Summary
Clostridium difficile er en sykdomsfremkallende bakterie som er en streng anaerob og forårsaker antibiotikaassosiert diaré (AAD). Her, fremgangsmåter for isolering, dyrking og opprettholdelse C. difficile vegetative celler og sporer, er beskrevet. Disse teknikkene nødvendig en anaerob kammer, som krever regelmessig vedlikehold for å sikre ryddige forhold for optimal C. difficile dyrking.
Abstract
Clostridium difficile er en Gram-positive, anaerob, sporogenic bakterie som er hovedansvarlig for antibiotikaassosiert diaré (AAD), og er en betydelig nosokomial patogen. C. difficile er notorisk vanskelig å isolere og dyrke og er ekstremt følsomme overfor til og med lave nivåer av oksygen i miljøet. Her, fremgangsmåter for å isolere C. difficile fra fecal prøver og senere dyrking C. difficile for utarbeidelse av glyserol aksjer for langtidslagring presenteres. Teknikker for å forberede og opplisting spore aksjer i laboratoriet for en rekke nedstrøms applikasjoner, inkludert mikroskopi og dyrestudier er også beskrevet. Disse teknikkene gjør det nødvendig et anaerobt kammer, som opprettholder en jevn anaerobt miljø for å sikre riktig forhold for optimal C. difficile vekst. Vi gir protokoller for overføring av materialer inn og ut av kammeret uten at cabruker betydelig oksygen forurensning sammen med forslag til regelmessig vedlikehold er nødvendig for å opprettholde riktig anaerobt miljø for effektiv og konsekvent C. difficile dyrking.
Introduction
Clostridium difficile er en Gram-positiv, sporedannende bakterie som er en obligat anaerob og en potensielt fatal gastrointestinal patogen for mennesker og dyr. I utgangspunktet beskrevet i 1935 som en commensal organisme som finnes i fekal prøver fra nyfødte 1, C. difficile ble senere vist seg å være den utløsende agent for pseudomembranøs kolitt assosiert med antibiotikabehandling to. C. difficile infeksjoner (CDI) er vanligvis innledes med antibiotika behandling som resulterer i avbrudd av den normale colonic flora, noe som skaper en nisje for C. difficile å trives to. C. difficile overføres som et sovende spore via fekal-oral rute og deretter spirer i mage-tarmkanalen, som produserer vegetative celler i stand til å generere en rekke giftstoffer og forårsaker alvorlig sykdom og kolitt 3.. CDI er ofte responderer på konvensjonelle behandlinger og disse iFections blir stadig gjentatt fire. Som et resultat, CDI er ansvarlig for opp til $ 4,8 milliarder kroner i helsekostnader i USA 5-7.
C. difficile er svært følsom for og med lave nivåer av oksygen i miljøet. For C. difficile å vedvare i miljøet og bli effektivt overføres fra vert til vert, er kritisk 8 dannelsen av en metabolsk inaktive spore. Fordi laboratoriet vedlikehold og manipulering av C. difficile krever en kontrollert, anaerobt miljø, er disse teknikker nødvendiggjøre bruk av et anaerobt kammer. Bruk av anaerobe kammer har resultert i økt utvinning og isolering av obligate anaerober 9-11, og har tillatt et antall molekylære teknikker som skal utføres i en anaerob atmosfære.
I tillegg til C. difficile, anaerob kammer bruk og vedlikehold som er beskrevet her er aktuelttil andre obligat anaerobe eksempel andre clostridietypene (f.eks C. perfringens), andre gastrointestinale arter (f.eks Bacteroides arter 12) og periodontale patogener (f.eks Peptostreptococcus arter 13).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: C. difficile er en human og animalsk patogen som kan forårsake gastrointestinal sykdom. Forsøk med C. difficile må utføres med egnede forholdsregler for biologisk sikkerhet (BSL-2).
En. Anaerob Chamber Bruk og vedlikehold
C. difficile er et strengt anaerobe og er ekstremt følsomme overfor selv lave konsentrasjoner av oksygen i atmosfæren. Derfor er en kontrollert, anaerobt miljø som er nødvendig for en vellykket manipulasjon. Bruken av et anaerobt kammer (figur 1A) gir den mest stabile omgivelser, og de ideelle betingelser for effektiv dyrking av C. difficile og andre anaerobe bakterier 14. Her kan en atmosfære som inneholder en gassblanding (5% CO2, 10% H2, 85% N 2) opprettholdes stabilt.
Å introdusere noen elementer inn i kammeret uten betydelig oksygen forurensning,en luftsluse skal benyttes (figur 1B). Denne enheten fungerer som et gassknutepunkt og fungerer automatisk, semi-manuelt eller manuelt. Den luftslusen har to dører: en som gir tilgang til utsiden av slusen og den andre som gir tilgang til det indre av det anaerobe kammeret. Avhengig av modell, kan luftslusen har en ekstra dør, som kan tilby tilgang til et tilstøtende anaerob kammer, og dermed spare kostnadene for en separat luftslusen. Med mindre aktivt flytte elementer i eller ut av kammeret, bør både dører forbli lukket til enhver tid for å unngå oksygen forurensning. Luftslusen besitter en av / på-bryteren på forsiden og et panel med fire knapper. De gassledninger og vakuumpumpeslangen er forbundet på baksiden av luftslusen, nær panelet hvor bryterne for full manuell betjening av apparatet er lokalisert. Anbefales det at to spylesykluser, ved hjelp av nitrogengass (N 2), blir brukt før du fyller utveksling med gass mix (5% CO 2, 10% H 2, 85% N 2) for å redusere mengden av oksygen som innføres i kammeret. Videre er det viktig å ikke forlate enten døren er åpen i mer enn den mengde tid som er nødvendig for å flytte gjenstander i og ut av formidlings og planlegge nøye eksperimenter for å redusere hyppigheten av bevegelige elementer i og ut av kammeret. De ulike driftsprosedyrer for vinyl anaerobe kamrene er skissert nedenfor. Før du følger disse protokollene, sørge for at disse er kompatible med produsentens instruksjoner som følger med kammeret.
