Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden. Clin. Microbiol. Infect. 18, 5-12 (2012).
- Peery, A. F., et al. Burden of gastrointestinal disease in the United States: 2012 update. Gastroenterology. 143, 1171-1173 (2012).
- Deakin, L. J., et al. The Clostridium difficile spo0A gene is a persistence and transmission factor. Infect. Immun. 80, 2704-2711 (2012).
- Drasar, B. S. Cultivation of anaerobic intestinal bacteria. J. Pathol. Bacteriol. 94, 417-427 (1967).
- Leach, P. A., Bullen, J. J., Grant, I. D. Anaerobic CO 2 cabinet for the cultivation of strict anerobes. Appl. Microbiol. 22, 824-827 (1971).
- Killgore, G. E., Starr, S. E., Del Bene,, Whaley, V. E., N, D., Dowell, V. R. Comparison of three anaerobic systems for the isolation of anaerobic bacteria from clinical specimens. Am. J. Clin. Pathol. 59, 552-559 (1973).
- Bacic, M. K., Smith, C. J. Laboratory maintenance and cultivation of bacteroides species. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 13, Unit 13C 11 (2008).
- Doan, N., Contreras, A., Flynn, J., Morrison, J., Slots, J. Proficiencies of three anaerobic culture systems for recovering periodontal pathogenic bacteria. J. Clin. Microbiol. 37, 171-174 (1999).
- Socransky, S., Macdonald, J. B., Sawyer, S. The cultivation of Treponema microdentium as surface colonies. Arch. Oral. Biol. 1, 171-172 (1959).
- George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 9, 214-219 (1979).
- Wilson, K. H., Silva, J., Fekety, F. R. Suppression of Clostridium difficile by normal hamster cecal flora and prevention of antibiotic-associated cecitis. Infect. Immun. 34, 626-628 (1981).
- Wilson, K. H., Kennedy, M. J., Fekety, F. R. Use of sodium taurocholate to enhance spore recovery on a medium selective for Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 15, 443-446 (1982).
- Bliss, D. Z., Johnson, S., Clabots, C. R., Savik, K., Gerding, D. N. Comparison of cycloserine-cefoxitin-fructose agar (CCFA) and taurocholate-CCFA for recovery of Clostridium difficile during surveillance of hospitalized patients. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 29, 1-4 (1997).
- Marler, L. M., et al. Comparison of five cultural procedures for isolation of Clostridium difficile from stools. J. Clin. Microbiol. 30, 514-516 (1992).
- Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 1 (2009).
- Bouillaut, L., McBride, S. M., Sorg, J. A. Genetic manipulation of Clostridium difficile. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 2 (2011).
- Lemee, L., Pons, J. L. Multilocus sequence typing for Clostridium difficile. Methods. Mol. Biol. 646, 77-90 (2010).
- Shanholtzer, C. J., Peterson, L. R., Olson, M. N., Gerding, D. N. Prospective study of gram-stained stool smears in diagnosis of Clostridium difficile colitis. J. Clin. Microbiol. 17, 906-908 (1983).
- Smith, C. J., Markowitz, S. M., Macrina, F. L. Transferable tetracycline resistance in Clostridium difficile. Antimicrob. Agents Chemother. 19, 997-1003 (1981).
- Permpoonpattana, P., et al. Surface layers of Clostridium difficile endospores. J. Bacteriol. 193, 6461-6470 (2011).
- Putnam, E. E., Nock, A. M., Lawley, T. D., Shen, A. SpoIVA and SipL are Clostridium difficile spore morphogenetic proteins. J. Bacteriol. , (2013).
- Burns, D. A., Minton, N. P. Sporulation studies in Clostridium difficile. J. Microbiol. Methods. 87, 133-138 (2011).
- Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile. J. AOAC Int. 94, 618-626 (2011).
- Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. Inhibiting the initiation of Clostridium difficile spore germination using analogs of chenodeoxycholic acid, a bile acid. J. Bacteriol. 192, 4983-4990 (2010).
- O'Connor, J. R., et al. Construction and analysis of chromosomal Clostridium difficile mutants. Mol. Microbiol. 61, 1335-1351 (2006).
- Buggy, B. P., Wilson, K. H., Fekety, R. Comparison of methods for recovery of Clostridium difficile from an environmental surface. J. Clin. Microbiol. 18, 348-352 (1983).
- Koch, C. J., Kruuv, J. The release of oxygen from polystyrene Petri dishes. Br. J. Radiol. 45, 787-788 (1972).
- Ethapa, T., et al. Multiple factors modulate biofilm formation by the anaerobic pathogen Clostridium difficile. J. Bacteriol. , (2012).
- Speers, A. M., Cologgi, D. L., Reguera, G. Anaerobic cell culture. Curr. Protoc. Microbiol. Appendix 4, Appendix 4F (2009).
- Lyras, D., et al. Toxin B is essential for virulence of Clostridium difficile. Nature. 458, 1176-1179 (2009).
