Studieren Wechselwirkungen von Published: July 17, 2013 doi: 10.3791/50788

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Bas G.J. Surewaard¹, Jos A.G. van Strijp¹, Reindert Nijland¹

¹Medical Microbiology, University Medical Center Utrecht

Summary

Wir präsentieren Methoden, um die Wirkung von PSM und andere Giftstoffe ausgeschieden durch studieren

Abstract

Wir präsentieren Methoden, um die Wirkung von Phenol löslich modulins (PSM) und andere Toxine und Staphylococcus aureus auf Neutrophilen sezerniert studieren. Um die Auswirkungen der PSM auf Neutrophilen wir isolieren frisch Neutrophilen mittels Dichtegradientenzentrifugation studieren. Diese Neutrophilen werden mit einem Farbstoff, der auf Calcium-Mobilisierung fluoresziert geladen. Die Aktivierung von Neutrophilen durch PSMs initiiert eine rasche und vorübergehende Erhöhung der freien intrazellulären Calcium-Konzentration. In einem Experiment Durchflusszytometrie diese rasche Mobilisation kann durch Überwachung der Fluoreszenz eines vorinstallierten Farbstoff, der auf die erhöhte Konzentration an freiem Ca ^{2 +} reagiert gemessen werden. Mit dieser Methode können wir bestimmen, die PSM-Konzentration notwendig, um die Neutrophilen zu aktivieren, und messen die Auswirkungen von spezifischen und allgemeinen Inhibitoren der Aktivierung von Neutrophilen.

Um die Expression der PSMs in den intrazellulären Raum, w untersuchene konstruiert haben Reporter Fusionen der Promotor des PSMα Operon zu GFP. Wenn diese Reporter Stämme von S. aureus durch Neutrophile phagozytiert werden, kann die Induktion der Expression mittels Fluoreszenzmikroskopie beobachtet werden.

Introduction

Neutrophile (PMN) sind professionelle Fresszellen, die eine wichtige Rolle spielen bei der angeborenen Immunantwort gegen Staphylococcus aureus ^1. Der ständige Kampf zwischen Wirt und Mikrobe hat zu einem Wettrüsten der beiden führte. Kürzlich, community-associated (CA) Stämme von Methicillin-resistenten S. aureus (MRSA) sind entstanden, die zu sein scheinen sehr effizient in Umgehung der neutrophilen Tötung ^2,3. Übermäßige Phenol löslich modulin (PSMs) Produktion von CA-MRSA hat mit höherer Virulenz ^4,5 in Verbindung gebracht. Humanneutrophilen können diese PSMs über FPR2 die Aktivierung dieses G-Protein-gekoppelten Rezeptor ⁶ führen zu erkennen. Eines der frühesten Ereignisse ist die Mobilisierung von intrazellulären Speichern von Calcium (Ca ^{2 +).} Ca ^{2 +} wirkt als sekundärer Botenstoff für eine Vielzahl von Effektor-Funktionen von PMNs einschließlich Degranulation und Phagozytose ^7. Daher Ca ^{2 +} ist ein sehr empfindlicher Indikator für dieFunktionsfähigkeit PSMs zu PMN aktivieren. Um die Auswirkungen von PSM auf Neutrophilen studieren, werden frische Neutrophilen isoliert und mit einem Farbstoff, der auf Calcium Mobilisierung fluoresziert geladen. In einem Experiment Durchflusszytometrie diese rasche Mobilisierung gemessen werden kann. Mit diesem Verfahren ist es möglich, die direkte Auswirkungen von toxischen und anderen Komponenten auf Neutrophilen zu untersuchen und festzustellen, die niedrigste Konzentration, bei der diese aktiv sind. Für uns ist es ein sehr nützliches Werkzeug, um die Wirkung von vielen Proteinen von S. produziert studieren aureus in Immunevasion wie FPR2 hemmende Protein (FLIPR) ^8, FLIPR-like ⁷ und Chemotaxis hemmende Protein von Staphylococcus aureus (CHIPS) ⁹ beteiligt. All diese Proteine ​​haben gezeigt, dass das Calcium-Mobilisierung in Neutrophilen durch Bindung an den Rezeptor erkennt den Agonisten zu hemmen.