- Automatisk modus
Dette er en programmerbar og kan tilpasses modus og utføres utelukkende av luftslusen. For å programmere luftslusen, kan du se produsentens instruksjoner. En anbefalt program for typisk trenge inn i kammeret involverer to purge sykluser ved hjelp av nitrogengass etterfulgt av refylle luftslusen med en gass blanding som passer den atmosfæren opprettholdes innenfor chamBER. Under hver vakuumsyklus, foreslår standard fabrikk prosedyrer trekke et vakuum til 20 inHg og sletting til en inHg.- Pass på at den indre luftslusen døren er helt lukket.
- Åpne den ytre luftslusen døren.
- Plasser elementer inn i luftslusen og lukke den ytre luftslusen døren. Hvis innføre væsker, skru av caps halvveis for å sikre effektiv gassutveksling. Forseglede pakker og beholdere skal åpnes før start av syklusen, avstå fra å gjøre det kan deformere og skader plasticware og containere. For å opprettholde sterilitet, åpne pakkene nok å bare tillate effektiv gassutveksling.
- Trykk på Start-knappen.
- Vent til luftslusen har syklet gjennom programmet og displayet viser "Anaerob."
- Åpne indre luftsluse døren.
- Flytt elementer inn i kammeret.
- Lukk indre dør.
- Semi-manuell modus
Denne modus kan benyttes ved flytting av varer i eller ut av kammeret og er nødvendig når cycling gassen inne i kammeret er nødvendig.- Pass på at den indre luftslusen døren er helt lukket.
- Åpne den ytre luftslusen døren.
- Plasser elementer inn i luftslusen og lukke den ytre luftslusen døren. Hvis innføre væsker, skru av caps halvveis for å sikre effektiv gassutveksling. Forseglede pakker, som for eksempel å inokulere sløyfer og 96-brønners plater, må åpnes før start av syklusen.
- Trykk Meny.
- Trykk på Start. Luftslusen vil vise funksjonen til hver knapp, og vil ikke svare før dette er fullført:
- Pil opp: aktiverer vakuumpumpen.
- Pil ned: initierer nitrogen (purge) gasstrømmen.
- Begynn: initierer gass mix flyt.
- Meny: gå tilbake til standardvisning.
- Trykk "Up", fjerne gass fra luftslusen, til displayet viser 20 inHg.
- Trykk "Down", fylle luftslusen med nitrogen, til displayet viser mindre enn en inHg. Ikke overshoot, da dette vil skape positivt trykk i luftslusen, noe som kan påvirke dens integritet.
- Gjenta trinn 6 og 7 til å utføre en ytterligere spylesyklus.
- Trykk "Up" til displayet viser 20 inHg.
- Trykk på "Start", fylle utveksling med gass mix, til displayet viser mindre enn en inHg.
- Åpne indre luftsluse døren.
- Flytt elementer inn i kammeret.
- Lukk indre dør.
- Manuell modus
Denne modusen kan brukes når de automatiske eller halv manuell modus ikke fungerer eller det ikke er strøm til luftslusen. Denne modusen fungerer ikke når luftslusen er på, og derfor er det vanskelig å bestemme trykket i luftslusen. Fordi vakuum-trekker og gass purge tider er avhengig av vakuum-og gass-strømningshastigheter på henholdsvis, er bruken av en trykkmåler inne i utvekslingen som kreves for å overvåke trykket og redusere risikoen for personskader og skader på luftslusen.- Pass på at den indre luftslusen døren er helt lukket.
- Åpne den ytre luftslusen døren.
- Plasser elementer, inkludert trykkmåleren, i luftslusen og lukke den ytre luftslusen døren. Hvis innføre væsker, skru av caps halvveis for å sikre effektiv gassutveksling. Forseglede pakker, som for eksempel å inokulere sløyfer og 96-brønners plater, må åpnes før start av syklusen.
- Finn de tre bryterne på baksiden av luftslusen merket "manuell kontroll brytere." Disse er individuelt merket som:
- Å støvsuge
- Nitrogen
- Gass Mix
- Vend den til å støvsuge vippebryteren inntil trykkmåleren viser ca 20 inHg.
- Vend Nitrogen vippebryter inntil trykkmåleren viser ca 1 inHg.
- Vend den til å støvsuge vippebryteren inntil trykkmåleren viser ca 20 inHg.
- Vend Nitrogen vippebryter inntil trykkmåleren viser ca 1 inHg.
- Vend den til å støvsuge vippebryteren inntil trykkmåleren viser ca 20 inHg.
- Vend Gas Mix vippebryter inntil trykkmåleren viser ca 1 inHg.
- Åpne indre luftsluse døren.
- Flytt elementer inn i kammeret.
- Lukk indre dør.
