Summary
Inchworming é um movimento de escavação síncrona altamente repetitivo exibido pelo BTBR T + ITPR 3TF / J (BTBR) camundongos quando colocado em uma gaiola de testes com roupa de cama de serragem suficiente. O procedimento é uma modificação do protocolo de interacção social, juvenil e é utilizado aqui para avaliar estereotipias motoras repetitivas relevantes para Transtorno do espectro do autismo.
Abstract
Transtorno do Espectro do Autismo (ASD) é um distúrbio do desenvolvimento neurológico comportamentalmente definida, caracterizada pela diminuição da interação recíproca social, comunicação anormal, e comportamentos repetitivos com interesse restrito. Como o diagnóstico é baseado em critérios clínicos, os modelos de roedores potencialmente relevantes desta doença heterogênea idealmente deve recapitular esses traços comportamentais diversos. O tf BTBR T + Itpr3 / J (BTBR) do rato é um modelo animal estabelecido de ASD, exibindo comportamentos repetitivos, como o aumento da preparação, bem como a inflexibilidade cognitiva. Com relação à interação social e interesse, o teste de jogo juvenil tem sido utilizada em vários modelos de roedores da ASD. Aqui, mostramos que quando os ratos BTBR são testados em um gabinete juvenil interação social contendo cama de serragem, eles exibem um movimento de escavação síncrona repetitivo. Este comportamento motor repetitivo, referido como "inchworming", foi chamadopor causa da natureza dos movimentos estereotipados exibidos pelos ratinhos enquanto movendo-se horizontalmente ao longo do chão. Camundongos Inchworming devem usar seus frente-e membros pélvicos em sincronia para deslocar a roupa de cama, realizando um mínimo de um interior e um movimento para fora. Embora ambos BTBR e C56BL/6J (B6) camundongos apresentam esse comportamento, ratos BTBR demonstrar uma duração significativamente maior e frequência de inchworming e uma diminuição da latência para iniciar inchworming quando colocado em um gabinete de camas. Nós concluímos que este comportamento recentemente descrito fornece uma medida de um motor de estereotipia repetitivo que pode ser facilmente medido em modelos animais de ASD.
Introduction
Embora a fisiopatologia dos transtornos do espectro do autismo (ASD) ainda não está claro, o diagnóstico depende da presença de três grandes categorias de sintomas: reciprocidade social anormal, deficiência na comunicação e repetitivos / comportamentos estereotipados 1. A maioria dos modelos de roedores são incapazes de reproduzir simultaneamente todos os três sintomas em um único animal. Assim, modelos que podem simular de forma confiável alguns ou todos os aspectos da doença possuem um grande valor para o desenvolvimento de estratégias preventivas e terapêuticas eficazes. Um modelo que faz exibir todos os três aspectos da ASD é o mouse 1,2 BTBR.
Em combinação com vocalizações ultra-sônicas e ensaios abordagem sócio, o teste de interação social juvenil é comumente usado para caracterizar modelos do rato da ASD pediátrica; Estes testes medida diminuiu e comportamentos sociais anormais que representam os principais recursos do ASD. Além do teste de interacção social, juvenil, muitos outrostestes foram utilizados para medir os comportamentos estereotipados em modelos animais de ASD. Por exemplo, o teste de enterramento em mármore, que examina a tendência de um animal para deslocar o material da cama usando o focinho e as patas dianteiras no esforço para cobrir um objecto, é pensado para medir comportamentos estereotipados compulsivos que ocorrem em resposta a estímulos aversivo 3,4. Assim, os testes de escavação foram implementadas para quantificar esse comportamento repetitivo em modelos animais ASD e diferentes espécies de roedores 3,5-7. Comportamentos de escavação são definidas como ações voltadas óbvios do focinho ou patas para deslocar materiais de cama e ter a hipótese de ser um parâmetro sensível do comportamento motor repetitivo 4.