Vor kurzem hat unsere Gruppe beschrieben, dass PSMs funktionell gehemmt durch Serumlipoproteine ^{​​10 <}/ Sup>. Diese Lipoproteine ​​sind reichlich vorhanden im Blut und menschlichem Gewebe, was darauf hinweist, dass ihre Funktion ausüben PSMs vor allem in der intrazellulären Umgebung. Die Verfügbarkeit der Calciummobilisierung Assay erlaubt uns die präzise Messung der Wirkung von Serum-Lipoproteine ​​auf Aktivierung von Neutrophilen durch den PSM durch die erhebliche Hemmung durch sehr geringe Konzentrationen an Serum angegeben.

Da die PSMs funktionell gehemmt durch Serum, stellten wir die Hypothese, dass es eine wichtige Funktion für PSMs als intrazelluläre Toxine. Wir haben daher versucht, die Rolle der PSMs nach Phagozytose bestimmen. Um die Expression der PSMs in den interzellulären Raum zu untersuchen, haben wir Reporter Fusionen von dem Promotor des Operons psmα GFP konstruiert. Wenn diese Reporter Stämme von S. aureus durch Neutrophile wurden phagozytiert wurde die Induktion der Expression mittels Fluoreszenzmikroskopie beobachtet ^10. Offensichtlich kann diese technique ermöglicht die Untersuchung der Expression einer Vielzahl von Genen in S. aureus oder anderen Erregern nach Phagozytose. Da für S. aureus Überleben in der interzellulären Nische ist sehr wichtig, um das angeborene Immunsystem ^{11 10 12} zu überwinden, die Untersuchung der Rolle von Genen in dieser Nische aktiviert ist von großer Bedeutung für das Verständnis ihrer Virulenz.

Protocol

1. Isolation von PMN aus menschlichem Blut durch Dichtezentrifugation

1. Unentschieden 5 9 ml Röhrchen heparinisierter venösen Blut.
2. Bereiten Dual-Layer-Ficoll-Gradienten (4 Steigungen für 5 Gefäße Blut) wie folgt: Gießen Sie 12 ml mit einer Dichte von 1,119 g / ml Ficoll-Lösung in einem 50 ml-Tube und sorgfältig Schicht 10 ml mit einer Dichte von 1,077 g / ml Ficoll-Lösung an der Spitze.
3. Man verdünnt das Blut mit einem gleichen Volumen von PBS.
4. Schicht das verdünnte Blut vorsichtig auf die Dual-Layer-Ficollgradienten; 20-25 ml pro Gradienten.
5. Zentrifuge 20 min bei 396 xg in einem Ausschwingrotor, 22 ° C ohne Bremsen.
6. Bereiten kalt RPMI mit 0,05% Human Serum Albumin (RPMI-HSA). Auch bereiten 9 ml sterilem entionisiertem H ₂ O. Pre-kühlen sowohl die RPMI und H ₂ O auf Eis.
7. Absaugen der oberen Schicht mit Ficoll Plasma (gelbe Farbe) und PBMC, und die zweite Schicht von Ficoll (weiße Farbe) unter Verwendung einer Vakuumpumpe (Put eine sterile Pipettenspitzedie Pipette).
8. Sammeln Sie die PMN in 50 ml-Röhrchen mit einem kleinen Kunststoff-Pipette (1 Tube für die PMN Fraktionen von jeweils 2 Gradienten), und legen Sie sie auf Eis.
9. In kaltem RPMI-HSA auf ein Gesamtvolumen von 50 ml und Zentrifuge für 10 min bei 249 xg bei 4 ° C.
10. Nehmen Sie den Überstand mit dem Einsatz einer Vakuumpumpe und Wirbel das Pellet vorsichtig (Erythrozyten und Granulozyten).
11. In 9 ml sterilem entionisiertem H ₂ O und den Timer zu starten. Stoppen Sie den hyper osmotischen Schock nach 30 Sekunden genau, durch Zugabe von 1 ml 10 mal konzentrierter PBS. Hinweis: Die 30 Sekunden sind sehr kritisch.
12. In kaltem RPMI-HSA auf ein Gesamtvolumen von 50 ml und Zentrifuge für 10 min bei 249 xg bei 4 ° C.
13. Nehmen Sie den Überstand unter Verwendung einer Vakuumpumpe zu sammeln und das Pellet in 1 PMN Rohr mit einem definierten Volumen (1-2 ml) RPMI-HSA.
14. Bestimmen Sie die Menge an Zellen und stellen Sie die Konzentration auf 1,10 ⁷ Zellen / ml. Je nach Spender, wird die Ausbeute der isolierten PMN sein betwede 5 x 10 ⁶ und 3 x 10 ⁷ PMN von jedem 9 ml Röhrchen Blut