2. Dyrking, opplisting og lagre C. difficile fra avføringsprøver
Denne fremgangsmåte er utviklet for å utvinne C. difficile fra fecal prøver som inneholder sporer og deretter holdes isolerte kolonier som vegetative celler eller sporer i langtidslagring som glyserol aksjer. Alternativt, kan denne fremgangsmåten brukes til å spesifisere hvor mange C. difficile stede i avføringsprøver (f.eks fra dyrestudier). Å selektivt og ulikt berike for C. difficile, er taurocholate-cefoxitin-cycloserine-fruktose agar (TCCFA) som brukes for å hemme veksten av normale fekal flora 15-16. Cycloserine er bakteriostatisk for Gram-negative bakterier, mens cefoxitin hemmer mer bredt veksten av både gram-negative og-positive bakterier, med unntak av C. difficile og mest inn cocci stammer. En pH-indikator, nøytralt rødt, kan inkluderes i mediet, som fermentering av fruktose vil resultere i en reduksjon i pH-verdi, og en etterfølgende fargeendring fra rødt / oransje til gul. For å effektivt gjenopprette sporer av C. difficile som vegetative bakterier, er gallesalter natrium taurocholat brukt for å indusere spiring 17-18. Fordi C. difficile danner sporer, alkohol eller varmebehandling av prøver kan anvendes for å redusere eller eliminere vegetative celler, noe som begrenser veksten av forurensende flora, som kan øke effektiviteten av C. difficile utvinning 19. Som nevnt ovenfor, er det avgjørende å forhånds redusere alle platene i minst 1-2 timer i det anaerobe kammeret før bruk for å sikre fjerning av restoksygen. Air tørking ong platene før bruk i kammeret kan redusere kondens. Flytende medium kan trenge opp til 24 timer for å redusere avhengig av volum og overflate-til-luft-forhold i beholderen i bruk.
Før du begynner, bør følgende elementer legges inn i anaerob kammer:
- Avføringsprøve
- Sterile kompresser
- Sterile inoculating sløyfer
- 1x PBS (se Materials)
- TCCFA plater (se Materials)
- BHIS (Brain Hjerte Infusion medium med gjærekstrakt) plater og kjøttkraft (se Materials)
- 50% glyserol (sterilisert)
- 10% L-cystein (sterilisert)
- Kryogene lagrings ampuller
* Alternativt kan isolerte kolonier bli spredt på BHIS agarplater, og deretter skrapet av og på nytt oppslemmet i BHIS flytende medium med 15% glycerol for langtidslagring ved -80 ° C. ** Det er viktig å merke seg at Gram-farging er ikke en effektiv strategi for å identifisere C. difficile direkte fra avføringsprøver 23 C. difficile først må bli isolert fra de andre flora som er tilstede i avføring.
- Resuspender avføringsprøve i 1 x PBS (dette kan utføres under aerobe betingelser), og sørger for at avføringsprøven er fullstendig resuspendert i 1 x PBS ved virvling. Hvis opplisting C. difficile fra avføring, veie avføringsprøve før tilsetningen av 1 x PBS.
- Lag seriefortynninger av det resuspenderte avføringsprøve i 1 x PBS i passende isolering eller telling av kolonidannende enheter (CFU) per gram avføring.
- Ved hjelp av aseptisk teknikk, anvende 100 pl av hver seriefortynning til TCCFA platene.
- Ved hjelp av en serie av sterile inokulere løkker, strek den anvendte kultur for isolerte kolonier eller jevnt spre den anvendte kultur på overflaten av TCCFA plate for telling av koloniene.
- Inkuber platen anaerobt i 48 timer ved 37 ° C. Det er mulig å oppdage og identifisere C. difficile kolonier i løpet av 24 timer basert påden flate, uregelmessig, slipt glass utseende av koloniene 15, men mer nøyaktig identifikasjon og telling oppnås etter 48 timer.
- Bruk sterile inoculating looper, subkultur noen kolonier som synes å være C. difficile på pre-redusert BHIS agar plater, supplert med 0,03% L-cystein 20. Pick en individuell koloni, og strek på tallerkenen i kvadranter, ved hjelp av en ny steril løkke for å inokulere hver kvadrant, for å oppnå isolerte kolonier. Alternativt telle C. difficile kolonier av hver fortynning (dette kan utføres under aerobe betingelser), og beregne antallet kolonidannende enheter per gram avføringsprøve.
- Bekreft C. difficile identifisering via Gram-farging. Etter Gram-farging, C. difficile vil fremstå som lilla stenger og noen celler kan inneholde terminal endospores. Polymerase kjedereaksjon (PCR) identifisering av gener som koder for B-toksin, kan gi ytterligere bekreftelsetoxigenic stammer av C. difficile 21 mens multilocus sekvens typing (MLST) er vellykket for identifikasjon og nøyaktig typing av ukjente og nontoxigenic stammer av C. difficile 22.
- For å opprettholde et lager av C. difficile ved -80 ° C, velge en individuell, isolert koloni fra BHIS agar plate ved hjelp av en steril sløyfe inokulering og resuspender kolonien i 10 ml av pre-redusert BHIS flytende medium supplert med 0,03% L-cystein. *
- Inkuber over natten anaerobt ved 37 ° C, eller inntil kulturen blir grumset.
- Til 333 ul av 50% glycerol og 666 pl av den C. difficile kultur til en 1,8 ml kryogenisk rør for å skape en 15% glycerol lager av den isolerte stammen.
- Tett cap kryogen tube, bland godt og umiddelbart fjerne aksjen fra anaerob kammer og plasser i en -80 ° C fryser for langtidslagring.
