Summary
Inchworming er en svært repeterende synkron graving bevegelse vises av BTBR T + Itpr 3TF / J (BTBR) mus når den plasseres i en testing bur med tilstrekkelig sagflis sengetøy. Fremgangsmåten er en modifikasjon av juvenile sosial interaksjon protokoll og brukes her for å vurdere repeterende motor stereotypier relevante for autisme spektrum Disorder.
Abstract
Autism Spectrum Disorder (ASD) er en atferdsmessig definert nevrologisk lidelse preget av redusert gjensidig sosial interaksjon, unormal kommunikasjon, og repeterende atferd med begrenset interesse. Som diagnose er basert på kliniske kriterier, bør noen potensielt relevante gnager modeller av denne heterogen lidelse ideelt rekapitulere disse ulike atferdsmessige trekk. Den BTBR T + Itpr3 tf / J (BTBR) mus er en etablert dyremodell av ASD, viser repeterende handlinger, for eksempel økt stell, samt kognitiv fleksibilitet. Med hensyn til sosial interaksjon og interesse, har den juvenile play test vært ansatt i flere gnager modeller av ASD. Her viser vi at når BTBR mus er testet i en juvenile sosial interaksjon kabinett som inneholder sagflis sengetøy, viser de en repeterende synkron graving bevegelse. Denne repeterende motor oppførsel, referert til som "inchworming," hetpå grunn av den stereotype arten av de bevegelser som frembringes av musene mens det beveger seg horisontalt på tvers av gulvet. Inchworming mus må bruke sine for-og hind-lemmer synkront å fortrenge sengetøy, utføre et minimum av én innover og en ytre bevegelse. Selv om både BTBR og C56BL/6J (B6) mus viser denne atferden, BTBR mus viser en betydelig høyere varighet og hyppighet av inchworming og en redusert ventetid for å initiere inchworming når den plasseres i en sengs kabinett. Vi konkluderer med at dette nylig beskrevet oppførsel gir et mål på et repeterende motor stereotypi som enkelt kan måles i dyremodeller av ASD.
Introduction
Selv om patofysiologien av autismespekterforstyrrelser (ASD) er fortsatt uklart, diagnose avhenger av at det finnes tre hovedsymptomkategorier: unormal sosial gjensidighet, svekkelser i kommunikasjon, og repeterende / stereotype atferd en. De fleste gnagermodeller er i stand til samtidig å reprodusere alle de tre symptomer i ett enkelt dyr. Dermed modeller som pålitelig kan simulere noen eller alle aspekter av lidelsen holder stor verdi for utvikling av effektive forebyggende og terapeutiske strategier. En modell som gjør vise alle tre aspekter av ASD er BTBR muse 1,2.
I kombinasjon med ultralyd vokaliseringer og sosial tilnærming analyser, er den juvenile sosial interaksjon test brukte for å karakterisere musemodeller av pediatrisk ASD; Disse testene måler redusert og unormal sosial atferd som representerer kjernefunksjonene for ASD. I tillegg til de juvenile sosial interaksjon test, mange andretester har blitt brukt til å måle stereotype atferd i dyremodeller av ASD. For eksempel, marmor nedgraving test, som undersøker tendensen av et dyr for å fortrenge strø ved hjelp av snute og forpotene på forsøk på å dekke en gjenstand, er antatt å måle tvangsmessig stereotype oppførsel som forekommer som respons på ubehagelig stimuli 3,4. Følgelig har grave tester er gjennomført for å kvantifisere dette repeterende atferd i ASD dyremodeller og ulike arter av gnagere 3,5-7. Digging atferd er definert som åpen rettet handlinger av snute eller poter å fortrenge sengetøy materialer og har vært hypotese å være en følsom parameter for repeterende motor atferd fire.
