Summary
Inchworming er en meget repetitiv synkron grave bevægelse vises ved BTBR T + Itpr 3TF / J (BTBR) mus, når de placeres i en test bur med tilstrækkelig savsmuld sengetøj. Proceduren er en modifikation af den unge social interaktion protokol og bruges her til at vurdere gentagne motoriske stereotypier relevante for autismespektrumforstyrrelser.
Abstract
Autisme Spektrum Disorder (ASD) er et adfærdsmæssigt defineret neurologisk udviklingsforstyrrelse karakteriseret ved nedsat gensidig social interaktion, unormal kommunikation, og gentagne adfærd med begrænset interesse. Da diagnosen er baseret på kliniske kriterier, bør enhver potentielt relevante gnaver modeller af denne heterogene lidelse ideelt rekapitulere disse forskellige adfærdstræk. Den BTBR T + Itpr3 tf / J (BTBR) mus er en etableret dyremodel af ASD, viser gentagne adfærd såsom øget pleje, samt kognitive ufleksible. Med hensyn til social interaktion og interesse, har den unge play test været ansat i flere gnavermodeller for ASF. Her viser vi, at når BTBR mus testes i en juvenil social interaktion kabinet, der indeholder savsmuld strøelse, de udviser et repetitivt synkron grave bevægelse. Denne gentagne motoriske adfærd, kaldet "inchworming", blev navngivetpå grund af den stereotypiske karakter af de bevægelser, som udvises af musene, mens flytte vandret hen over gulvet. Inchworming mus skal bruge deres for-og bagben-lemmer synkront at forskyde strøelse, udfører mindst en aktiv og en passiv bevægelse. Selvom både BTBR og C56BL/6J (B6) mus udviser denne adfærd, BTBR mus demonstrere en signifikant højere varighed og hyppighed af inchworming og en nedsat latenstid at indlede inchworming når de anbringes i en sengeliggende kabinet. Vi konkluderer, at dette nyligt beskrevet adfærd giver et mål for en repetitiv motor stereotypi, der let kan måles i dyremodeller af ASF.
Introduction
Selv patofysiologi autismespektrumforstyrrelser (ASF) er fortsat uklart, diagnose afhænger af tilstedeværelsen af tre brede symptom kategorier: unormal social gensidighed, nedskrivninger i kommunikation, og gentagne / stereotype adfærdsmønstre 1. De fleste gnavermodeller er i stand til samtidigt at reproducere alle tre gener i en enkelt dyr. Således modeller, der pålideligt kan simulere nogle eller alle aspekter af sygdommen har stor værdi for udvikling af effektive forebyggende og terapeutiske strategier. En model, der gør vise alle tre aspekter af ASD er BTBR mus 1,2.
I kombination med ultralyd vocalizations og social tilgang analyser, er den unge social interaktion test almindeligt anvendt til at karakterisere musemodeller for pædiatrisk ASD; disse tests foranstaltning faldt og unormal social adfærd, som repræsenterer centrale funktioner i ASF. Ud over den unge social interaktion test, mange andretest er blevet brugt til at måle stereotyp adfærd i dyremodeller af ASF. For eksempel marmor nedgravning test, der undersøger tendensen af et dyr til at forskyde strøelse hjælp snuden og forpoterne i forsøg på at behandle en genstand, menes at måle kompulsiv stereotypisk adfærd, der opstår som reaktion på aversiv stimuli 3,4. Derfor har grave tests blevet gennemført for at kvantificere denne gentagne adfærd i ASD dyremodeller og forskellige arter af gnavere 3,5-7. Grave adfærd er defineret som indlysende rettet handlinger snuden eller ben til at fortrænge strøelse og har været en hypotese at være en følsom parameter for gentagne motorisk adfærd 4.
