の相互作用を研究 Published: July 17, 2013 doi: 10.3791/50788

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Bas G.J. Surewaard¹, Jos A.G. van Strijp¹, Reindert Nijland¹

¹Medical Microbiology, University Medical Center Utrecht

Summary

我々はによって分泌のPSMや他の毒素の影響を研究するための方法を提示

Abstract

私たちは、好中球上の黄色ブドウ球菌によって産生され、分泌されるフェノール可溶性のmodulins（PSMが）や他の毒素の影響を研究するための方法を提示する。我々は、密度勾配遠心分離を使用した新鮮な好中球を分離した好中球上のPSMの効果を研究する。これらの好中球は、カルシウム動員により蛍光を発する色素でロードされます。 PSMはによって好中球の活性化は、自由細胞内カルシウム濃度の急激かつ一過性の上昇を開始します。フローサイトメトリー実験で急速な動員は、遊離Ca ^{2 +}濃度の増加に反応プリロードされた色素の蛍光をモニターすることによって測定することができる。この方法で用いて、我々は、好中球を活性化し、好中球活性化の特異的かつ一般的な阻害剤の効果を測定する必要がPSMの濃度を決定することができる。

細胞内空間、WでのPSMの発現を調べるために、電子GFPへPSMαオペロンのプロモーターのレポーター融合を構築した。ときS.これらのレポーター株黄色ブドウ球菌は、好中球によって貪食され、発現の誘導は、蛍光顕微鏡を用いて観察することができる。

Introduction

好中球（PMNは）は、 黄色ブドウ球菌 ¹に対する自然免疫応答において重要な役割を果たす専門の食細胞である。宿主と微生物の間に一定の戦いは双方の軍備競争につながっている。メチシリン耐性S.の最近では、コミュニティ関連（CA）の株黄色ブドウ球菌 （MRSA）は、好中球の殺害^2,3の回避は非常に効率的であるように見えることが浮上している。 CA-MRSAの過剰フェノール可溶性のモジュリン（のPSM）生産は^4,5高病原性と関連している。ヒト好中球は、このGタンパク質共役受容体⁶の活性化につながるFPR2を介してこれらのPSMを認識することができます。最古のいずれかのイベントは、カルシウムの細胞内貯蔵（のCa ^{2 +）}の動員である。 Ca ^{2 +}の脱顆粒と貪食⁷を含めたPMNのエフェクター機能の様々な二次メッセンジャーとして機能します。したがってのCa ^{2 +}の非常に敏感な指標であるたPMNを活性化するためのPSMの機能的能力。好中球上のPSMの効果を研究するために、新鮮な好中球がカルシウム動員により蛍光を発する色素を分離し、ロードされます。フローサイトメトリー実験で急速な動員を測定することができる。この方法を使用すると、好中に有毒で他の成分の直接的な影響を検討し、これらがアクティブである最低濃度を決定することができる。私たちにとって、それはS.によって生成された多くのタンパク質の効果を研究するための非常に便利なツールです黄色ブドウ球菌は、そのようなFPR2阻害タンパク質^{（FLIPR）8、7} FLIPRような、および黄色ブドウ球菌 ^（CHIPS）9の走化性阻害タンパク質として免疫回避に関与。すべてのこれらのタンパク質は、アゴニストを認識する受容体に結合することにより、好中球カルシウム動員を阻害することが示されている。

最近では、私たちのグループはのPSMは機能¹⁰血清リポタンパク質によって阻害されていることを説明した^</>（商標）。これらのリポタンパク質は、PSMは、主に細胞内環境でその機能を発揮することを示し、血液や人体組織内に豊富に存在している。カルシウム動員アッセイの有用性は、血清の非常に低濃度でかなりの阻害によって示されるように、私たちは正確にのPSMによる好中球の活性化に血清リポタンパク質の効果を測定することができました。