2. Durchflusszytometrischer Assay für die Bewertung von Calcium Mobilisierung in Human PMNs

1. Wägezellen (5 x 10 ⁶ Zellen / ml) mit 2 uM Fluo-3-AM in RPMI-HSA und Inkubation für 20 min bei Raumtemperatur langsam schaukeln, zum Beispiel unter Verwendung eines Wippschüttler Schüttler, vor Licht geschützt.
2. In der Zwischenzeit bereiten eine serielle Verdünnung (z. B. 3-fach) des Reizes bei 10x die Endkonzentration. PSMα3 wird in diesem Protokoll verwendet, aber jede GPCR Reiz, der auf Neutrophilen wirkt eignet.
3. Bereiten 10x konzentrierter Inhibitor des Rezeptors in RPMI-HSA. Wenn der Hemmstoff auf den Stimulus (zB HDL auf PSMα3) Pre-Inkubation 25 ul Stimulus wirkt mit einem gleichen Volumen an Inhibitor für 10 min bei Raumtemperatur.
4. Waschen der Zellen durch Zugabe von 10 ml RPMI-HSA und Zentrifuge für 249 xg bei Raumtemperatur. Die Zellen bis 5 x10 ⁶ Zellen / ml.
5. Kurz vor dem Experiment, verdünnt den Zellen bis 2x10 ⁶ Zellen / ml in RPMI-HSA und 200 ul Zellen pro FACS-Röhrchen. Das verwässerte PMN sind sehr zerbrechlich. Halten sie zu lange bei dieser Konzentration wird die Auto-Aktivierung führen, das gleiche gilt für kräftiges Schütteln oder Pipettieren.
6. Befestigen Sie das Rohr mit dem Durchflusszytometer, warten Sie 3 Sekunden und starten Akquisition. Nach einem festgelegten Zeitraum (zB 8 sec), nehmen Sie den Schlauch und schnell hinzufügen 50 ul Stimulus zur Probe. Sofort wieder anzubringen das Rohr auf dem Probenhalter und weiterhin den Erwerb.
7. Beginnen Sie mit der niedrigsten und mit der höchsten Konzentration an Reiz. Waschen Sie die Durchflusszytometer Nadel regelmäßig nach jedem Lauf mit RPMI-HSA.
8. Analysieren von Daten mit Durchflusszytometrie-Analyse-Software. Vergleichen Sie die durchschnittliche Fluoreszenz-Signal vor der Zugabe des Stimulus an, dass nach Zugabe des Stimulus und verwenden Sie die entsprechenden positiven und negativen Kontrollen an den AC berechnenMotivation Stärke für jede Verdünnung gemessen.

Alternativ, wenn der Inhibitor auf dem Rezeptor vor dem Inkubieren der Zellen mit dem Inhibitor wirkt.