Her rapporterer vi en ny type grave, som vi har kaldt "inchworming" i BTBR stamme af mus. Karakteriseringen af denne hidtil ukendte opførsel kan give en robust mål for en gentagen motorisk adfærd, der kan anvendes til yderligere validation af gnaver modeller såsom ASD, Huntingtons sygdom eller obsessiv-kompulsiv adfærd 8,9. Vi definerer "inchworming" mindst en synkron bevægelse af for-og bagben-lemmer indad efterfulgt af en synkron bevægelse udad, som fører til fortrængning af strøelse. Dette adskiller sig fra typiske grave adfærd på mange måder. For det første er inchworming adfærd observeres sædvanligvis som en kombination af episoder snarere end en enkelt isoleret begivenhed. I modsætning hertil kan grave forekomme som en enkelt koordineret bevægelse af enten hind eller forgrunden poter 3. Desuden inchworming bevægelser tendens til at forekomme vandret på tværs af anlæggets gulv i modsætning til de stationære positioner, der er karakteristisk for grave adfærd. Endelig inchworming adfærd beskrevet nedenfor optræder hyppigt i BTBR indavlede stamme af mus, men er sjældent identificeret i B6 kontrol stamme, mens typiske grave adfærd er almindelige i B6 og BTBR stammer af mus
Da marmor nedgravning, grave, og juvenile play har etableret værdi til måling af unormal adfærd i musemodeller af ASD, den inchworming adfærd supplerer disse tidligere definerede målinger af stereotype adfærd. Især inchworming adfærd giver et brugbart mål for lavere ordens motoriske stereotypier, der er almindeligt identificeret i ASD 8,11. Desuden kan denne nye inchworming procedure give forskerne et værdifuldt redskab til analyse af gentagne motoriske adfærd er relevante for udviklingsforstyrrelser såsom ASF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med den canadiske Animal Care Udvalg og godkendt af University of Calgary Animal Care udvalget.
1.. Animal Forberedelse
- Isoler mus natten over (12 timer) før testning. For at gøre dette, skal du placere alle de BTBR og B6 mus (P35-P40) er nødvendig for eksperimentel analyse i bure af sig selv, dagen før testning.
- Placer den isolerede mus i adfærdsanalyse værelse 30 min inden testning, så dyrene vil vænne til nye omgivelser.
2.. Klargøring af udstyr
- Placer 30 x 30 cm plexiglas kasse med et aftageligt låg i test værelse. Placer kassen på et bord og placere videokamera til en 45 ° vinkel fra bunden; denne placering af kameraet vil tillade visualisering af hele gulvet i kabinettet og musen. Brug en infrarød baggrundsbelysningen for at hjælpe med at minimere blænding fra vægfeltet.
- Brug et videokamera, der besidder en høj zoom-funktion med infrarød kapaciteter til at optimere filme i en lav lux miljø. Fokuser kameraet på kabinettet udvide billedet, så musene visualiseres hele kassen.
- Dæk hele gulvet i kassen med savsmuld strøelse (bør være ca 1 cm dyb).
3 Test Procedure
- Placer en intra-stamme par mus (BTBR - BTBR eller B6-B6) i skabet test.
- Slukke lyset i test værelse.
- Start video kamera til at optage og forlade rummet. Dette vil forhindre eksperimentator indflydelse på musenes adfærd. Optag aktivitet for 11 min.
- Når optagelsen er færdig, skal du indtaste test værelse og returnere mus til deres oprindelige hjem bure.
- Bortskaf savsmuld sengetøj, vaske hele test boks med 70% ethanol, og placere nye savsmuld strøelse i bunden af testkabinet.
- Gentag hele proceduren for resten af intra-pletten par og returnere musene til deres oprindelige hjem bure.
Bemærk: For at kontrollere pålideligheden af de inchworming data, kan proceduren gentages på efterfølgende dage med forskellige BTBR-BTBR og B6-B6 par kombinationer. Dette vil sikre, at den observerede opførsel er ikke afhængig af den specifikke partner i kabinettet, men det inchworming enkelte.
4.. Dataanalyse
- Inchworming er defineret som den synkrone indad og udadgående bevægelse af dyrets for-og bagben-fødder, med et minimum af en co-forekommende indad og derefter efterfølgende udadgående bevægelse, der effektivt fortrænger strøelse. Manuelt se og score hver video to gange (en gang for hver mus) for at fastslå den samlede varighed, frekvens og ventetid til Inchworm i 10 min video. Manuel scoring af inchworming varighed, hyppighed og ventetid bør være baseret på opfølgningning definitioner:
Inchworming Varighed: Er defineret som den totale tid hver mus tilbringer engageret i inchworming adfærd. At score dette aspekt af inchworming, bruge en timer, der kan startes og stoppes. Start timing når musen begynder at Inchworm og stoppe timeren når musen stopper inchworming. Når og hvis musen begynder at Inchworm igen, genstart og re-stoppe timeren. Gentag start og stop af timeren for varigheden af den 10 min observationsperiode hver gang musen inchworms. Dette vil generere en inchworming varighed score, der er fra 0:00 til 10:00 min.
