Lo studio delle interazioni di Published: July 17, 2013 doi: 10.3791/50788

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Bas G.J. Surewaard¹, Jos A.G. van Strijp¹, Reindert Nijland¹

¹Medical Microbiology, University Medical Center Utrecht

Summary

Presenteremo i metodi per studiare l'effetto di PSMs e altre tossine secrete da

Abstract

Vi presentiamo i metodi per studiare l'effetto di modulins solubili fenolo (PSM) e altre tossine prodotte e secrete da Staphylococcus aureus sui neutrofili. Per studiare gli effetti delle PSMs sui neutrofili isoliamo neutrofili freschi utilizzando densità centrifugazione in gradiente. Questi neutrofili sono caricati con un colorante fluorescente che su di mobilizzazione del calcio. L'attivazione dei neutrofili da PSMs avvia un aumento rapido e transitorio nella concentrazione di calcio intracellulare libero. In un esperimento di citometria a flusso questa rapida mobilitazione può essere misurata monitorando la fluorescenza di un colorante pre-caricato che reagisce alla maggiore concentrazione del Ca ^{2 +.} Usando questo metodo è possibile determinare la concentrazione di PSM necessario attivare la neutrofili, e misurare gli effetti degli inibitori specifici e generali di attivazione dei neutrofili.

Per studiare l'espressione dei PSMs nello spazio intracellulare, we hanno costruito fusioni giornalista del promotore dell'operone PSMα di GFP. Quando questi ceppi reporter di S. aureus sono fagocitati dai neutrofili, l'induzione di espressione può essere osservato mediante microscopia a fluorescenza.

Introduction

Neutrofili (PMN) sono fagociti professionali che svolgono un ruolo chiave nella risposta immunitaria innata contro Staphylococcus aureus ^1. La costante battaglia tra ospite e microbo ha portato a una corsa agli armamenti di entrambi. Recentemente, comunità-associati (CA) ceppi meticillino resistente S. aureus (MRSA) sono emerse, che sembra essere molto efficiente in elusione delle neutrofili uccisione ^2,3. Fenolo solubile modulin (PSM), eccessiva produzione di CA-MRSA è stato associato con una maggiore virulenza ^4,5. Neutrofili umani possono riconoscere questi PSMs via FPR2 che portano all'attivazione di tale G-proteina recettore accoppiato ^6. Uno dei primi eventi è la mobilitazione dei depositi intracellulari di calcio (Ca ^{2 +).} Ca ^{2 +} agisce come un messaggero secondario per una varietà di funzioni effettrici dei PMN compreso degranulazione e fagocitosi ^7. Pertanto Ca ^{2 +} è un indicatore molto sensibile dellacapacità funzionale del PSM per attivare PMN. Per studiare gli effetti di PSM su neutrofili, neutrofili freschi sono isolati e caricati con un colorante che reagisce su di mobilizzazione del calcio. In un esperimento di citometria a flusso questa rapida mobilitazione può essere misurata. Usando questo metodo, è possibile studiare gli effetti diretti di componenti tossici e di altro neutrofili, e determinare la concentrazione minima a cui essi sono attivi. Per noi, si tratta di uno strumento molto utile per studiare l'effetto di molte proteine ​​prodotte da S. aureus coinvolta in evasione immune, quali FPR2 proteina inibitoria (FLIPR) ^8, FLIPR-come ^7, e chemiotassi proteina inibitoria di Staphylococcus aureus (chips) ^9. Tutte queste proteine ​​hanno dimostrato di inibire la mobilizzazione del calcio in neutrofili legandosi al recettore che riconosce l'agonista.

Recentemente, il nostro gruppo ha descritto che PSM sono funzionalmente inibiti dalle lipoproteine ​​sieriche ^{10 <}/ Sup>. Queste lipoproteine ​​sono abbondantemente presenti nel sangue e tessuti umani, indicando che PSMs esercitano la loro funzione principalmente nell'ambiente intracellulare. La disponibilità del saggio mobilizzazione del calcio permesso di misurare con precisione l'effetto di lipoproteine ​​sieriche sull'attivazione dei neutrofili dai PSMs, indicata dalla notevole inibizione da concentrazioni molto basse di siero.

