Summary
我们提出的方法来研究的PSM和其他分泌的毒素的效果
Abstract
我们提出的方法来研究苯酚的可溶性modulins（PSM）的和其他毒素的金黄色葡萄球菌对中性粒细胞产生和分泌的效果。为了研究中性粒细胞的PSM隔离新鲜的中性粒细胞，采用密度梯度离心的效果。这些中性粒细胞钙动员后，荧光染料装入。激活中性粒细胞的PSM启动一个细胞内游离钙离子浓度的增加迅速而短暂的。在流式细胞仪实验，通过监视一个预载的荧光染料，反应的游离Ca 2 +浓度的增加，可以测量这种快速动员。使用这种方法，我们可以判断的的PSM浓度要激活的嗜中性粒细胞，并测量具体和一般的嗜中性粒细胞活化的抑制剂的影响。
要探讨的PSM中的表达，在细胞内的空间，瓦特我们构建操纵PSMαGFP融合的推动者记者。当这些记者菌株的黄色葡萄球菌的中性粒细胞吞噬，诱导表达可以用荧光显微镜观察。
Introduction
中性粒细胞（中性粒细胞）是专业吞噬细胞发挥 了关键作用，对金黄色葡萄球菌的先天免疫反应。主机和微生物之间不断的战斗已导致双方的军备竞赛。近日，社区相关（CA）株耐甲氧西林S.金黄色葡萄球菌 （MRSA）的出现，似乎是非常有效的规避中性粒细胞杀2,3。过量的苯酚，水溶性modulin（PSM）的生产的CA-MRSA一直伴随着较高的毒力4,5。人类嗜中性粒细胞能识别这些的PSM通过的FPR2导致活化的G蛋白偶联受体6。最早的事件之一是动员细胞内储存的钙（Ca 2 +的）。 Ca 2 +的作用作为第二信使的效应子功能的各种中性粒细胞的脱颗粒和吞噬作用7。因此的Ca 2 +是一个非常敏感的指标的PSM激活中性粒细胞功能的能力。的PSM对中性粒细胞的影响进行研究，新鲜的嗜中性粒细胞分离和钙动员后，荧光染料装入。流式细胞仪在实验中，这种快速的动员可以衡量的。使用这种方法，可以研究对中性粒细胞的毒性和其它组件的直接影响，并确定这些活性的最低浓度。对于我们来说，这是一个非常有用的工具来研究许多蛋白质产生的效果由S.金黄色葡萄球菌参与免疫逃避，如的FPR2抑制蛋白（FLIPR）8，FLIPR像7，抑制趋化蛋白的金黄色葡萄球菌 （筹）9。所有这些蛋白质已被证明能够抑制嗜中性粒细胞中钙的动员，通过结合受体识别激动剂。
最近，我们的组描述的PSM功能抑制血清脂蛋白10 </ SUP>。这些脂蛋白是大量存在于血液和人体组织，表明的PSM主要在细胞内环境中发挥其功能。钙动员检测的可用性允许激活中性粒细胞的PSM所表示的相当大的抑制血清中的浓度非常低，我们能够精确地测量血清脂蛋白的影响。
的PSM功能抑制血清中，我们假设，作为细胞内毒素的PSM是一个重要的功能。因此，我们试图确定后吞噬作用的PSM。要调查的PSM间隙的表达，我们已经建立了记者操纵psmαGFP融合的推动者。当这些记者菌株的的中性粒细胞吞噬金黄色葡萄球菌 ，观察到诱导表达用荧光显微镜10。显然，这样的构造共鸣装置允许大量的在S基因的表达研究后吞噬金黄色葡萄球菌或其他病原体。由于为S。间利基尚存在金黄色葡萄球菌是非常重要的是要克服先天免疫系统的11 10 12，在这个利基激活的基因的作用研究，以了解其毒力是高度相关的。
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Protocol
1。从人体血液中的中性粒细胞密度离心分离
- 抽取5毫升管静脉血肝素。
- 准备双层聚蔗糖梯度（4梯度为5管血）如下：倒入12毫升的密度1.119克/毫升在50毫升管中的聚蔗糖溶液中，并小心地层10毫升的密度1.077克/毫升的聚蔗糖溶液的顶部。
- 用等体积的PBS中，稀释血液。
- 层仔细双层聚蔗糖梯度稀释血液; 20-25毫升，每梯度。
- 以396×g离心20分钟，一个吊桶转子，22°C无制动。
- 准备冷RPMI含有0.05％的人血清白蛋白（RPMI-HSA）。还要准备9毫升无菌去离子H 2 O预冷的RPMI和H 2 O冰。
- 吸出含有等离子体（黄色）和PBMC的最佳聚蔗糖层和第二层的聚蔗糖（白色），使用用真空泵（把一个无菌移液管尖移液管）。
- 中性粒细胞收集在50毫升的试管，用一个小塑料吸管（1管，中性粒细胞每2梯度分数），并把它们放在冰。
- 加入冷的RPMI-HSA的总体积为50毫升，离心在4℃下以249×g的10分钟
- 脱掉上清液用真空泵的使用和涡流颗粒轻轻（红细胞和中性粒细胞）。
- 加入9毫升无菌去离子H 2 O和启动定时器。 30秒后完全停止超渗透压冲击，加入1 ml 10倍浓缩的PBS。注：30秒是非常关键的。
- 加入冷的RPMI-HSA的总体积为50毫升，离心在4℃下以249×g的10分钟
- 脱掉上清液与一真空泵的使用和收集的中性粒细胞的颗粒在1管与定义的体积（1-2毫升）的RPMI-HSA。