Tre. Dyrking C. difficile
Denne fremgangsmåten sørger for utvinning av C. difficile fra glyserol aksjer lagret ved -80 ° C. Fordi gjentatte fryse-tine-sykluser kan drepe vegetative celler, er det viktig å holde glyserol aksjer frosset til enhver tid. Vi anbefaler ikke anvendelse av tørris til å overføre belastninger inn og ut av kammeret som fordampning av tørrisen kan endre miljøet i kammeret. I stedet anbefaler vi at du bruker frosne kjøle racks å holde glyserol aksjer frosset under transporten. For forskjellige selektive og differensial formål, er tre medier som vanligvis anvendes for dyrking av C. difficile. TCCFA, som diskutert ovenfor, er selektiv for C. difficile og inneholder natrium taurocholate, en spiren. Hjerne hjerte infusjon supplert med gjærekstrakt (BHIS) er en vanlig brukt, anriket, ikke-selektivt medium som tillater vekst av et bredt spekter av organismer (figur 2A) 24. Ofte, L-cysteine er lagt til BHIS som reduksjonsmiddel 20. Til slutt tilsetning av blod til medium (figur 2B) er mer effektiv enn sporedannelsen på TCCFA og sørger for påvisning av unike grønnaktig eller gulgrønn fluorescens oppvises av C. difficile ved langbølget ultrafiolett (UV) lys 15 (figur 2C). Når dyrkning C. difficile fra spore aksjer, er det viktig å huske at natrium taurocholate må legges til mediet for å sikre spiring.
Før du begynner, bør følgende elementer legges inn i anaerob kammer:
- Frozen glyserol lager (i avkjøling rack)
- Sterile inoculating sløyfer
- TCCFA eller BHIS plater (se Materials)
- BHIS kjøttkraft (se Materials)
- 50% glyserol (sterilisert)
- Kryogene lagrings ampuller
- Plasser den frosne glyserol lager av C. difficile i en avkjøling rack som har blitt lagret ved -80 ° C prior å bruke for å hindre tining.
- Bring den frosne glycerol lager på tørris i det anaerobe kammeret.
- Ved hjelp av en aseptisk teknikk og et sterilt inokulere løkke ved å plassere en liten mengde av lager på platen og strek over en kvadrant av platen.
- Roter plate 90 ° og ved hjelp av en ny steril inokulere løkke, fortsetter å strek over den andre kvadrant.
- Gjenta for den tredje og fjerde kvadrantene for å sikre isolering av de enkelte kolonier.
- Umiddelbart fjerne den frosne glyserol lager fra den anaerobe kammeret og gå tilbake til -80 ° C.
- Inkuber platen anaerobt over natten ved 37 ° C. Individuelle isolerte kolonier bør observeres etter vekst over natten.
4. Rensende Sporer fra C. difficile
Som sporedannelsen er nødvendig for å overleve i oksygenrikt miljø og for effektiv overføring av sykdommer 8, er fremstillingen av spore stocks Often er nødvendig for nedstrøms applikasjoner, ikke begrenset til mikroskopi og dyr studier. Det er viktig å merke seg at opplisting sporer krever gjentagelse for å sikre reproduserbarhet av tellinger. Pipettering opp og ned flere ganger mellom fortynninger reduserer også tap siden sporer holder seg til plast også.
Sporulation av C. difficile er ikke så rask eller homogene som andre sporogenic arter. For å optimalisere sporeproduksjon og utvinning, enten sporulation medium (SMC) 17,25 eller 70:30 medium 26 anbefales. Andre medier som vanligvis benyttes er BHIS, noe som krever 4 til 5 dagers vekst før effektiv sporulering er sett 27, og Clospore, et flytende medium som produserer høye titere av sporer (juli 10 til august 10 sporer per milliliter) etter 72 timers vekst. Andre protokoller bruker iskaldt vann i stedet for 1x PBS 20, men kan ved bruk av en isotonisk oppløsning redusere sporer fester seg til hverandre og plastflater. Alternativtnoen etterforskere ytterligere rense sine sporer ved hjelp av en sukrosegradient å fullstendig fjerne vegetative celler og rusk 29.
Før du begynner, bør følgende elementer legges inn i anaerob kammer:
- Sterile inoculating sløyfer
- BHIS, SMC og / eller 70:30 plater (se Materials)
- BHIS kjøttkraft (se Materials)
- 1x PBS, filter-steriliseres (se Materials)
- Kultur stammer fra frossen glyserol lager på pre-redusert BHIS plater og inkuber anaerobt over natten ved 37 ° C.
- Restreak på flere pre-redusert SMC eller 70:30 plater og inkuberes anaerobt ved 37 ° C i 24-48 timer. Spore dannelse kan følges via fase kontrast mikroskopi. Sporene vises fase lyse mens vegetative og mors celler vises fase mørkt. * Som et alternativ, kan spores bli renset fra 70:30 flytende medium etter 24-48 timer, noe som gir 10 5 -10 6 sporer per milliliter, avhengig av Strain benyttes.
- Ved hjelp av en steril inoculating sløyfe, skrape plater og resuspender cellene i 10 ml sterilt 1x PBS.
- Kast platene og fjerne sporesuspensjon fra det anaerobe kammeret. Pellet cellene ved 3000 xg i 15 minutter. Vask cellene to ganger i 1 x PBS, fullstendig resuspendering cellepelleten hver gang.
- Inkuber over natten ved 4 ° C for å hjelpe til lysis av vegetative og moderceller.
- Inkuber ved 70 ° C i 20 minutter for å drepe eventuelle gjenværende vegetative celler.
- Å avgjøre kolonidannende enheter (CFU) per milliliter, serielt fortynne hver spore forberedelse i 1x PBS og plate på BHIS + 0,1% natrium taurocholate. Inkuber platene i minst 24 timer før opplisting kolonier.