3. Fluoreszenzmikroskopie Analyse von Bakterien GFP Expression nach Phagozytose durch PMN

1. Wachsen S. aureus-Stämme, die ein Reporter Konstrukt von Interesse über Nacht in der Brühe (mit Antibiotika, wenn erforderlich, um die Reporter-Plasmid aufrecht zu erhalten). In diesem Fall enthält ein Stamm MW2 PSMα GFP-Reporter-Konstrukt, ¹⁰ verwendet wird, gewachsen in einer 50 ml Plastikröhrchen mit 5 ml LB-Kulturmedium.
2. Um alle GFP von O / N Ausdruck entfernen, verdünnt den Kulturen zu OD ₆₆₀ 0,01 und wachsen bis zu einer OD ₆₆₀ 0,1. Redilute diese Kultur 1:30 und überwachen Wachstum bis die Kultur erreicht eine OD ₆₆₀ von 0,1. Sammeln Sie die Bakterien durch Zentrifugation und waschen einmal in DPBS. Resuspendieren im Maßstab 1:10 des ursprünglichen Volumens auf eine OD ₆₆₀ von 1,0 oder r erhaltengründlich 5.10 ⁸ CFU / ml.
3. Mischen Sie die Bakterien (1.10 ⁷ / ml) mit frisch isolierten PMN (1.10 ⁶ / ml) in RPMI-HSA (10:1) in einem 1,5 ml Mikroröhre und fügen gepoolten menschlichen Serum zu einer Endkonzentration von 10%. Schütteln auf einem Schüttler Plattform für 10 min bei 37 ° C bis Phagozytose stimulieren. Verdünnen Sie die PMN mit Bakterien bis 5.10 ⁵ PMN / ml und 250 ul Pipette in eine Vertiefung einer 8 gut Kammern Deckglas geladen.
4. Bild der PMN mit Bakterien auf einem Mikroskop. Ein umgekehrtes Mikroskop mit einer 40X/0.85 NA Ziel ausgestattet funktioniert gut und sollte in einer dunklen Umgebung Kammer werden eingehüllt, um die Umwelt stabil halten bei 37 ° C Erwerben Sie Bilder für eine Reihe von Preset-Positionen der Verwendung der Kamera alle 5-10 min sowohl im Hellfeld und dem GFP Kanal GFP-Produktion in der Zeit folgen.

Representative Results

Durchflusszytometrische Assay zur Beurteilung der Mobilisierung von Kalzium im menschlichen PMNs

Inkubieren Neutrophilen mit einer Konzentration Reihe synthetischer PSMα3 wodurch eine schnelle Aktivierung durch Calcium-Fluss, der durch eine Erhöhung des Signals im FL-1 gezeigt, wird gemessen. Pre-Inkubation von synthetischen PSMα3 mit 0,01%, 0,1% oder 1% humanem Serum erheblich behindert die Fähigkeit, Kalzium Flüsse (Abbildung 1) zu entlocken.

Analyse der GFP-Expression in Bakterien nach Phagozytose durch PMN mittels Fluoreszenzmikroskopie

Phagozytiert Bakterien enthaltend eine PSMα-GFP-Reporter-Konstrukt ¹⁰ Start zu fluoreszieren grün zwischen 1 und 2 Stunden nach der Phagocytose, was die Expression des PSMα Promotor. Bakterien außerhalb der Neutrophilen nicht fluoreszieren oder Fluoreszenz zeigen erst, nachdem die extrazellulären Bakterien dichte Mikrokolonien (Abbildung 2). DieseDaten zeigen, dass die Expression von PSMα schnell auf, wenn Bakterien durch PMNs phagozytiert geschaltet.

Abbildung 1. Aktivierung von Neutrophilen durch PSMα3. Aktivierung von Neutrophilen durch einen Konzentrationsbereich von PSMα3, wie Calcium Mobilisierung gemessen. Wenn sehr geringe Mengen an Serum aufgenommen werden die Neutrophilen-Aktivierung gehemmt wird, und bei 1% Serum kaum Aktivierung sichtbar ist bei diesen PSMα3 Konzentrationen (aus Lit. 10).

Abbildung 2. Die Induktion der Expression von PSMα nach Phagozytose.Neutrophile wurden phagozytieren S. erlaubt aureus enthaltend ein Reporter des Promotors PSMα konstruieren GFP fusioniert. Etwa 1 Stunde nach Beginn der Phagozytose die intrazellulären Bakterien beginnen zu fluoreszieren grün und zeigt die Expression des α psm-Operon, während die Bakterien außerhalb der Neutrophilen (#) nicht dazu veranlassen, die psm α Expression in diesem Zeitraum (aus Lit. 10).