Inchworming frekvens defineres som det antal gange musen går i indgreb inchworming adfærd i 10 min observationsperioden. En enkelt tæller tildeles hver gang musen starter og stopper inchworming. Den inchworming frekvens score vil være et tal mellem 0 og ∞.
Ventetid til Inchworm: Er defineret som den tid thved passerer før den første udbrud af inchworming. Start timeren når videoen starter, vil det være tid 00:00, og stoppe timeren når musen inchworms for første gang. Hvis musen ikke viser inchworming adfærd latency at Inchworm vil være 10.00. Når man analyserer ventetid til Inchworm, vil en score fra 0:01 til 10:00 min opnås. Mus, der ikke Inchworm for varigheden af testperioden skal fjernes fra prøven befolkning for at sikre, at resultaterne er relevante for en population af mus, der viser inchworming adfærd. - Beregn den samlede hyppighed og varighed af inchworming for hver mus i videoen. Beregn den nødvendige tid til den første mus i par til Inchworm for latenstiden til Inchworm til dette specifikke par mus. Disse parametre er baseret på forudgående metodologisk arbejde relateret til gentagne grave adfærd i mus 6.
- Beregn den gennemsnitlige varighed, hyppighed,og ventetid til at grave for hver forsøgsgruppe i analysen (dvs. BTBR vs B6). Brug en ANOVA eller en t-test til at sammenligne data mellem stammer / eksperimentelle grupper.
Bemærk: Når proceduren er afsluttet på en anden dag, skal du bruge en gentagen foranstaltninger ANOVA til at sikre, at der ikke var nogen efterfølgende virkninger rettergang eller parring effekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den ændrede version af den unge play test beskrevet her kan bruges til at observere og analysere romanen gentagne grave adfærd betegnes inchworming. Inchworming er udstillet i langt højere grad af BTBR mus end B6 kontrol. I en typisk 10 min session, vil BTBR mus vise tydelig inchworming adfærd (synkron indad og udadgående bevægelse af poter i et forsøg på at fortrænge savsmuld strøelse) i ca 5 min, eller halvdelen af observationsperioden. Endvidere latenstiden til Inchworm er betydeligt kortere for BTBR mus - de begynder typisk inchworming inden for de første 10 sekunder af starten af den optagede session. I modsætning hertil kontrol mus (B6) har en gennemsnitlig ventetid på inchworm af 4 min og tilbringe meget små portioner af deres tid faktisk viser adfærd. Disse resultater svarer til data fra tidligere undersøgelser om gentagne grave adfærd i gnavere 3,6.
Figure 1 afbilder korrekt eksperimentelle oprettet for testprocedurer. Figur 2 viser den gennemsnitlige inchworming varighed (A), frekvens (B) og latenstid (C) Inchworm for BTBR mus og kontrol B6 stamme. Alle parametre var signifikant forskellig mellem stammerne. I eksperimentet rapporteret her blev inchworming test administreret over en 2 dages prøveperiode, med alternative bindinger i den anden dag, og resultaterne af hver dag blev sammenlignet. Blev ikke fundet signifikante forskelle, og dermed sikre, at virkningerne ikke var afhængige af enten specifikke mus bindinger eller gentagelse af prøven. Endelig Figur 3 indeholder stillbilleder af forskellige mus involveret i de to primære dele af inchworming adfærd.
Figur 1.. Udstyr oprettet for inchworming eksperiment. Udstyr oprettet for inchworming eksperiment. En kasse 30 cm terning plexiglas er sat på et bord foran et infrarødt zoom kamera placeret i en vinkel på 45 °. Bunden af kabinettet er dækket fuldt ud med et jævnt lag på mindst 1 cm af savsmuld.
Figur 2. Gennemsnitlig inchworming varighed, hyppighed og latenstid vises af par af BTBR og B6 mus. Den BTBR (n = 8) og B6 (n = 8)-mus blev testet ved P35-P40 over en to dages testperiode og scoret for inchworming adfærd. A) BTBR stammen viste en signifikant længere gennemsnitlig varighed af inchworming end B6 kontrol stamme (p <0,001). B) BTBR mus viste en væsentligtantly højere frekvens af inchworming sammenlignet med B6 kontroller (p <0,001). C) Der var en signifikant forskel i BTBR (n = 8) og B6 (n = 7) latenstid til at grave med BTBR viser et markant fald i den tid, det tog at vise adfærd i forhold til B6 kontroller (p = 0,001).