Poiché le PSMs sono funzionalmente inibiti dal siero, abbiamo ipotizzato che ci sia una funzione importante per PSMs come tossine intracellulari. Abbiamo quindi cercato di determinare il ruolo di PSM dopo la fagocitosi. Per studiare l'espressione dei PSMs nello spazio intercellulare, abbiamo costruito fusioni giornalista del promotore dell'operone psmα di GFP. Quando questi ceppi reporter di S. aureus sono stati fagocitati dai neutrofili, l'induzione dell'espressione era osservabile mediante microscopia a fluorescenza ^10. Ovviamente, questa technique consente di studiare l'espressione di un gran numero di geni in S. aureus o altri patogeni dopo fagocitosi. Poiché per S. aureus sopravvivendo nella nicchia intercellulare è molto importante per superare il sistema immune innato ^{11 10 12,} studiando il ruolo dei geni attivati ​​in questa nicchia è molto importante per comprendere la sua virulenza.

Protocol

1. Isolamento dei PMN dal sangue umano da densità centrifugazione

1. Disegnare 5 9 ml provette di sangue venoso eparina.
2. Preparare doppio strato gradienti Ficoll (4 gradienti per 5 provette sangue) come segue: Versare 12 ml di una densità di 1.119 g / ml soluzione Ficoll in un tubo da 50 ml e strato accuratamente 10 ml di una densità di 1,077 g / ml soluzione Ficoll in cima.
3. Diluire il sangue con un volume uguale di PBS.
4. Strato il sangue diluito con cura sullo strato doppio gradiente Ficoll; 20-25 ml per gradiente.
5. Centrifugare 20 min a 396 xg in un rotore oscillante, 22 ° C senza freni.
6. Preparare freddo RPMI contenente 0,05% di albumina sierica umana (RPMI-HSA). Anche preparare 9 ml sterile deionizzata H ₂ O. Pre-raffreddare sia il RPMI e H ₂ O in ghiaccio.
7. Aspirare lo strato superiore contenente Ficoll plasma (colore giallo) e PBMC, e il secondo strato di Ficoll (colore bianco) con l'uso di una pompa a vuoto (mettere un puntale sterile sullala pipetta).
8. Raccogliere i PMN in provette da 50 ml utilizzando una piccola pipetta di plastica (1 tubo per le frazioni di PMN ogni 2 sfumature), e disporli sul ghiaccio.
9. Aggiungere a freddo RPMI-HSA ad un volume totale di 50 ml e centrifugare per 10 min a 249 xg a 4 ° C.
10. Togliere il surnatante con l'uso di una pompa a vuoto e agitare delicatamente il pellet (eritrociti e PMN).
11. Aggiungere 9 ml sterile deionizzata H ₂ O e avviare il timer. Fermare l'iper shock osmotico dopo 30 sec esattamente, con l'aggiunta di 1 ml di 10 volte PBS concentrato. Nota: il 30 sec sono molto critici.
12. Aggiungere a freddo RPMI-HSA ad un volume totale di 50 ml e centrifugare per 10 min a 249 xg a 4 ° C.
13. Togliere il surnatante con l'uso di una pompa a vuoto e raccogliere il PMN pellet in 1 tubo con un volume definito (1-2 ml) RPMI-HSA.
14. Determinare la quantità di cellule e regolare la concentrazione di 1.10 ⁷ cellule / ml. A seconda del donatore, la resa dei PMN isolati sarà between 5 x 10 ⁶ e 3 x 10 ⁷ PMN da 9 ml ciascuna provetta di sangue

2. Flusso Assay Cytometric per la Valutazione di mobilizzazione del calcio in PMN umani

1. Celle di carico (5 x 10 ⁶ cellule / ml) con 2 mM Fluo-3-AM in RPMI-HSA e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente a dondolo lentamente, utilizzando per esempio un dondolo piattaforma shaker, al riparo dalla luce.
2. Nel frattempo preparare una diluizione seriale (es. 3 volte) dello stimolo a 10x la concentrazione finale. PSMα3 viene utilizzata in questo protocollo, ma qualsiasi stimolo GPCR che agisce sui neutrofili è adatto.
3. Preparare concentrato 10x inibitore del recettore in RPMI-HSA. Quando l'inibitore agisce sullo stimolo (ad es HDL on PSMα3) pre-incubare 25 microlitri stimolo con un volume uguale di inibitore per 10 min a temperatura ambiente.
4. Lavare le cellule aggiungendo 10 ml di RPMI-HSA e centrifugare per 249 xg a temperatura ambiente. Risospendere le cellule a 5 x10 ⁶ cellule / ml.
5. Appena prima dell'esperimento, diluire le cellule a 2x10 ⁶ cellule / ml in RPMI-HSA e aggiungere 200 microlitri cellule per provetta FACS. PMN diluito sono molto fragili. Tenerli troppo a lungo a questa concentrazione porterà ad auto-attivazione; lo stesso vale per l'agitazione vigorosa o pipettaggio.
6. Collegare il tubo al citofluorimetro, attendere 3 secondi e iniziare l'acquisizione. Dopo un determinato periodo di tempo (ad esempio, 8 sec), togliere il tubo e in rapida aggiungere 50 microlitri di stimolo al campione. Subito ricollegare il tubo sul supporto del campione e continuare l'acquisto.
7. Iniziare con il più basso e terminare con la più alta concentrazione di stimolo. Lavare l'ago citofluorimetro regolarmente dopo ogni esecuzione con RPMI-HSA.
8. Analizzare i dati con il software di analisi di citometria a flusso. Confrontare il segnale di fluorescenza media prima dell'aggiunta del stimolo che dopo aggiunta dello stimolo e utilizzare gli opportuni controlli positivi e negativi per calcolare l'acforza tivazione per ogni diluizione misurato.