PSMは、機能的には、血清によって阻害されるので、細胞内毒素としてのPSMための重要な機能があるという仮説を立てた。したがって、我々は貪食後のPSMの役割を決定しようとした。細胞間隙でのPSMの発現を調べるために、我々は、GFPにpsmαオペロンのプロモーターのレポーター融合を構築した。ときS.これらのレポーター株黄色ブドウ球菌は、好中球によって貪食された、発現の誘導を、蛍光顕微鏡^10を用いて観測した。明らかに、このTEChniqueはS.で多数の遺伝子の発現の研究を可能にする貪食後に黄色ブドウ球菌や他の病原体。 S.のために導入されたバージョン細胞間のニッチで生き残る球菌は ^{11 10 12}自然免疫系を克服するために非常に重要であり、このニッチで活性化する遺伝子の役割を研究すると、その病原性を理解することに非常に関連しています。

Protocol

1。密度遠心分離によるヒト血液からのPMNの分離

1. ヘパリン加静脈血の星9 mlチューブを描画します。
2. 次のように二重の層フィコール勾配（5管の血のための4つの勾配）を準備：50 mlチューブで密度1.119グラム/ mlのフィコール溶液を12mlのその上に密度1.077グラム/ mlのフィコール溶液を注意深く層10ミリリットルを注ぐ。
3. PBS等量の血液を希釈する。
4. 層のデュアルレイヤーフィコール勾配注意深く希釈血液;勾配20〜25 mlであった。
5. スイングバケットローターで396×gで、22°ブレーキなしCで20分間遠心します。
6. （RPMI-HSA）ヒト血清アルブミン、0.05％を含む風邪RPMIを準備します。また、9ミリリットルの無菌脱イオンH ₂ Oを調製プリクール氷の上でRPMIとH ₂ Oの両方。
7. （滅菌ピペットチップを上に置く、真空ポンプの使用と血漿（黄色）とPBMCを含むトップフィコール層、およびフィコールの第二層（白色）を吸引ピペット）。
8. 小さなプラスチック製のピペット（毎週2勾配のPMN画分1管）を使用して50ミリリットルチューブにPMNをを収集し、氷の上に置きます。
9. 4℃で249×gで10分間、50ml及び遠心分離機の総体積℃に冷RPMI-HSAを追加する
10. 真空ポンプ、ボルテックス優しくペレット（赤血球とのPMN）の使用と上清を脱ぐ。
11. 9ミリリットル滅菌脱イオンH ₂ Oを追加して、タイマーを開始。 1ミリリットル10倍濃縮されたPBSを追加することにより、正確に30秒後にハイパー浸透圧ショックを停止します。注：30秒は非常に重要です。
12. 4℃で249×gで10分間、50ml及び遠心分離機の総体積℃に冷RPMI-HSAを追加する
13. 真空ポンプを利用して上清を脱いで、定義されたボリューム（1-2 ml）をRPMI-HSAで1チューブにPMNペレットを収集します。
14. 細胞の量を決定し、1.10 ⁷細胞/ mlの濃度を調整します。ドナーに応じて、単離されたPMNの収率はbetweになる血液の各9ミリリットルチューブから専用5×10 ⁶と3×10 ⁷ PMNは