- Sporene kan lagres i 1 x PBS ved enten romtemperatur eller 4 ° C i lengre tids lagring. Hvis den lagres ved 4 ° C, kan det være hensiktsmessig å varme opp sporpreparatet ved 55 ° C i 15 min for å gjenopprette effektiv spiring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et eksempel på C. difficile dyrket på BHIS og Columbia anaerob saueblodagar materiale kan sees i figur 2. C. difficile danner uregelmessige kolonier som er flat og har en slipt glass utseende som er tydelig på begge medier. Her en erytromycin-sensitive klinisk isolat av C. difficile, 630E 30 er dyrket på BHIS agar, en beriket, ikke-selektivt medium, i 24 timer ved 37 ° C (figur 2 A). Kolonier på Columbia anaerob saueblodagar ser tilsvarende de som dyrkes på BHIS under hvitt lys (figur 2B), men tilveiebringer anvendelse av dette medium også for påvisning av grønn eller gulgrønn fluorescens oppvises av C. difficile ved langbølget ultrafiolett (UV) lys 15 (figur 2C). C. difficile kolonier på TCCFA agar ligne vekst på BHIS agar. På grunn av tilstedeværelsen av to antibiotika i TCCFA medium, en time periode på 48 timer vekst er nødvendig før opplisting kolonier.
Figur 1. The Coy Laboratories Type C vinyl kammer og dets komponenter. (A) A Coy Laboratories Type C vinyl kammer som gir arbeidsområde for et enkelt individ på en gang (42 tommer x 32 tommer). Den inneholder en katalysator vifteboksen (bakre venstre hjørne) som sirkulerer, og varmer opp luft, og holder Stak-Pak inneholdende palladium-katalysator som kreves for å redusere en hvilken som helst oksygenforurensning. (B) Et luftslusen tjener som en utveksling, og gir en mekanisme for overføring av materialer inn og ut av kammeret samtidig som man unngår vesentlig oksygenforurensning i det anaerobe miljø. Luftslusen har to dører: en som gir tilgang til utsiden av luftslusen og den andre gi tilgang til det indre av th e anaerob kammer. Luftslusen er programmerbar og gir mulighet for tilpasset sykluser for inntreden i kammeret. Det er i drift i automatisk, semi-manuell og manuell modus. (C) Attached, fleksible gummihansker er gitt som tillater hele spekteret av bevegelse og nå i kammeret. Hanskene er festet til en spesialisert mansjett festet til vinyl-arm med vinylklebemiddel, som tillater utskifting av hansker uten å forstyrre den anaerobe atmosfæren i kammeret. Neoprenhansker er også tilgjengelig. (D) Den Model 10 Gas Analyzer overvåker kontinuerlig både oksygen-og hydrogen-nivåer som gir en umiddelbar avlesning av atmosfæren inne i kammeret. Denne enheten gir mulighet for umiddelbare varsler hvis en lekkasje oppstår, er en feil gass blanding brukt eller ytterligere problemer oppstår via hørbare alarmer og en blinkende LED lys.
ig2.jpg "/>
Figur 2. Utseendet til C. difficile kolonier på ulike medier. Den karakteristiske flate, uregelmessig, slipt glass utseende er tydelig med en erytromycin-sensitive klinisk isolat av C. difficile, 630E 30, dyrket på BHIS agar i 24 timer (A) og Columbia anaerob saueblodagar i 48 timer under hvitt lys (B) og langbølget ultrafiolett lys (C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metodene som beskrives her, gir mulighet for enkel og hurtig gjenvinning av C. difficile fra en rekke fekale prøver, inkludert mennesker, mus og hamstere, samt langtidslagring av C. difficile som glyserol eller spore aksjer. C. difficile kan være vanskelig å dyrke organismen, men nøye vedlikehold av et anaerobt miljø, og anvendelse av aseptiske teknikker, kan gi for sterk vekst og redusert forurensning.
Anaerob kamre: Hensyn og Vedlikehold
Det finnes to typer anaerobe kamre: stive kammer eller vinyl kamre. Stive kamrene er vanligvis laget av aluminium eller en stiv polymer (for eksempel pleksiglass eller akryl-materiale), som tillater bruk av etsende kjemikalier. Stive kamre kan konverteres til en gloveless stil og er mindre utsatt for punkteringer, men lekkasjer er vanskelige å oppdage og finne og stive kamre krever noen metode for åkompensere for gassforskyvning under bruk. De polymerenheter ofte er utstyrt med en purge-bare luftslusen, som kan koste mer å betjene. For vedlikehold av strenge atmosfæriske forhold, kostnader, fleksibilitet, laboratorie plassbehov og enkelt vedlikehold, er vinyl anaerobe kamre anbefales (Coy Laboratory Products, figur 1A). Denne anaerobe kammer består av en vinyl-hanske-boks som er støttet av en rørformet aluminiums-struktur og er koblet til en luftsluse som fungerer som en utveksling for overføring av materialer inn og ut av kammeret (figur 1B) ved å bruke latex-eller neopren festet til vinyl ermene (figur 1C). Det er viktig å nettopp følge produsentens anvisninger for riktig oppsett av den anaerobe kammeret. Det kan være temperaturregulert med en (eller flere, avhengig av størrelsen av kammeret) varmeapparat boksen enheter som gir luftsirkulasjon gjennom en palladium-katalysator. Den palladium catalyst tjener til å redusere oksygenforurensning innført gjennom utvekslingen ved omdannelse av hydrogen og oksygen til vann. Ideelt sett er begge oksygen-og hydrogenkonsentra-overvåket ved bruk av en gass-analysator (fig. 1D), som viser oksygen-konsentrasjonen i deler pr million (ppm), og hydrogen-konsentrasjon som en prosent.