- 确定的细胞量的浓度调整到1.10 7个细胞/毫升。根据供体的，孤立的中性粒细胞的产率将是9:13连接5×10 6 3×10 7的中性粒细胞从每个9毫升管血
2。流式细胞仪检测方法的评估钙动员人力中性粒细胞
- 负载细胞（5×10 6细胞/ ml）与2μM氟-3 - AM在RPMI-HSA和孵育20分钟，在室温下缓慢地摆动，例如，一个使用摆动平台的振动筛，避光。
- 在此期间准备的刺激终浓度在10倍系列稀释（ 例如 3倍）。 PSMα3在这个协议中使用，但任何作用于嗜中性粒细胞的G蛋白偶联受体的刺激是合适的。
- 准备10倍浓缩RPMI-HSA受体抑制剂。当抑制剂在室温下10分钟，用等体积的抑制剂作用于预孵育25μl的刺激的刺激（ 例如，高密度脂蛋白年PSMα3）。
- 洗涤细胞，加入10ml的RPMI-HSA，并在室温下离心249×g离心。悬浮细胞，以5×10 6细胞/ ml。
- 在实验前，稀释细胞以2×10 6个细胞/毫升的RPMI-HSA和每FACS管中加入200μl的细胞。稀释后的中性粒细胞是很脆弱的。太长时间保持他们在此浓度下，会导致自动激活，也同样适用于剧烈摇晃或吹打。
- 连接管的流式细胞仪，等待3秒，并开始收购。经过一个固定的时间周期（ 例如 8秒），取下管，迅速 加入50微升样品的刺激。立即重新连接到样品架管，并继续收购。
- 开始的最低和最高浓度的刺激。 RPMI-HSA每次运行后定期清洗流式细胞仪针。
- 流式细胞仪分析软件分析数据。比较平均的荧光信号的刺激，然后加入另外的刺激后，使用适当的阳性和阴性对照，计算交流的tivation强度测量每个稀释度。
或者抑制剂时，作用于受体与抑制剂的细胞预孵育。
3。中性粒细胞吞噬细菌GFP基因的表达后荧光显微镜分析
- 成长S.金黄色葡萄球菌菌株记者晚上在利益结构肉汤（用抗生素时，须维持记者质粒）。在这种情况下，应变MW2含有GFP报告一个PSMα的构造是用来10，用5ml的LB培养基中生长在一个50毫升的塑料管。
- 要删除所有O / N表达GFP，淡化文化外径660 0.01增长到外径660 0.1。 Redilute这种文化1:30和监控增长，直到文化达到0.1外径660。离心收集细菌，并在DPBS洗一次。重悬在1:10原体积的取得的OD 660为1.0或roughly 5.10 8 CFU /毫升。
- 与新鲜分离的中性粒细胞在RPMI-HSA（比例10:1）（1.10 6 /毫升）1.5毫升的微管中的细菌（1.10 7个/ ml）混合，并添加至终浓度为10％合并的人血清。摇上摇10分钟的平台，在37°C至刺激的吞噬功能。装有细菌5.10 5中性粒细胞/ ml和吸取250微升入井8腔盖玻片稀释的中性粒细胞。
- 中性粒细胞与细菌在显微镜图片。 40X/0.85 NA物镜具有一个倒置显微镜配备工作良好，应包裹在黑暗的环境下腔室，保持环境稳定在37℃。一些使用相机的预设位置，每隔5-10分钟亮场和GFP的通道，按照GFP的生产时间获取图像。
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Representative Results
流式细胞仪检测评估钙动员人体中性粒细胞
孵化产生的合成PSMα3的钙离子流的增加在FL-1中的信号，这是显示所测得的快速激活的嗜中性粒细胞的浓度系列。预孵育合成PSMα3与0.01％，0.1％或1％人血清显着抑制的能力引起的钙通量（ 图1）。
中性粒细胞吞噬后在细菌中表达的GFP荧光显微镜分析
吞噬细菌含有PSMαGFP记者10日开始构建绿色荧光细胞吞噬后1至2小时，说明表达从PSMα启动。嗜中性粒细胞以外的细菌不发出荧光，或荧光显示细胞外细菌后，才形成致密的小菌落（ 图2）。这些数据表明，表达PSMα快速切换时，细菌被中性粒细胞吞噬。
图1。中性粒细胞活化由PSMα3。激活中性粒细胞的浓度范围内，作为衡量PSMα3钙动员。当非常低量的血清中加入中性粒细胞激活被抑制，而在1％血清几乎没有任何激活这些PSMα3浓度（改编自参考文献10）是可见的。
图2。诱导后表达PSMα的吞噬功能。嗜中性粒细胞吞噬S.允许含有金黄色葡萄球菌建设的推动者PSMα记者GFP融合。约1小时后开始吞噬作用的细胞内的细菌开始发出绿色荧光，表明的诗 α操纵子的表达，而细菌以外的嗜中性粒细胞（＃）在此时间范围内（改编自参考文献10）的诗 α表达不诱导。
图3。原理模型进行实验。中性粒细胞的分离和培养的PSM来衡量这些小的两亲性螺旋钙动员检测活化效果。当血清中的PSM不再激活中性粒细胞。研究细胞内EXPRE的ssion的PSM，含有绿色荧光蛋白融合的PSMα启动子的菌株混合血清和嗜中性粒细胞，以允许吞噬作用。 GFP的表达遵循使用时间推移荧光显微镜。 点击这里查看大图 。