Figur 3.. Illustrative repræsentation af forskellige mus i begge aspekter af inchworming adfærd. Den øverste panel er et eksempel på mus i forlængelse fase af inchworming adfærd, mens den nederste panel er et eksempel på mus i sammentrækning fase af inchworming adfærd . Inchworming er defineret som den synkrone indad og synkron udadgående bevægelse af for-og bagben med musen til at fortrænge sengetøj.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inchworming er en ny måling af gentagen adfærd, der kan anvendes til at undersøge mange lidelser, der udviser stereotypier såsom ASF. Der er 4 trin, som er af afgørende betydning for at skabe pålidelige inchworming data fra den modificerede juvenil social interaktion protokol: 1) den udvidede isolation periode er afgørende for inchworming testen og bør ikke fjernes fra protokollen eller forkortes. Dette krav er specifikke for afprøvning af inchworming parvis beskrevet her. 2) videokamera skal passende anbragt og fokuseret, således at mus kan fuldt visualiseres hele plexiglas inddækning. 3) Skabet skal rengøres grundigt mellem test-par for at sikre, at de nuværende adfærd ikke er påvirket af dufte fra forudgående par mus. 4) strøelse til kabinettet skal være tilstrækkelig (~ 1 cm dyb) og skal være savsmuld; mus viser ikke inchworming adfærd med lidt / ingen strøelse eller nårplaceret på andre strøelse.
Selvom det ikke er beskrevet her, har vi observeret inchworming adfærd i ikke-isolerede, huses socialt BTBR mus placeret alene (snarere end i par) i en lignende sengs kabinet. Under disse betingelser, de BTBR musene stadig inchworm, men på en lavere frekvens og varighed, hvilket indikerer, at inchworming adfærd er en stereotyp adfærd muligvis fremkaldt af social angst (data ikke vist). Da undersøgelser har undladt at pålideligt demonstrere forskelle i angst mellem BTBR og B6 kontrol mus, angst er dog sandsynligvis en interagere med andre faktorer til at fremkalde denne adfærd 12. Men fokus i denne metodiske artikel var den standardiserede ændring af den unge social interaktion protokol, fordi det fremkalder adfærd hurtigt og pålideligt med dramatiske forskelle mellem BTBR og B6 mus. Desuden indsamles data fra to dyr i en enkelt session, hvilket øger informeretion opnået fra hver testperiode. I vores laboratorium har inchworming adfærd kun blevet bekræftet i aldersgruppen P35-P55. Selv om det er muligt, at mus vil yngre og ældre vise denne gentagne adfærd, kan undladelse af at identificere inchworming på andre aldersgrupper viser, at adfærden er specifik for unge og unge voksne mus.
Dataene fra dette eksperiment viser klart, at BTBR musestammen engagerer sig i gentagne inchworming adfærd hurtigere, oftere og i længere varigheder end B6 kontrol. Den inchworming adfærd kan derfor give forskerne en ny foranstaltning af gentagne adfærd i andre ASD og sygdomsmodeller. Selvom det endnu ikke er klart, hvad der driver denne gentagne grave bevægelse, BTBR mus viser også højere niveauer af selv-grooming og social undgåelse 1, 9. Som grave er en medfødt genetisk reguleret træk i mus, kan test af inchworming adfærd be påføres nemt til andre stammer, og har potentiale til at være et værdifuldt redskab til at vurdere motoriske stereotypier og tvangshandlinger i andre sygdomsmodeller.
En af de kendetegnende adfærdsmæssige træk, der kendetegner ASD er gentagne adfærd med begrænsede interesser 9. Ud over at fremhæve en værdifuld motor stereotypi, har dette eksperiment øget gyldigheden af BTBR musemodel af ASD ved at demonstrere en ekstra gentagne adfærd ligner den kliniske præsentation af motoriske stereotypier i ASD patienter. Inchworming vises i både BTBR (ASD) mus og B6 kontrol mus, selvom adfærd er forholdsvis sjældne i B6 mus. Den adfærd, der mest ligner inchworming graver adfærd hos gnavere. Thomas et al. 4. foreslår, at gnavere, grave serverer et udvalg af funktioner, herunder opbevaring af fødevarer, rovdyr svig, og beskyttelse mod uvilje miljøer. Da disse funktioner er ikke nøddigt i indstillingen laboratorium, kan mus, der viser høje niveauer af grave adfærd skal opfylde en kompulsiv adfærdsmæssige behov 4. Silverman et al. 9. foreslår endvidere, at grave adfærd bør indarbejdes i analysen af den unge social interaktion test som et mål for manglende social aktivitet.