Flytende og faste media bør bli pre-redusert i det anaerobe kammeret før bruk. Petriskåler (100 mm i diameter) kan reduseres til bare to timer før bruk 31, men bør av væske reduseres over natten. Viktigere, må mediet bli avkjølt før overføring inn i kammeret for å hindre at væske som blinker under luftslusen evakuering. Plastforbruksvarer, slik som 96-brønners plater, bør være pre-redusert over natten før bruk, for eksempel plast er porøs og kan lagre 32 oksygenmolekyler. Avhengig av programmet, noen plast må være pre-redusert i opp til 48 timer før bruk 33. Biologisk avfall bør be avhendes på riktig måte. En liten biologisk posen kan holdes inne i kammeret, men må skiftes ut ofte.
En hydrogen-konsentrasjon på minst 3% må opprettholdes inne i kammeret, da dette vil sikre både god vekst av C. difficile og effektiv oksygenfjerning. Hvis hydrogenkonsentrasjonen synker til under 3% eller dersom kammeret ikke har vært brukt i flere dager, bør et kammer syklusen utføres for å gjenopprette den hydrogenkonsentrasjonen til ønskede nivåer. Her, er omtrent en tredjedel av gassen i kammeret suges ut (vinyl-boksen vil deflate vesentlig) og erstattes med frisk gass blanding. Pass på at luftslusen er anaerob før du begynner. Pumping av for mye gass i kammeret bør unngås, da dette ikke bare legger unødig påkjenning på vinyl posen, men vil også være til hinder for brukeren fra å nå frem til baksiden av kammeret. Alltid utføre denne prosedyren i et godt ventilert område. Ta ekstra forholdsregler hvis chamber er holdt i et lite, dårlig ventilert rom. Åpne noen dører til rom som gass innholdet inne i kammeret kan asphyxiate brukeren.
Ytterligere vedlikehold inkluderer regenerering av palladium-katalysator for å sikre effektiv oksygenfjerning i kammeret. Ettersom oksygen og hydrogen er redusert med katalysatoren, kan vann samler seg på overflaten av palladium-dekket aluminiumpellets, og reduserer deres effektivitet over tid. For å overvinne dette, bør den palladium-katalysatorer skal regenereres i det minste en gang i uken ved å bake på minst 230 ° C i en time. I tillegg, som et resultat av både oksygen-reduksjon og fordampning av vann fra platene og media er vann akkumulering et vanlig problem innenfor anaerobe kammer. For å sikre komfortabel manipulering og øke halveringstiden av utstyret inne i kammeret, kan tørkemiddel pakninger brukes, men bør tørkes ut ofte følge den samme fremgangsmåte som brukes for palladium-katalysatorer. Alternativt, en defukteren kan anvendes som sirkulerer luft gjennom en metallblokk som kondenserer vannet og samles i en beholder. Enheten hindrer overløp av vann beholdere, men må avfuktere overvåkes og emballasje bør tømmes når nær full. For å rengjøre vinyl kammeret, er bruk av en myk klut og annet kommersielt rengjøringsmiddel anbefales for polyvinylklorid (PVC) anbefales (f.eks Plastic Magisk Cleaner, del nei. 1.600.480, Coy Laboratories). For å unngå riper eller skader på vinyl kammer, må du ikke bruke papirhåndklær, Kim-kluter eller produkter som inneholder ketoner eller andre forbindelser som kan skade PVC.
Endelig C. difficile produserer hydrogensulfidgass (H2S), som er ekstremt reaktive og etsende. Hydrogensulfid kan bli skadelig for instrumentering, palladium-katalysator og eventuelle utsatte metaller. Hvis mulig, ikke la noen instrumentering, slik som homogenizers og spektrofotometre, i chambER for lange perioder av ganger for å unngå korrosjon forårsaket av hydrogensulfid. På grunn av produksjonen av hydrogensulfid, vil elementer som for eksempel palladium-katalysator og gass-analysator må skiftes ut periodisk som en del av vanlig kammer vedlikehold. Alternativer for å redusere hydrogensulfid-nivåer i kammeret, for eksempel ved hjelp av aktivt kull, blyacetat, sølvkloridet eller sølv-sulfat til å absorbere eller kjemisk fjerne hydrogensulfid, er blitt beskrevet 34 og kan benyttes til å forsinke korrosjon av utstyret.
Ekstra forholdsregler
Åpne aldri en dør til luftslusen uten å sikre at den andre døren er lukket og låst for å hindre oksygen forurensning. Dessuten unngås bruken av skarpe gjenstander innenfor kammeret for å minske risikoen for punktering av vinyl.
Det er viktig å merke seg at hydrogen er en brennbar gass i nærvær av oksygen. Vær forsiktig når du introdusere elementer into kammeret at høye nivåer av oksygen forurensning ikke forekommer (større enn 999 ppm). Det er viktig å bruke bare ferdigblandet nonflammable anaerob gass mix og følge nøye med gass analysator inne i kammeret, spesielt når du bruker en ny gasstank. Hvis begge hydrogen og oksygen konsentrasjoner over 4% oppstår, sikre at de riktige nødprosedyrer, som skal være skissert i laboratoriets standard operasjonsprosedyrer (SOP), blir fulgt.