2。人間のPMNにおけるカルシウム動員の評価のためのフローサイトメトリーアッセイ

1. 2μMとロードセル（5×10 ⁶細胞/ ml）のFluo-3-AM室温で20分、光から保護し、ロッキングプラットフォームシェーカー例えば使用、ゆっくりとロッキング用RPMI-HSAとインキュベートした。
2. その間に10倍の最終濃度で刺激の段階希釈（ 例えば 3倍）をご用意。 PSMα3は、このプロトコルで使用されるが、好中球に作用する任意のGPCR刺激は好適である。
3. RPMI-HSAで受容体の10倍濃縮された阻害剤を準備します。阻害剤は、室温で10分間阻害等量の刺激（PSMα3で例えば HDL）プレインキュベートし、25μlの刺激に作用するとき。
4. 室温で249×gで、10 RPMI-HSA mlの遠心機を追加することで、細胞を洗浄。 5×に細胞を再懸濁し10 ⁶細胞/ ml。
5. ただ、実験前、RPMI-HSAで2×10 ⁶細胞/ mlに細胞を希釈し、FACSチューブあたり200μlのセルを追加。希薄化後のPMNは非常に壊れやすいです。自動活性化につながるこの濃度ではあまりにも長い間それらを維持、同じことは、積極的な揺れやペッティングのために保持しています。
6. フローサイトメーターにチューブを取り付け、3秒待ってから取得を開始します。一定の時間（ 例えば 8秒）の後、チューブを外して、急速にサンプルに50μlの刺激を加える。直ちに試料ホルダーにチューブを再度取り付け、買収を続行します。
7. 刺激の最高濃度と最低で始まり。 RPMI-HSAで各実行後に定期的にフローサイトメーターの針を洗ってください。
8. フローサイトメトリー分析ソフトウェアを使用してデータを分析する。刺激を加えた後、それに刺激の添加前の平均蛍光シグナルを比較して、交流を計算するために適切な正および負のコントロールを使用測定された各希釈用tivati​​on強度。

あるいは、阻害剤は受容体阻害剤とプレインキュベートした細胞に作用したとき。

3。 PMNはによって貪食後の細菌GFP発現の蛍光顕微鏡分析

1. S.を育てるブロス中晩関心のレポーターコンストラクトを（レポータープラスミドを維持するために必要な抗生物質）を含む黄色ブドウ球菌株 。この場合PSMαGFPレポーター構築物を含む株をMW2はLB培地5mlの50ミリリットルプラスチックチューブ中で増殖^10に使用される。
2. O / N式からすべてのGFPを削除するには、OD ₆₆₀ 0.01に文化を希釈し、OD ₆₆₀ 0.1まで成長。この文化1:30 Redilute、そして文化が0.1のOD _660に到達するまでの成長を監視する。遠心分離により細菌を収集し、DPBSに一度洗う。 1.0またはRのOD _660を得るために、元のボリュームの1時10に懸濁しoughly 5.10 ⁸ CFU / mlの。
3. 1.5 mlのマイクロチューブでRPMI-HSA（比率10:1）で新たに単離したPMN（1.10 ⁶ / ml）で細菌を（1.10 ⁷ / ml）を混合し、10％の最終濃度にプールされたヒト血清を追加します。 37時10分°C食作用を刺激するための揺れプラットフォームに振る。 5.10 ⁵のPMN / mlで8よくチェンカバースリップのウェルに250μlのピペットにバクテリアを搭載したPMNを希釈。
4. 顕微鏡で細菌とのイメージのPMNを。 40X/0.85 NA目標装備倒立顕微鏡は、うまく機能し、37℃で安定した環境を維持するために暗い環境室に包まれるべき℃のカメラの明視野と時間におけるGFPの生産をフォローするGFPチャネルの両方のすべての5-10分を使用してプリセット位置の数のための画像を取得する。

Representative Results

人間のPMNの内カルシウム動員の評価のためのフローサイトメトリーアッセイ

FL-1におけるシグナルの増加によって示されるカルシウム流入によって測定されるように急速な活性化をもたらす合成PSMα3の濃度一連の好中球をインキュベートする。 0.01％で合成PSMα3のプレインキュベーション、0.1％または1％のヒト血清が大幅カルシウムフラックス（ 図1）を誘発する能力を阻害した。

蛍光顕微鏡を用いたPMNによる貪食後の細菌におけるGFP発現の分析

PSMα-GFPレポーターを含む貪食細菌はPSMαプロモーターからの発現を示す、貪食後に緑1〜2時間の蛍光を発するように¹⁰スタートを構築する。好中球外細菌は蛍光を発する、または細胞外細菌が高密度微小コロニーを（ 図2）を形成した後にのみ、蛍光表示されません。これらのデータは、PSMαの発現が急速に細菌がPMNを貪食されたときに切り替えられることを示している。

図1。 PSMα3によって好中球活性化。カルシウム動員によって測定されるようPSMα3、の濃度範囲で好中球の活性化。血清の非常に少量が追加されると好中球活性化を阻害し、そして血清を1％ほとんどすべての活性化は、これらのPSMα3濃度（参照10から適応）で表示される。