Aqui, apresentamos um novo tipo de escavação, o que nós chamamos de "inchworming", na linhagem BTBR de camundongos. A caracterização deste novo comportamento pode proporcionar uma medida robusta de um comportamento repetitivo do motor que pode ser usado para mais validation de modelos de roedores, como ASD, doença de Huntington ou comportamento obsessivo compulsivo 8,9. Definimos "inchworming" como, pelo menos, um movimento sincronizado das partes dianteiras e-membros pélvicos para dentro seguido por um movimento sincronizado para o exterior o que leva ao deslocamento do material do leito. Isso difere do comportamento típico de escavação de muitas maneiras. Em primeiro lugar, o comportamento inchworming é geralmente observado como uma combinação de episódios em vez de um único acontecimento isolado. Em contraste, a escavação pode ocorrer como movimento coordenado único, quer do traseiro ou patas dianteiras 3. Além disso, os movimentos inchworming tendem a ocorrer horizontalmente no pavimento do compartimento, ao contrário das posições estacionárias, que são característicos de escavação comportamentos. Finalmente, o comportamento inchworming descrito abaixo ocorre com freqüência na linhagem consanguínea BTBR de camundongos, mas raramente é identificado na estirpe de controlo B6, enquanto que os comportamentos típicos de escavação são comuns em cepas B6 e BTBR de ratos
Dado que a sepultura de mármore, cavando, eo jogo juvenil têm valor estabelecido para medir o comportamento anormal em modelos do rato da ASD, o comportamento inchworming complementa essas medidas previamente definidas de comportamentos estereotipados. Em particular, o comportamento inchworming fornece uma medida útil de menores estereotipias motoras ordem que são comumente identificados na ASD 8,11. Além disso, este novo procedimento inchworming pode proporcionar aos investigadores uma ferramenta adicional valioso para a análise do comportamento motor repetitivas relevantes para perturbações do desenvolvimento, tais como TEA.
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Protocol
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o Comité de Cuidados Animais do Canadá e aprovado pela Universidade do Animal Care Committee da Calgary.
1. Preparação Animais
- Isolar os ratos durante a noite (12 horas) antes do teste. Para fazer isso, coloque toda a BTBR e camundongos B6 (P35-P40) necessários para a análise experimental em gaiolas por si só, um dia antes do teste.
- Coloque a ratinhos isolado na análise comportamental ambiente 30 min antes do teste de modo a que os animais se habituar ao novo ambiente.
2. Equipamento Preparação
- Coloque as 30 x 30 cm de Plexiglas caixa com uma tampa removível na sala de teste. Coloque a caixa sobre a mesa e posicione a câmera de vídeo para um ângulo de 45 ° a partir do fundo; esta localização da câmara de permitir a visualização de todo o pavimento da câmara e do rato. Use uma luz de fundo infravermelho para ajudar a minimizar o brilho da parede docaixa.
- Use uma câmera de vídeo que possui uma função de zoom elevado com capacidade de infravermelhos para otimizar as filmagens em um ambiente de baixo lux. Foque a câmara no gabinete ampliando a imagem de modo a que os ratos são visualizadas em toda a caixa.
- Cubra todo o piso da caixa com cama de serragem (deve ser de aproximadamente 1 centímetro de profundidade).
3 Procedimento de Teste
- Coloque um par de intra-linhagem de camundongos (BTBR - BTBR ou B6-B6) dentro da caixa de teste.
- Desligue as luzes na sala de testes.
- Comece a câmera de vídeo para gravar e sair do quarto. Isto irá evitar a influência experimentador no comportamento dos ratinhos. Registre a atividade por 11 min.
- Uma vez que a gravação está completa, re-entrar na sala de testes e retornar os ratos para suas gaiolas originais.
- Descarte a roupa de cama de serragem, lave a caixa de teste inteira com 70% de etanol, e coloque novas camas serragem no fundo do testegabinete.
- Repetir todo o procedimento para o resto dos pares intra-mancha e devolver os ratos às suas gaiolas originais.
Nota: Para verificar a confiabilidade dos dados inchworming, o procedimento pode ser repetido nos dias seguintes com diferentes combinações de pares B6-B6 BTBR-BTBR e. Isto irá assegurar que o comportamento observado não é dependente do parceiro específico no recinto, mas o indivíduo inchworming.
4. Análise de Dados
- Inchworming é definido como o movimento sincronizado para dentro e para fora de frente-e Traseiro-pés do animal, com um mínimo de um co-ocorrência para dentro e, em seguida, movimento para fora posterior que efetivamente desloca a roupa de cama. Assistir manualmente e marcar cada vídeo duas vezes (uma vez para cada rato) para avaliar a duração total, frequência e latência para lagarta nos 10 min de vídeo. Scoring manual de inchworming duração, frequência e latência deve basear-se no seguimentoing definições:
Inchworming Duração: É definido como o tempo total de cada rato gasta envolvida no comportamento inchworming. Para marcar este aspecto da inchworming, use um temporizador que pode ser iniciado e interrompido. Comece tempo quando o mouse começa a lagarta e parar o cronômetro quando o mouse pára inchworming. Quando e se o mouse começa a lagarta de novo, re-start e re-parar o cronómetro. Repetir o arranque e paragem do temporizador para o período de duração do período de observação de 10 min de cada vez os inchworms rato. Isso irá gerar uma pontuação duração inchworming que é 0:00-10:00 min.