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Discussion
在这里描述的方法中，一些步骤是非常关键的。我们将突出这些在这里。
如果在中性粒细胞通过密度梯度离心的分离，重要的是离心步骤期间或之后，为了不妨碍层。当使用塑料吸管吸嗜中性粒细胞，确保不要挤气球，而在细胞层，喷射液体会扰乱层。另外，目视检查后中性粒细胞颗粒渗透冲击和离心步骤。如果沉淀仍然是红色的红细胞裂解并不足够有效的，应再重复一次。如果发生这种情况，定期增加孵化时间与去离子H 2 O最多五秒钟便得到一个更完整的红细胞裂解。
对于钙动员的方法，重要的是有嗜中性粒细胞，孤立的新鲜。一般来说，细胞已被储存在冰箱中Ø长不会响应。他们要么有可能导致减少增加的刺激的效果已经激活，或者已经死了，不会回应。强烈的中性粒细胞聚集，是一个标志，他们是不新鲜了，应该被丢弃。
在显微镜设置几件事情是很重要的。为了能够观察到的GFP内的细菌增加，这是必要的高度稳定的GFP蛋白的一些稀释步骤和生长在一个非常低的水平，或根本不感兴趣的基因的表达的条件下该种细菌的除去所有。在我们的例子中，表示作为psmα操纵在高细胞密度13，两个反复稀释步骤之前，细胞达到日志中期阶段是足够的。此外，这些实验，这是最好的嗜中性粒细胞是新鲜的，特别是因为你可能会想跟着他们几个小时，在显微镜。加入碘化丙啶（PI）的RPMI-HSA缓冲液将允许可视化表达的PSM的嗜中性粒细胞的细胞膜的破坏。当PI添加，确保适当的过滤器可在红色PI荧光显微镜，因此不会干扰与GFP绿色荧光。尤其是当使用长通滤波器的GFP，PI肯定会干预。另一个有趣的选择是使用多个荧光报告中的细菌，如耦合用GFP报告，这将允许监控所有的细菌，使用共聚焦显微镜，它是很难看到非标记的细菌的染色体整合的CFP。另外，在使用多个标签的宽场荧光显微镜具有明显的优势。使用稳定的荧光记者，因为我们已经做的一个缺点是它们的稳定性。的GFP蛋白很慢周转允许监测开关记者，OFF开关可以轻松地进行可视化。对于这一项就需要使用企业所得税她不稳定GFP结构，或使用发光表达系统， 如力士操纵14供电。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争经济利益。
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluo-3, AM | Molecular Probes / Life Technologies | F-1241 | |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-5442-03 | density 1.077 g/ml |
| Histopaque | Sigma | 11191 | density 1.119 g/ml |
| RPMI 1640 | Gibco, Life Technologies | 52400-025 | contains 25 mM HEPES and L-glutamine |
| Leica TCS SP5 microscope | Leica Microsystems, The Netherlands | TCS SP5 | objective: HCX PL APO 40x/0.85 |
| FACSCalibur | BD Biosciences | FACSCalibur | Very important that the tube can be removed and replaced during the measurement process |
References
- Rigby, K. M., DeLeo, F. R. Neutrophils in innate host defense against Staphylococcus aureus infections. Semin. Immunopathol. 34, 237-259 (2012).
- Voyich, J. M., et al. Insights into Mechanisms Used by Staphylococcus aureus to Avoid Destruction by Human Neutrophils. The Journal of Immunology. 175, 3907-3919 (2005).
- Kobayashi, S. D., et al. Rapid neutrophil destruction following phagocytosis of Staphylococcus aureus. J. Innate Immun. 2, 560-575 (2010).