図2。貪食後PSMαの発現の誘導。好中球を貪食Sに許されていた記者はPSMαのプロモーターの構築物を含む黄色ブドウ球菌は、GFPに融合。貪食の開始後約1時間は、細胞内細菌は、好中球（＃）外細菌がこの時間枠でのPSMα発現を（参照10から適応）誘発しないのに対し、PSMαオペロンの発現を示す、緑色蛍光を発するように開始します。

図3。実験の模式的なモデルが行わ。好中球を単離し、カルシウム動員アッセイにおけるこれらの小さな両親媒性ヘリックスの活性化効果を測定するためのPSMと共にインキュベートした。血清を添加した場合、のPSMを中和し、もはや好中球を活性化しなかった。細胞内expreを研究するのPSMのssionは、GFPにPSMαプロモーターの融合を含有する株は食作用を可能にするために、血清及び好中球と混合した。 GFPの発現はタイムラプス蛍光顕微鏡を用いて行った。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。

Discussion

ここで説明する方法では、いくつかのステップは非常に重要です。ここでは、これらをハイライト表示さ​​れます。

密度勾配遠心分離により好中球の単離のためには、遠心分離ステップの間または後に層を妨げないことが重要である。プラスチックピペットを用いて好中球を吸引すると、液体を吐出するレイヤーを邪魔するように、細胞の層の中に風船を圧迫しないように確認してください。また、視覚的に浸透圧ショック、遠心分離工程後の好中球のペレットを検査します。ペレットがまだ赤の場合赤血球溶解が十分に効果的でなかったし、もう一度繰り返す必要があります。これは定期的に発生する場合は、より完全な赤血球溶解を得るために5秒までで脱イオンH ₂ Oでインキュベーション時間を増やします。

カルシウム動員法のためには、新鮮な単離された好中球を有することが重要である。一般に、細胞への冷蔵庫に保存されていることO長いも応答しません。彼らはどちらか既に追加刺激策の効果の減少の原因となって活性化したかもしれない、または死亡していると、まったく反応しません。好中球の強力な集約は、彼らがもはや新鮮で​​はないので、破棄されるべきであることを示しています。

顕微鏡のセットアップでいくつかのことが重要である。細菌内部のGFPの増加を観察することができるように、それは非常に安定したGFPタンパク質は、目的の遺伝子は非常に低レベル否かで発現される条件下で、いくつかの希釈工程及び成長によって細菌から除去されることが必要であるすべて。細胞は中期対数期に到達する前にpsmαオペロンが高い細胞密度^13、2繰り返し希釈工程で発現されるように我々の場合には、十分です。また、これらの実験のために、それはあなたが顕微鏡で数時間のためにそれらをフォローしたいかもしれない、特に以来、好中球は、新鮮であることがベストです。 RPMIにヨウ化プロピジウム（PI）を追加する-HSAバッファはPSMはの発現により好中球膜の破壊の可視化が可能になります。 PIが追加されると、赤色PI蛍光が緑色のGFP蛍光と干渉しないように、適切なフィルタが顕微鏡で使用可能であることを確認してください。 GFP用ロングパスフィルタを使用する場合は特に、PIは間違いなく干渉します。もう一つの興味深いオプションは、それが非標識細菌を参照することは困難である共焦点顕微鏡を使用して、すべての細菌のモニタリングを可能にするGFPレポーター、と相まってCFPの染色体統合として、細菌で複数の蛍光レポーターを使用することです。また、複数のラベルを使用して広い視野蛍光顕微鏡で明確な利点があります。私たちが行ったように安定した蛍光レポーターを使用することの欠点は、それらの安定性である。 GFPタンパク質の非常に遅い売上高だけレポーターのONスイッチの監視ができ、OFFスイッチは、簡単に視覚化することができません。これはEITを使用する必要がありますため彼女の不安定GFPコンストラクト、または例えばルクスオペロン¹⁴を搭載した発光式システムを使用しています。