Alternativamente quando l'inibitore agisce sui recettori pre-incubare le cellule con l'inibitore.

3. Microscopia a fluorescenza Analisi di batteri espressione GFP dopo fagocitosi da parte dei PMN

1. Grow S. aureus contenenti un costrutto giornalista di interesse per tutta la notte in brodo (con antibiotici quando necessario per mantenere il plasmide reporter). In questo caso MW2 ceppo contenente una PSMα costrutto reporter di GFP è usato ^10, cresciuto in un tubo di plastica da 50 ml con 5 ml di coltura LB medium.
2. Per rimuovere tutte le GFP da espressione O / N, diluire le culture di OD ₆₆₀ 0,01 e crescere per OD ₆₆₀ 0.1. Redilute questa cultura 1:30, e monitorare la crescita fino a quando la cultura raggiunge un diametro esterno di ₆₆₀ 0.1. Raccogliere i batteri mediante centrifugazione e lavare una volta in DPBS. Risospendere in 1:10 del volume originale per ottenere un OD ₆₆₀ di 1,0 o rviti e dei dadi 5.10 ⁸ UFC / ml.
3. Mescolare i batteri (1,10 ⁷ / ml) con PMN appena isolate (1.10 ⁶ / ml) in RPMI-HSA (rapporto 10:1) in una provetta 1,5 ml e aggiungere siero umano riunito a una concentrazione finale del 10%. Agitare su una piattaforma di agitazione per 10 min a 37 ° C per stimolare la fagocitosi. Diluire i PMN carichi di batteri a 5.10 ⁵ PMN / ml e pipetta 250 microlitri in un pozzo di un vetrino ben camerata 8.
4. Immagine dei PMN con batteri su un microscopio. Un microscopio invertito dotato di un obiettivo NA 40X/0.85 funziona bene e deve essere racchiuso in una camera ad ambiente scuro per mantenere l'ambiente stabilmente a 37 ° C. Acquisire immagini per un certo numero di posizioni preimpostate utilizzando la telecamera ogni 5-10 min sia nel campo chiaro e il canale GFP per seguire la produzione GFP nel tempo.

Representative Results

Flusso saggio citometria per la valutazione di mobilizzazione del calcio in PMN umani

Incubando neutrofili con una serie di concentrazione PSMα3 sintetici conseguente attivazione rapida come misurato da flusso di calcio, che è indicata da un aumento nel segnale in FL-1. Pre-incubazione di sintetico PSMα3 con 0,01%, siero umano 0,1% o 1% inibito significativamente la capacità di suscitare flussi di calcio (Figura 1).

Analisi di espressione GFP nei batteri dopo la fagocitosi da PMN mediante microscopia a fluorescenza

Batteri fagocitati contenenti un giornalista PSMα-GFP costruiscono ¹⁰ inizio a fluorescenza verde tra 1 e 2 ore dopo la fagocitosi, indicando espressione dal promotore PSMα. Batteri fuori dei neutrofili non reagiscono, o mostrano fluorescenza solo dopo che i batteri extracellulari hanno formato microcolonie dense (Figura 2). Questidati indicano che l'espressione di PSMα è acceso rapidamente quando i batteri vengono fagocitati dai PMN.

Figura 1. Attivazione dei neutrofili da PSMα3. Attivazione di neutrofili da un intervallo di concentrazione di PSMα3, come misurato da mobilizzazione del calcio. Quando vengono aggiunte quantità molto basse di siero l'attivazione dei neutrofili è inibito, e al siero 1% quasi nessuna attivazione è visibile in questi PSMα3 concentrazioni (Adattato da riferimento 10).