Her rapporterer vi en ny type graving, som vi har kalt "inchworming," i BTBR stamme av mus. Karakteriseringen av denne nye virkemåten kan tilveiebringe en robust mål på en repeterende motor virkemåte som kan anvendes for ytterligere validation av gnager modeller som ASD, Huntingtons sykdom eller obsessive compulsive atferd 8,9. Vi definerer "inchworming", som i det minste en synkron bevegelse av de for-og bakben-lemmer innover etterfulgt av en synkron bevegelse utover, noe som fører til forskyvning av strømateriale. Dette skiller seg fra typiske graving atferd på mange måter. Først blir inchworming oppførsel observeres som en kombinasjon av episoder i stedet for en enkelt isolert hendelse. I motsetning til dette kan grave oppstå som enkelt samordnet bevegelse av enten den hind-eller forgrunnen labber 3. I tillegg inchworming bevegelser har en tendens til å oppstå horisontalt over kapslingen gulvet i motsetning til den stasjonære posisjoner som er karakteristiske for graving atferd. Til slutt, den inchworming atferd beskrevet nedenfor oppstår ofte i BTBR innavlet stamme av mus, men er sjelden identifisert i B6 kontroll belastning, mens typiske grave atferd er vanlig i B6 og BTBR stammer av mus
Gitt at marmor nedgraving, graving, og juvenile spill har etablert verdi for å måle unormal atferd i musemodeller av ASD, utfyller inchworming atferd disse tidligere definerte målinger av stereotype atferd. Spesielt gir den inchworming opptreden nyttig mål av lavere ordre motoriske stereotypier som ofte identifisert i ASD 8,11. I tillegg kan denne nye inchworming prosedyre gi forskere med en ytterligere verdifullt verktøy for analyse av repeterende motorisk adferd som er relevante for utviklingsforstyrrelser som ASD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble utført i samsvar med den kanadiske Animal Care komité og godkjent av Universitetet i Calgary Animal Care Committee.
En. Animal Forberedelse
- Isoler mus over natten (12 t) før testing. For å gjøre dette, plasserer alt av BTBR og B6 mus (P35-P40) som trengs for eksperimentell analyse i bur av seg selv, dagen før testing.
- Plasser den isolerte mus i atferdsanalyserommet 30 min før testing, slik at dyrene skal venne seg til det nye miljø.
2. Utstyr Forberedelse
- Plasser de 30 x 30 cm plexiglass boks med et avtagbart lokk i testrommet. Plasser esken på et bord og plassere videokameraet til en 45 ° vinkel fra bunnen; denne plassering av kameraet vil tillate visualisering av hele gulvet i skapet og musen. Bruk en infrarød bakgrunnsbelysning for å minimere gjenskinn fra veggen avboksen.
- Bruk et videokamera som besitter en høy zoom-funksjon med infrarød evner å optimalisere filming i en lav lux miljø. Fokuser kameraet på kabinettet forstørre bildet slik at musene er visualisert gjennom hele boksen.
- Dekk hele gulvet av esken med sagflis sengetøy (bør være ca 1 cm dyp).
3 Testing Prosedyre
- Plasser en intra-belastning par mus (BTBR - BTBR eller B6-B6) innen testing kabinett.
- Slå av lyset i testrommet.
- Start videokameraet til å ta opp og gå ut av rommet. Dette vil hindre eksperimentator innflytelse på atferden til musene. Registrere aktiviteten for 11 min.
- Når opptaket er ferdig, re-gå inn i testrommet og returnere musene til sine opprinnelige hjem bur.
- Kast den sagflis sengetøy, vaske hele testboks med 70% etanol, og plassere ny sagflis sengetøy i bunnen av testingkabinett.
- Gjenta hele fremgangsmåten for resten av de intra-flekk parvis og returnere musene til sine opprinnelige oppholdskasser.
Merk: Hvis du vil kontrollere påliteligheten av inchworming data, kan prosedyren gjentas på påfølgende dager med forskjellig BTBR-BTBR og B6-B6 par kombinasjoner. Dette vil sikre at den observerte oppførsel er ikke avhengig av den spesifikke partner i kabinettet, men inchworming individ.
4. Data Analysis
- Inchworming er definert som den synkrone inn-og utadbevegelse av dyrets for-og bakben-meter, med et minimum av en co-fore innover og deretter etterfølgende utadbevegelse som effektivt fortrenger senger. Manuelt se og score hver video to ganger (en gang for hver mus) for å fastslå den totale varigheten, frekvensen, og latens for å inchworm i 10 min video. Manuell scoring av inchworming varighet, frekvens og ventetid skal være basert på den følgendeing definisjoner:
Inchworming Varighet: Er definert som den totale tiden hver mus tilbringer engasjert i inchworming atferd. Å score dette aspektet av inchworming, bruke tidsur som kan startes og stoppes. Begynn timing når musen begynner å Inchworm og stoppe tidtakeren når musen stopper inchworming. Når og hvis musen begynner å Inchworm igjen, re-start og re-stoppe tidtakeren. Gjenta start og stopp av timeren for varigheten av den 10 min observasjonsperioden hver gang musen inchworms. Dette vil generere en inchworming varighet poengsum som er 00:00-10:00 min.