Abbildung 3. Schematisches Modell der durchgeführten Versuche. Neutrophile isoliert wurden gewaschen und mit PSMs um die Aktivierung Wirkung dieser kleinen amphipathisches Helices in einem Calcium-Mobilisierung Assay zu messen. Wenn Serum zugesetzt wurde, wurden die PSMs neutralisiert und nicht mehr aktiviert die Neutrophilen. Um die intrazelluläre expre studierenssion der PSMs wurde ein Stamm, der eine Fusion der PSMα-Promotor-GFP mit Serum und Neutrophilen gemischt Phagozytose zu ermöglichen. GFP-Expression wurde unter Verwendung von Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie. Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Discussion

In der hier beschriebenen Verfahren einige Schritte sind sehr kritisch. Wir werden diese hier hervorzuheben.

Für die Isolierung von Neutrophilen durch Dichtegradientenzentrifugation ist es wichtig, die Schichten während oder nach der Zentrifugationsschritte stören. Wenn Ansaugen der Neutrophilen mit einem Kunststoff-Pipette, stellen Sie sicher nicht, um den Ballon zu quetschen, während in der Schicht von Zellen, wie Ausstoßen von Flüssigkeit werden die Schichten zu stören. Auch eine Sichtkontrolle des Pellet von Neutrophilen nach dem osmotischen Schock und Zentrifugationsschritt. Wenn das Pellet noch rot die Erythrozytenlyse war nicht effektiv genug, und sollte noch einmal wiederholt werden. Wenn dies geschieht regelmäßig, erhöhen die Inkubationszeit mit deionisiertem H ₂ O von bis zu fünf Sekunden, um eine vollständige Lyse der Erythrozyten zu bekommen.

Für die Mobilisierung von Kalzium-Methode ist es wichtig, Neutrophile, die isoliert sind, haben frisch. Im Allgemeinen haben die Zellen in den Kühlschrank gelagert wurdeo lange nicht so gut reagieren. Sie könnten entweder bereits aktiviert, was eine Abnahme der Wirkung des Stimulus hinzugefügt haben, oder sind gestorben und wird überhaupt nicht reagieren. Starke Aggregation von Neutrophilen ist ein Zeichen, dass sie nicht mehr frisch und sollte entsorgt werden.

In der Mikroskopie Setup mehrere Dinge wichtig sind. Um eine Erhöhung der GFP in den Bakterien zu beobachten, ist es notwendig, dass die hochstabile GFP-Proteins aus den Bakterien durch mehrere Verdünnungsschritte und Wachstum unter Bedingungen, bei denen das Gen von Interesse auf einem sehr niedrigen Niveau oder gar nicht exprimiert wird entfernt alle. In unserem Fall wird als psmα Operon bei hohen Zelldichten ^13, zwei Schritte wiederholt Verdünnung ausgedrückt vor erreichen die Zellen mid-log-Phase sind ausreichend. Auch für diese Experimente ist es am besten, dass die Neutrophilen frisch sind, zumal Sie vielleicht, um sie für mehrere Stunden in dem Mikroskop verfolgen. Hinzufügen von Propidiumiodid (PI) an die RPMIHSA-Puffer ermöglicht die Visualisierung der Störung des Neutrophilen-Membran durch die Expression der PSMs. Wenn PI hinzugefügt wird, stellen Sie sicher, dass die entsprechenden Filter verfügbar sind im Mikroskop so die rote Fluoreszenz PI nicht mit dem grünen GFP-Fluoreszenz stören. Insbesondere bei der Verwendung langer Pass Filter für GFP wird die PI definitiv stören. Eine weitere interessante Möglichkeit besteht darin, mehrere fluoreszierende Reporter in die Bakterien zu verwenden, wie beispielsweise eine chromosomale Integration von GFP mit einem GFP-Reporter, der für die Überwachung aller Bakterien mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie, wo es schwierig ist, nicht markierten Bakterien sehen erlauben würde gekoppelt. Auch in Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie mit mehreren Etiketten hat klare Vorteile. Ein Nachteil der Verwendung der stabilen fluoreszierenden Reporter wie wir es getan haben, ist ihre Stabilität. Die sehr langsame Umsatz des GFP-Proteins erlaubt nur die Überwachung der ON-Schalter des Reporters kann die AUS-Schalter nicht einfach visualisiert. Dafür müsste man eit verwendenihre instabile GFP-Konstrukte, oder verwenden Sie eine Lumineszenz Expression System, zB durch die Lux-Operon ¹⁴ angetrieben.