Inchworming Freqüência: É definido como o número de vezes que o rato se envolve no comportamento inchworming no período de observação de 10 min. A única contagem é concedido a cada vez que o mouse arranques e paragens inchworming. A pontuação freqüência inchworming será um número entre 0 e ∞.
Latência para Inchworm: É definido como o tempo ªno passa anterior ao primeiro aparecimento de inchworming. Inicie o cronômetro quando o vídeo começa, este será o tempo de 00:00, e parar o cronômetro quando o inchworms rato pela primeira vez. Se o mouse não exibe o comportamento inchworming a latência para lagarta será às 10:00 h. Ao analisar a latência para lagarta, uma pontuação 0:01-10:00 min será obtida. Os ratinhos que não conseguem inchworm para a duração do período de teste deve ser removido a partir da população de amostra para assegurar que os resultados são pertinentes para uma população de ratinhos que exibem o comportamento inchworming. - Calcule a freqüência total e duração da inchworming para cada rato no vídeo. Calcular o tempo necessário para o primeiro ratinho em que o par inchworm para a latência para inchworm para esse par específico dos ratos. Estes parâmetros são com base no trabalho metodológico prévio relacionado a comportamentos repetitivos de escavação em camundongos 6.
- Calcule a duração média, freqüência,e latência para cavar para cada grupo experimental na análise (ie BTBR vs B6). Use uma ANOVA ou teste t para comparar os dados entre estirpes / grupos experimentais.
Nota: Quando o procedimento seja concluído no segundo dia, use uma série de medidas repetidas ANOVA para garantir que não houve efeitos posterior julgamento ou efeitos de emparelhamento.
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Representative Results
A versão modificada do teste de jogo juvenil descrito aqui pode ser usado para observar e analisar o comportamento de escavação repetitivo romance denominado inchworming. Inchworming está exposto a uma extensão muito maior por ratos BTBR que os controles B6. Num típico 10 min sessão, os ratinhos BTBR irá exibir o comportamento distinto inchworming (síncrono para dentro e para fora, o movimento das patas em um esforço para substituir o leito de serradura), por cerca de 5 minutos, ou de metade do período de observação. Além disso, a latência para inchworm é significativamente mais curto para os ratos BTBR - eles começam tipicamente inchworming dentro dos primeiros 10 segundos do inicio da sessão gravada. Em contraste, os ratinhos de controlo (B6) tem uma latência média para lagarta de 4 min e gastar muito pequenas porções do seu tempo na verdade mostrando o comportamento. Estes resultados são semelhantes aos dados de estudos anteriores sobre os comportamentos repetitivos de escavação em roedores 3,6.
Figure 1 representa o experimental adequado configurado para procedimentos de teste. figura 2 mostra a duração inchworming média (A), freqüência (B) e latência (C) a lagarta para os ratos BTBR e da cepa B6 controle. Todos os parâmetros foram significativamente diferentes entre as cepas. Na experiência aqui relatado, o teste inchworming foi administrada ao longo de um período de ensaio dois dias, com emparelhamentos alternativo no segundo dia, e os resultados de cada dia foram comparadas. Não foram encontradas diferenças significativas, garantindo assim que os efeitos não eram dependentes de ambos pares de rato específicos ou a repetição do teste. Finalmente, a Figura 3 contém ainda fotos de diferentes camundongos envolvidos nas duas principais componentes do comportamento inchworming.
Figura 1. Equipamento criado para o experimento inchworming. Equipamento configurado para o experimento inchworming. Uma caixa de acrílico 30 centímetros cubo é colocado em uma mesa na frente de uma câmera com zoom de infravermelhos posicionados em um ângulo de 45 °. A parte inferior do gabinete é coberto totalmente com uma camada uniforme de pelo menos 1 centímetro de serragem.
Figura 2. Duração média inchworming, frequência e latência exibida por pares de BTBR e ratinhos B6. BTBR A (n = 8) e B6 (n = 8) foram testados em ratinhos P35-P40 durante um período de teste de dois dias e teve de inchworming comportamento. A) A estirpe BTBR exibida uma duração significativamente mais longa média de inchworming que a estirpe de controlo B6 (p <0,001). B) Os ratinhos BTBR exibido um significantly maior freqüência de inchworming, em comparação com controles B6 (p <0,001). C) Houve uma diferença significativa na BTBR (n = 8) e B6 (n = 7) latência para cavar com BTBR exibindo uma diminuição acentuada no tempo que levou a exibir o comportamento comparado com os controlos B6 (p = 0,001).
Figura 3. Representação ilustrativa de ratos diferentes em ambos os aspectos do comportamento inchworming. O painel superior é um exemplo de murganhos em fase de extensão do comportamento inchworming, ao passo que o painel inferior é um exemplo de ratinhos na fase de contracção do comportamento inchworming . Inchworming é definido como o movimento para fora e para dentro síncrono síncrono da frente e membros posteriores do rato para deslocar cama.