- DeLeo, F. R., Otto, M., Kreiswirth, B. N., Chambers, H. F. Community-associated meticillin-resistant Staphylococcus aureus. The Lancet. 375, 1557 (2010).
- David, M. Z., Daum, R. S. Community-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus: Epidemiology and Clinical Consequences of an Emerging Epidemic. Clinical Microbiology Reviews. 23, 616-687 (2010).
- Kretschmer, D., et al. Human Formyl Peptide Receptor 2 Senses Highly Pathogenic Staphylococcus aureus. Cell Host & Microbe. 7, 463 (2010).
- Prat, C., et al. A homolog of formyl peptide receptor-like 1 (FPRL1) inhibitor from Staphylococcus aureus (FPRL1 inhibitory protein) that inhibits FPRL1 and FPR. J. Immunol. 183, 6569-6578 (2009).
- Prat, C., Bestebroer, J., de Haas, C. J. C., van Strijp, J. A. G., van Kessel, K. P. M. A New Staphylococcal Anti-Inflammatory Protein That Antagonizes the Formyl Peptide Receptor-Like 1. The Journal of Immunology. 177, 8017-8026 (2006).
- de Haas, C. J., et al. Chemotaxis inhibitory protein of Staphylococcus aureus, a bacterial antiinflammatory agent. The Journal of Experimental Medicine. 199, 687-695 (2004).
- Surewaard, B. G. J., et al. Inactivation of Staphylococcal Phenol Soluble Modulins by Serum Lipoprotein Particles. PLoS Pathog. 8, e1002606 (2012).
- Kubica, M., et al. A Potential New Pathway for Staphylococcus aureus Dissemination: The Silent Survival of S. aureus Phagocytosed by Human Monocyte-Derived Macrophages. PLoS ONE. 3, e1409 (2008).
- Surewaard, B. G. J., et al. Staphylococcal alpha-phenol soluble modulins contribute to neutrophil lysis after phagocytosis. Cellular Microbiology. , In Press (2013).
- Queck, S. Y., et al. RNAIII-Independent Target Gene Control by the agr Quorum-Sensing System: Insight into the Evolution of Virulence Regulation in Staphylococcus aureus. Molecular Cell. 32, 150 (2008).
- Baban, C. K., et al. Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo. J. Vis. Exp. (69), e4318 (2012).