Figura 2. Induzione dell'espressione di PSMα dopo fagocitosi.I neutrofili sono stati autorizzati a fagocitare S. aureus contenente un reporter costrutto del promotore di PSMα fusa alla GFP. Circa 1 ora dopo l'inizio della fagocitosi dei batteri intracellulari iniziano a fluorescenza verde, che indica l'espressione del PSM α operone, mentre i batteri di fuori dei neutrofili (#) non provocare l'espressione α PSM in questo lasso di tempo (Adattato da riferimento 10).

Figura 3. Modello schematico degli esperimenti eseguiti. Neutrofili sono stati isolati e incubati con PSMs per misurare l'effetto di attivazione di queste piccole eliche anfipatiche in un saggio di mobilizzazione del calcio. Quando è stato aggiunto siero, i PSMs state neutralizzate e non più attivati ​​i neutrofili. Per studiare il expre intracellularession delle PSMs, un ceppo contenente una fusione del promotore di PSMα-GFP è stata miscelata con siero e neutrofili per consentire fagocitosi. Espressione GFP è stata seguita con time-lapse microscopia a fluorescenza. Clicca qui per ingrandire la figura .

Discussion

Nei metodi descritti qui alcuni passaggi sono molto critico. Ci metterà in evidenza questi qui.

Per l'isolamento dei neutrofili centrifugazione in gradiente di densità è importante non disturbare gli strati durante o dopo le fasi di centrifugazione. Quando aspirazione dei neutrofili utilizzando una pipetta di plastica, fare attenzione a non schiacciare il pallone, mentre nello strato di cellule, come liquido di espulsione disturberà gli strati. Inoltre, controllare visivamente il pellet di neutrofili dopo lo shock osmotico e la fase di centrifugazione. Se il pellet è ancora rosso la lisi degli eritrociti non era abbastanza efficace, e deve essere ripetuto ancora una volta. Se questo accade regolarmente, aumentare il tempo di incubazione con H ₂ O deionizzata fino a cinque secondi per ottenere una lisi eritrocitaria più completa.

Per il metodo di mobilizzazione del calcio è importante disporre di neutrofili che sono isolati fresco. In generale, le cellule che sono stati conservati in frigorifero ao lungo non risponde pure. Essi o potrebbero aver attivato già causando una diminuzione dell'effetto dello stimolo aggiunta, o sono morti e non risponderà affatto. Forte aggregazione di neutrofili è un segno che non sono freschi più e devono essere eliminati.

Nella configurazione microscopia diverse cose sono importanti. Per essere in grado di osservare un aumento di GFP all'interno dei batteri, è necessario che la proteina GFP altamente stabile viene rimosso dai batteri attraverso numerosi passaggi di diluizione e di crescita in condizioni in cui il gene di interesse è espressa ad un livello molto basso o non a tutti. Nel nostro caso, come l'operone psmα è espresso a elevate densità cellulari ^13, a due passi diluizione ripetuti prima che le cellule raggiungono fase di mid-log sono sufficienti. Anche per questi esperimenti, è meglio che i neutrofili sono freschi, soprattutto perché si potrebbe desiderare di seguirli per diverse ore al microscopio. Aggiunta di propidio ioduro (PI) alla RPMITampone-HSA permetterà la visualizzazione della perturbazione della membrana neutrofili dall'espressione dei PSMs. Quando viene aggiunto PI, assicurarsi che i filtri appropriati sono disponibili nel microscopio così il rosso PI fluorescenza non interferisce con il verde fluorescenza GFP. Specialmente quando si utilizzano filtri passaggio lungo per GFP, il PI sarà sicuramente interferire. Un'altra opzione interessante è quella di utilizzare reporter fluorescenti multiple nei batteri, come una integrazione cromosomica di PCP accoppiato con un reporter GFP, che consentirebbe il monitoraggio di tutti i batteri utilizzando la microscopia confocale, dove è difficile vedere batteri non marcate. Anche nel vasto campo microscopia a fluorescenza con più etichette presenta chiari vantaggi. Un inconveniente di utilizzare i reporter fluorescenti stabili come abbiamo fatto è la loro stabilità. L'molto lento turnover della proteina GFP consente solo il monitoraggio della ON-interruttore del giornalista, l'off-interruttore non può essere visualizzato facilmente. Per questo sarebbe necessario utilizzare eiti suoi costrutti GFP instabili, oppure utilizzare un sistema di espressione di luminescenza alimentato da esempio la Lux operone ^14.