Feilsøking C. difficile vekst
Hvis dårlig vekst av C. difficile kulturer er observert i rikt medium, er dette som oftest på grunn av oksygenforurensning i kammeret. Tilsetningen av et reduksjonsmiddel (for eksempel L-cystein eller tioglykolat) til mediet, kan hjelpe til med veksten, men ville problemet med oksygenforurensning i kammeret må tas opp. Overvåking oksygen og hydrogen nivåer i kammeret ved hjelp av en gass analysator kan raskt enLert brukeren til problemer før en forsinkelse i fremdrift og nedgang i produktivitet oppstår. Dersom oksygen forurensning inntreffer, er raskt å identifisere kilden med en gasslekkasjedetektor (tilgjengelig fra Coy Laboratories) anbefales. For å øke sjansen i å finne plasseringen av en lekkasje, kan en fille dynket i alkohol plasseres i kammeret ettersom gasslekkasjedetektor kan identifisere økte nivåer av hydrokarboner samt økte nivåer av hydrogen. Når kilden til lekkasjen er funnet, kan den repareres ved hjelp av lim eller silikon i henhold til produsentens instruksjoner.
En rekke organismer lett vokse i anaerobe miljøer, inkludert andre vanlige clostridietypene (f.eks Clostridium perfringens) og fakultativ anaerobe, Escherichia coli. Aseptisk teknikk og andre strategier kan redusere risikoen for forurensning. Hensiktsmessig organisasjon i kammeret, slik som å plassere elementer innen rekkevidde for å minske den potensielle feller søl og rask fjerning av akkumulert biologisk avfall, kan redusere forurensning risiko. I tillegg kan tørkepapir fuktet med en fortynnet blekemiddel med jevne brakt inn i kammeret for å tørke ned overflater og latex eller neoprenhansker. Det er viktig å ikke gitt blekemiddel-eller alkoholløsninger inne i kammeret for lange tidsperioder, da disse kan trenge inn i atmosfæren, og faste og flytende medier, dreper C. difficile, så vel som skade på vinyl-34. I tillegg kan regelmessig utskifting av latex eller neoprenhansker også redusere forurensning risiko. Som nevnt ovenfor, hvis usikker på om en organisme er C. difficile eller en forurensning, kan en test for tilstedeværelse av tdcB-genet ved hjelp av PCR raskt avgjøre om organismen er C. difficile 21. Til slutt, hvis dyrke flere organismer i samme anaerobe kammer, er det viktig å merke seg at C. difficile kan produsere metabolske biprodukter (e. Gr. Hydrogensulfid) som hemmer veksten av andre anaerobe organismer, og vice versa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Coy Laboratories for vennlig å gi bilder av den anaerobe kammeret. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health stipend DK087763 (SMM) og en STEP / HHMI Curriculum Development Fellowship (ANE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Proteose Peptone no. 2 | BD | 212120 | |
| Na2HPO4 | Fisher | S373 | |
| KH2PO4 | Fisher | BP362 | |
| NaCl | Fisher | S27 | |
| MgSO4 (anhydrous) | Fisher | M65 | |
| á´…-Fructose | Fisher | L96 | |
| Sodium taurocholate | Sigma | T4009 | |
| á´…-cycloserine | Sigma | C6880 | |
| Cefoxitin | Fluka | C4786 | |
| Brain heart infusion medium | BD | 237300 | |
| Proteose Peptone | BD | 211684 | |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A5132 | |
| Tris base | Fisher | BP152 | |
| Agar | BD | 214010 | |
| L-cysteine | Sigma | C7755 | |
| BactoPeptone | BD | 211684 | |
| Columbian sheep blood agar | Fisher | L21928 | |
| NaCl | Fisher | S27 | |
| KCl | Fisher | P217 | |
| Glycerol | Fisher | BP2291 | |
| Sterile inoculating loops | Fisher | 22363596 | |
| Sterile swabs | Fisher | 1495990 | |
| Coy Vinyl Anaerobic Chamber and Accessories | Coy Laboratory Products, Inc | Customer Specified | These items are custom ordered per laboratory needs |
| Materials | |||
| TCCFA agar Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g Na2HPO4 5 g KH2PO4 1 g NaCl 2 g MgSO4 (anhydrous) 0.1 g Fructose 6 g Agar 20 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add: 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 0.1%) 25 ml of 10 mg/ml á´…-cycloserine, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 250 μg/ml) 1.6 ml of 10 mg/ml cefoxitin, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 16 μg/ml) BHIS Medium Brain heart infusion 37 g Yeast extract 5 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate (dissolve in water; final concentration, 0.1%) SMC Sporulation Medium BactoPeptone 90 g Protease peptone 5 g (NH4)2SO4 1 g Tris base 1.5 g Agar 15 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 70:30 Medium BactoPeptone 63 g Protease peptone 3.5 g Brain heart infusion 11.1 g Yeast extract 1.5 g (NH4)2SO4 0.7 g Tris base 1.06 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (final concentration, 0.03%). Blood agar The use of premade Columbia anaerobic sheep blood agar plates (Fisher Scientific, L21928)35 is recommended. 1X Phosphate buffered saline (PBS) NaCl 8.01 g KCl 0.2 g Na2HPO4 1.44 g KH2PO4 0.27 g Bring to 1 L with deionized water and adjust pH to 7.4 with HCl. Filter sterilize before use. |
|||
References
- Hall, I. C., O'Toole, E. Intestinal flora in new-borin infants - With a description of a new pathogenic anaerobe, Bacillus difficilis. Am. J. Dis. Child. 49, 390-402 (1935).