Inchworming Frekvens: er definert som det antall ganger musen griper inn i inchworming adferd i 10 min observasjonsperioden. En enkelt teller er tildelt hver gang muse starter og stopper inchworming. Den inchworming frekvens score vil være et tall mellom 0 og ∞.
Ventetid til Inchworm: Er definert som tiden thpå passerer før første utbruddet av inchworming. Starter tidtakeren når videoen starter, vil dette være tiden 00:00, og stoppe tidtakeren når musen inchworms for første gang. Hvis musen ikke vise inchworming atferd ventetid til Inchworm vil være 10:00. Ved å analysere ventetid til Inchworm, vil en poengsum 00:01-10:00 min oppnås. Mus som ikke inchworm under hele testperioden bør fjernes fra prøven populasjon for å sikre at resultatene er relevant for en populasjon av mus som viser inchworming oppførsel. - Beregn det totale frekvens og varighet av inchworming for hver mus i videoen. Beregn den tid som kreves for den første mus i det paret for å inchworm for latenstiden til inchworm for den spesifikke par av mus. Disse parametrene er basert på forutgående metodisk arbeid knyttet til repeterende grave atferd hos mus seks.
- Beregne gjennomsnittlig varighet, hyppighet,og ventetid for å grave for hver forsøksgruppe i analysen (dvs. BTBR vs B6). Bruk en ANOVA eller en t-test for å sammenligne data mellom stammer / eksperimentelle grupper.
Merk: Når prosedyren er fullført på en annen dag, kan du bruke en gjentatt tiltak ANOVA for å sikre at det var ingen påfølgende rettssaken virkninger eller sammenkobling effekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den modifiserte versjon av juvenile stykket test som er beskrevet her kan brukes til å observere og analysere ny repeterende grave oppførsel betegnet inchworming. Inchworming er utstilt i langt større grad av BTBR mus enn B6 kontroller. I en typisk 10 min økt, vil BTBR mus viser tydelig inchworming atferd (synkront inn-og utadbevegelse av potene i et forsøk på å forskyve sagflis bedding) i omtrent 5 min, eller halvparten av en observasjons-perioden. Videre er det ventetid for å Inchworm betydelig kortere for BTBR mus - de vanligvis begynne inchworming innen de første 10 sek av starten på den innspilte session. I kontrast, kontroll mus (B6) har en gjennomsnittlig ventetid til inchworm av 4 min og tilbringer svært små deler av sin tid faktisk viser atferden. Disse funnene er lik data fra tidligere studier på repeterende grave atferd hos gnagere 3,6.
Figure 1 viser den riktige eksperimentelle oppstilling for testprosedyrer. Figur 2 viser den gjennomsnittlige inchworming varighet (A) frekvens (B), og latens (C) for å inchworm for BTBR mus og kontroll B6 belastning. Alle parametrene var signifikant forskjellig mellom stammer. I eksperimentet rapportert her ble inchworming test administreres i løpet av en 2 dagers prøveperiode, og alternative sammenkoblinger i den andre dagen, og resultatet av hver dag ble sammenlignet. Ingen signifikante forskjeller ble funnet, og dermed sikre at effekten ikke var avhengig av enten spesifikke mus sammenkoblinger eller gjentakelse av testen. Til slutt, Figur 3 inneholder stillbilder av forskjellige mus som driver de to primære komponenter i inchworming oppførsel.
Figur 1. Utstyr satt opp for inchworming eksperiment. Utstyr satt opp for inchworming eksperiment. En 30 cm kube Pleksiglass boksen er satt på et bord foran en infrarød zoom-kamera plassert i en 45 ° vinkel. Bunnen av kabinettet er dekket fullt ut med et jevnt lag på minst en tomme av sagflis.
Figur 2. Gjennomsnittlig inchworming varighet, frekvens og ventetid vises av parvise BTBR og B6 mus. Den BTBR (n = 8) og B6 (n = 8) mus ble testet på P35-P40 over en to-dagers testperiode og scoret for inchworming virkemåte. A) BTBR belastning viste en signifikant lengre gjennomsnittlig varighet av inchworming enn B6 kontrollstamme (p <0,001). B) De BTBR mus viste en significantly høyere frekvens av inchworming i forhold til B6 kontrollene (p <0,001). C) Det var en signifikant forskjell i BTBR (n = 8) og B6 (n = 7) latency å grave med BTBR viser en markert nedgang i den tiden det tok for å vise virkemåten i forhold til B6 kontroller (p = 0.001).