Sammenfattende inchworming er en meget gentagen adfærd markant mere udbredt i BTBR mus (en model af ASD) i forhold til B6 mus (kontrol-stamme). Selvom ætiologien af den adfærd, er i øjeblikket ukendt, kan det være en værdifuld ressource for forskere, der undersøger compulsivity og gentagelse i gnavermodeller for mange sygdomme. De proceduremæssige teknikker er enkel og kan være afsluttet med lethed i en 24 timers periode. Dataanalyse er mere kompliceret og tidskrævende, men videooptagelse testproceduren tillader forskeren at fuldføre analysen off-line og repetitivt at sikre inter-rater konsistens ogpålidelighed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne er taknemmelige for den tekniske og logistiske bistand og ekspertise, som Rose Tobias, Younghee Ahn, og David N. Ruskin. Den her beskrevne arbejde blev finansieret af Alberta Børnehospital Foundation og Alberta Børnehospital Research Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 cm X 30 cm Plexiglas box with lid | Can be constructed | ||
| IR Camera | Survshop (Calgary, Alberta) | Sony CCD Camera DP955V- 30’ Infrared Armor Dome | Find a camera with high-resolution and zoom capabilities |
| DVR | Supercircuits (Austin, Texas) | BLACK Enterprise-Class 4-Channel H.264 security DVR with DVD Burner | High data capacity |
| Sawdust | Same as bedding material |
References
- McFarlane, H. G., Kusek, G. K., Yan, M., Phoenix, J. L., Bolivar, V. J., Crawley, J. N. Autism-like behavioral phenotypes in BTBR T+tf/J mice. Genes, Brain, and Behavior. 7, 152-163 (2008).
- Crawley, J. N. Designing mouse behavioral tasks relevant to autistic-like behaviors. Mental Retardation and Developmental Disabilities Research Reviews. 10 (4), 248-258 (2004).
- Deacon, R. Digging and marble burying in mice: simple methods for in vivo identification of biological impacts. Nature Protocols. 1 (1), 122-124 (2006).
- Thomas, A., Burant, A., Bui, N., Graham, D., Yuva-Paylor, L. A., Paylor, R. Marble burying reflects a repetitive and perseverative behavior more than novelty-induced anxiety. Psychopharmacology. 204, 361-373 (2009).
- Dudek, B. C., Adams, N., Boice, R., Abbott, M. E. Genetic influences on digging behaviours in mice (Mus musculus) in laboratory and seminatural settings. Journal of Comparative Psychology. 97 (3), 249-259 (1983).
- Webster, D., Williams, M. H., Owens, R., Geiger, V., Dewsbury, D. A. Digging behavior in 12 taxa of muriod rodents. Animal Learning and Behavior. 9 (2), 173-177 (1981).
- Pobbe, R. H., Pearson, B. L., Defensor, E., Bolivar, V. J., Blanchard, D. C., Blanchard, R. J. Expression of social behaviours of C57BL/6J versus BTBR inbred mouse strains in the visible burrow system. Behavioural Brain Research. 214, 443-449 (2010).
- Lewis, M. H., Tanimura, Y., Lee, L., Bodfish, J. Animal models of restricted repetitive behavior in autism. Behavioural Brain Research. 176, 66-74 (2007).
- Silverman, J. L., Yang, M., Lord, C., Crawley, J. N. Behavioural phenotyping assays for mouse models of autism. Nature Reviews. 11, 490-502 (2010).
- Deacon, R., Rawlins, J. Hippocampal lesions, species-typical behaviours and anxiety in mice. Behavioural Brain Research. 156, 241-249 (2005).
- Pearson, B. L., et al. Motor and cognitive sterotypies in the BTBR T+tf/J mouse model of autism. Genes, Brain, and Behavior. 10, 228-235 (2011).
- Pobbe, R. H., Defensor, E., Pearson, B. L., Bolivar, V. J., Blanchard, D. C., Blanchard, R. J. General and social anxiety in the BTBR T+ tf/J mouse strain. Behavioural Brain Research. 216 (1), 446-451 (2011).