- Tedesco, F. J., Barton, R. W., Alpers, D. H. Clindamycin-Associated Colitis - Prospective Study. Ann. Intern. Med. 81, 429-433 (1974).
- Gerding, D. N. Clostridium difficile 30 years on: what has, or has not, changed and why. Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 2-8 (2009).
- Gerding, D. N., Muto, C. A., Owens, R. C. Treatment of Clostridium difficile infection. Clin. Infect. Dis. 46, Suppl 1. 32-42 (2008).
- Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin. Infect. Dis. 55, 88-92 (2012).
- Bouza, E. Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden. Clin. Microbiol. Infect. 18, 5-12 (2012).
- Peery, A. F., et al. Burden of gastrointestinal disease in the United States: 2012 update. Gastroenterology. 143, 1171-1173 (2012).
- Deakin, L. J., et al. The Clostridium difficile spo0A gene is a persistence and transmission factor. Infect. Immun. 80, 2704-2711 (2012).
- Drasar, B. S. Cultivation of anaerobic intestinal bacteria. J. Pathol. Bacteriol. 94, 417-427 (1967).
- Leach, P. A., Bullen, J. J., Grant, I. D. Anaerobic CO 2 cabinet for the cultivation of strict anerobes. Appl. Microbiol. 22, 824-827 (1971).
- Killgore, G. E., Starr, S. E., Del Bene,, Whaley, V. E., N, D., Dowell, V. R. Comparison of three anaerobic systems for the isolation of anaerobic bacteria from clinical specimens. Am. J. Clin. Pathol. 59, 552-559 (1973).
- Bacic, M. K., Smith, C. J. Laboratory maintenance and cultivation of bacteroides species. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 13, Unit 13C 11 (2008).
- Doan, N., Contreras, A., Flynn, J., Morrison, J., Slots, J. Proficiencies of three anaerobic culture systems for recovering periodontal pathogenic bacteria. J. Clin. Microbiol. 37, 171-174 (1999).
- Socransky, S., Macdonald, J. B., Sawyer, S. The cultivation of Treponema microdentium as surface colonies. Arch. Oral. Biol. 1, 171-172 (1959).
- George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 9, 214-219 (1979).
- Wilson, K. H., Silva, J., Fekety, F. R. Suppression of Clostridium difficile by normal hamster cecal flora and prevention of antibiotic-associated cecitis. Infect. Immun. 34, 626-628 (1981).
- Wilson, K. H., Kennedy, M. J., Fekety, F. R. Use of sodium taurocholate to enhance spore recovery on a medium selective for Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 15, 443-446 (1982).
- Bliss, D. Z., Johnson, S., Clabots, C. R., Savik, K., Gerding, D. N. Comparison of cycloserine-cefoxitin-fructose agar (CCFA) and taurocholate-CCFA for recovery of Clostridium difficile during surveillance of hospitalized patients. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 29, 1-4 (1997).
- Marler, L. M., et al. Comparison of five cultural procedures for isolation of Clostridium difficile from stools. J. Clin. Microbiol. 30, 514-516 (1992).
- Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 1 (2009).
- Bouillaut, L., McBride, S. M., Sorg, J. A. Genetic manipulation of Clostridium difficile. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 2 (2011).
- Lemee, L., Pons, J. L. Multilocus sequence typing for Clostridium difficile. Methods. Mol. Biol. 646, 77-90 (2010).
- Shanholtzer, C. J., Peterson, L. R., Olson, M. N., Gerding, D. N. Prospective study of gram-stained stool smears in diagnosis of Clostridium difficile colitis. J. Clin. Microbiol. 17, 906-908 (1983).
- Smith, C. J., Markowitz, S. M., Macrina, F. L. Transferable tetracycline resistance in Clostridium difficile. Antimicrob. Agents Chemother. 19, 997-1003 (1981).
- Permpoonpattana, P., et al. Surface layers of Clostridium difficile endospores. J. Bacteriol. 193, 6461-6470 (2011).
- Putnam, E. E., Nock, A. M., Lawley, T. D., Shen, A. SpoIVA and SipL are Clostridium difficile spore morphogenetic proteins. J. Bacteriol. , (2013).
- Burns, D. A., Minton, N. P. Sporulation studies in Clostridium difficile. J. Microbiol. Methods. 87, 133-138 (2011).
- Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile. J. AOAC Int. 94, 618-626 (2011).
- Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. Inhibiting the initiation of Clostridium difficile spore germination using analogs of chenodeoxycholic acid, a bile acid. J. Bacteriol. 192, 4983-4990 (2010).
- O'Connor, J. R., et al. Construction and analysis of chromosomal Clostridium difficile mutants. Mol. Microbiol. 61, 1335-1351 (2006).
- Buggy, B. P., Wilson, K. H., Fekety, R. Comparison of methods for recovery of Clostridium difficile from an environmental surface. J. Clin. Microbiol. 18, 348-352 (1983).
- Koch, C. J., Kruuv, J. The release of oxygen from polystyrene Petri dishes. Br. J. Radiol. 45, 787-788 (1972).
- Ethapa, T., et al. Multiple factors modulate biofilm formation by the anaerobic pathogen Clostridium difficile. J. Bacteriol. , (2012).
- Speers, A. M., Cologgi, D. L., Reguera, G. Anaerobic cell culture. Curr. Protoc. Microbiol. Appendix 4, Appendix 4F (2009).
- Lyras, D., et al. Toxin B is essential for virulence of Clostridium difficile. Nature. 458, 1176-1179 (2009).