Fig. 3. Illustrasjons representasjon av forskjellige mus på begge sider av inchworming oppførsel. Øvre panel er et eksempel på mus i forlengelsesfasen av inchworming oppførsel, mens den nedre platen er et eksempel på mus i sammentrekning fase av inchworming oppførsel . Inchworming er definert som den synkrone innover og utover for synkron bevegelse av de frem-og baklemmene av musen for å fortrenge senger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inchworming er et nytt mål på repeterende virkemåte som kan brukes til å studere mange lidelser som utviser stereotypier som ASD. Det er fire trinn som er av avgjørende betydning for å generere pålitelige inchworming data fra den modifiserte juvenile sosial interaksjon protokoll: 1) den forlengede isolasjon periode er vesentlig for inchworming test, og skal ikke tas ut av protokollen eller forkortes. Dette kravet er spesifikk for testing av inchworming i par som er beskrevet her. 2) Et videokamera må være hensiktsmessig plassert og rettet slik at musene fullt ut kan visualiseres gjennom hele Plexiglas kapslingen. 3) Kabinettet skal være grundig rengjort mellom testing par for å sikre at dagens atferd ikke påvirkes av dufter fra før par mus. 4) Den strø for kabinettet må være tilstrekkelig (~ 1 cm dyp) og må være sagflis; mus viser ikke inchworming atferd med lite / ingen sengetøy eller nårplassert på andre strømaterialer.
Selv om det ikke er beskrevet her, har vi observert inchworming atferd i ikke-isolerte, sosialt plassert BTBR mus plassert alene (snarere enn i par) i en lignende sengs kabinett. Under disse forholdene, BTBR mus fortsatt inchworm, men på en lavere frekvens og varighet, noe som indikerer at inchworming oppførsel er en stereotyp atferd muligens indusert av sosial angst (data ikke vist). Men gitt at studier har ikke klart å pålitelig demonstrere forskjeller i angst mellom BTBR og B6 kontroll mus, er angst trolig et samspill med andre faktorer å indusere denne oppførselen 12. Men fokuset i denne metodiske artikkelen var standardisert modifisering av juvenile sosial interaksjon protokoll fordi det utløser atferden raskt og pålitelig, med dramatiske forskjeller mellom BTBR og B6 mus. I tillegg blir data samlet fra to dyr i en enkelt sesjon, og dermed øke retteasjon fått fra hver testperioden. I vårt laboratorium har inchworming atferden bare blitt bekreftet i aldersspennet P35-P55. Selv om det er mulig at mus vil yngre og eldre vise denne repeterende atferd, kan unnlatelse av å identifisere inchworming på andre aldre indikerer at atferden er spesifikke for ungdom og unge voksne mus.
Dataene fra dette forsøket viser tydelig at den BTBR mus belastning engasjerer seg i den repeterende inchworming atferd raskere, oftere og for lengre varigheter enn B6 kontrollene. Den inchworming atferd kan derfor gi forskere med et nytt tiltak av repeterende atferd i andre ASD og sykdom modeller. Selv om det er ennå ikke klart hva som driver denne repeterende graving bevegelse, BTBR mus også vise høyere nivåer av selv stell og sosial unngåelse 1, 9. Som graving er en medfødt genetisk-regulert egenskap hos mus, kan testing av inchworming oppførsel be påføres lett til andre stammer, og har potensial til å være et verdifullt verktøy for å vurdere motoriske stereotypier og tvangsmessig atferd i andre sykdomsmodeller.
En av de kjennetegn atferdstrekk som kjennetegner ASD er repeterende atferd med begrensede interesser ni. I tillegg til å fremheve en verdifull motor stereotypi, har dette eksperimentet økte gyldigheten av BTBR mus modell av ASD ved å demonstrere en ekstra repeterende atferd som ligner på den kliniske presentasjonen av motoriske stereotypier i ASD pasienter. Inchworming vises i både BTBR (ASD) mus og B6 kontroll mus, selv om atferden er relativt sjelden i B6 mus. Den atferd som ligner mest inchworming graver atferd hos gnagere. Thomas et al. 4 antyder at for gnagere, serverer grave en rekke funksjoner, inkludert oppbevaring av mat, predator unndragelser, og beskyttelse mot aversjons miljøer. Ettersom disse funksjonene er ikke nevnt ellersvendig i laboratoriet innstillingen, kan mus som viser høye nivåer av graving atferd være å oppfylle en tvangsmessig atferds behov fire. Videre, Silverman et al. 9. antyder at gravevirkemåten skal bli tatt med i analysen av juvenile sosial interaksjon test som et mål på ikke-sosiale aktiviteter.
Oppsummert er inchworming en svært gjentatt atferd betydelig mer utbredt i BTBR mus (en modell av ASD) sammenlignet med B6 mus (kontroll belastning). Selv om etiologi av atferden er foreløpig ukjent, kan det være en verdifull ressurs for forskere som undersøkte compulsivity og repetisjon i gnagermodeller av mange sykdommer. De prosessuelle teknikker er enkle og kan gjennomføres med letthet i en 24 timers periode. Dataanalyse er mer kompleks og tidkrevende, men å ta opp testprosedyren video tillater forskeren til å fullføre analysen off-line og gjentagelser for å sikre inter-rater konsistens ogpålitelighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne er takknemlige for den tekniske og logistisk bistand og kompetanse levert av Rose Tobias, Younghee Ahn, og David N. Ruskin. Arbeidet som beskrives her ble finansiert av Alberta Children Hospital Foundation og Alberta Children Hospital Research Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 cm X 30 cm Plexiglas box with lid | Can be constructed | ||
| IR Camera | Survshop (Calgary, Alberta) | Sony CCD Camera DP955V- 30’ Infrared Armor Dome | Find a camera with high-resolution and zoom capabilities |
| DVR | Supercircuits (Austin, Texas) | BLACK Enterprise-Class 4-Channel H.264 security DVR with DVD Burner | High data capacity |
| Sawdust | Same as bedding material |
References
- McFarlane, H. G., Kusek, G. K., Yan, M., Phoenix, J. L., Bolivar, V. J., Crawley, J. N. Autism-like behavioral phenotypes in BTBR T+tf/J mice. Genes, Brain, and Behavior. 7, 152-163 (2008).
- Crawley, J. N. Designing mouse behavioral tasks relevant to autistic-like behaviors. Mental Retardation and Developmental Disabilities Research Reviews. 10 (4), 248-258 (2004).
- Deacon, R. Digging and marble burying in mice: simple methods for in vivo identification of biological impacts. Nature Protocols. 1 (1), 122-124 (2006).
- Thomas, A., Burant, A., Bui, N., Graham, D., Yuva-Paylor, L. A., Paylor, R. Marble burying reflects a repetitive and perseverative behavior more than novelty-induced anxiety. Psychopharmacology. 204, 361-373 (2009).
- Dudek, B. C., Adams, N., Boice, R., Abbott, M. E. Genetic influences on digging behaviours in mice (Mus musculus) in laboratory and seminatural settings. Journal of Comparative Psychology. 97 (3), 249-259 (1983).
- Webster, D., Williams, M. H., Owens, R., Geiger, V., Dewsbury, D. A. Digging behavior in 12 taxa of muriod rodents. Animal Learning and Behavior. 9 (2), 173-177 (1981).
- Pobbe, R. H., Pearson, B. L., Defensor, E., Bolivar, V. J., Blanchard, D. C., Blanchard, R. J. Expression of social behaviours of C57BL/6J versus BTBR inbred mouse strains in the visible burrow system. Behavioural Brain Research. 214, 443-449 (2010).
- Lewis, M. H., Tanimura, Y., Lee, L., Bodfish, J. Animal models of restricted repetitive behavior in autism. Behavioural Brain Research. 176, 66-74 (2007).
- Silverman, J. L., Yang, M., Lord, C., Crawley, J. N. Behavioural phenotyping assays for mouse models of autism. Nature Reviews. 11, 490-502 (2010).
- Deacon, R., Rawlins, J. Hippocampal lesions, species-typical behaviours and anxiety in mice. Behavioural Brain Research. 156, 241-249 (2005).
- Pearson, B. L., et al. Motor and cognitive sterotypies in the BTBR T+tf/J mouse model of autism. Genes, Brain, and Behavior. 10, 228-235 (2011).
- Pobbe, R. H., Defensor, E., Pearson, B. L., Bolivar, V. J., Blanchard, D. C., Blanchard, R. J. General and social anxiety in the BTBR T+ tf/J mouse strain. Behavioural Brain Research. 216 (1), 446-451 (2011).