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Discussion
Inchworming é uma nova medida de comportamento repetitivo, que pode ser usado para estudar muitas doenças que exibem estereotipias como CIA. Há 4 etapas que são de importância fundamental para a geração de dados confiáveis inchworming do protocolo de interação social, juvenil modificação: 1) o período de isolamento prolongado é essencial para o teste inchworming e não deve ser removido do protocolo ou encurtado. Este requisito é específico para o teste de inchworming em pares descritos aqui. 2) A câmara de vídeo tem de ser apropriadamente posicionada e centrada de modo a que os ratinhos podem ser totalmente visualizadas ao longo de todo o compartimento de Plexiglas. 3) O invólucro deve ser completamente limpo entre os pares de teste para assegurar que as condutas de corrente não é influenciada pelos aromas do par anterior de camundongos. 4) O material de cama para o gabinete deve ser suficiente (~ 1 cm de profundidade) e deve ser serragem; camundongos não apresentam o comportamento inchworming com pouca / nenhuma cama ou quandocolocado sobre outros materiais de cama.
Embora não seja descrito aqui, temos observado o comportamento inchworming em não-isolados, ratos BTBR socialmente alojados colocados sozinho (e não em pares) em um compartimento com camas similar. Sob estas condições, os murganhos BTBR ainda lagarta, mas com uma frequência e duração mais baixa, indicando, assim, que o comportamento inchworming é um comportamento estereotipado, possivelmente induzido por ansiedade social (dados não mostrados). No entanto, dado que os estudos não conseguiram demonstrar de forma confiável diferenças de ansiedade entre os BTBR e controle camundongos B6, a ansiedade é provavelmente uma interação com outros fatores para induzir este comportamento 12. No entanto, o foco deste artigo foi a modificação metodológica padronizada para o protocolo de interação social juvenil, pois provoca o comportamento de forma rápida e confiável, com diferenças dramáticas entre BTBR e camundongos B6. Além disso, os dados são coletados a partir de dois animais em uma única sessão, aumentando assim a informarção adquirida em cada período de testes. No nosso laboratório, o comportamento inchworming só foi confirmada na faixa etária de P35-P55. Embora seja possível que os ratos jovens e idosos irá exibir esse comportamento repetitivo, falta de identificação inchworming em outras idades podem indicar que o comportamento é específico para camundongos adolescentes e adultas jovens.
Os dados deste experimento indicam claramente que o mouse tensão BTBR engaja no comportamento repetitivo inchworming mais rapidamente, com mais frequência e por períodos mais longos do que os controles B6. O comportamento inchworming pode, portanto, fornecer aos pesquisadores uma nova medida de comportamentos repetitivos em outro ASD e modelos de doenças. Embora ainda não está claro o que impulsiona este movimento de escavação repetitivo, ratos BTBR também apresentam níveis mais elevados de auto-limpeza e evitação social 1, 9. Como escavação é um traço geneticamente regulado inata em ratos, os testes do comportamento inchworming pode be aplicado facilmente a outras cepas e tem o potencial de ser uma ferramenta valiosa para avaliar estereotipias motoras e comportamentos compulsivos em outros modelos de doenças.
Uma das características comportamentais marcantes que caracterizam ASD é um comportamento repetitivo com interesses restritos 9. Além de destacar a estereotipia motora valioso, esta experiência tem aumentado a validade do modelo do rato BTBR de ASD, demonstrando um comportamento repetitivo adicional semelhante ao quadro clínico de estereotipias motoras em pacientes com autismo. Inchworming é apresentada em ambos os ratinhos BTBR (ASD) e ratinhos de controlo B6, embora o comportamento é relativamente rara em ratinhos B6. O comportamento que mais se assemelha inchworming está cavando comportamentos em roedores. Thomas et al. 4 sugere que para os roedores, escavação serve uma variedade de funções, incluindo o armazenamento de alimentos, predador evasão e proteção de ambientes aversivos. Como estas funções não são necessário no ambiente de laboratório, camundongos que apresentam altos níveis de comportamento de escavação pode estar cumprindo uma necessidade comportamental compulsivo 4. Além disso, Silverman et al. 9 sugere que o comportamento de escavação deve ser incorporada na análise do teste de interacção social, juvenil como uma medida da actividade não-social.
Em resumo, inchworming é um comportamento altamente repetido significativamente mais prevalente em ratinhos BTBR (um modelo de CIA) em comparação com ratinhos B6 (da estirpe de controlo). Embora a etiologia do comportamento é actualmente desconhecida, pode ser um recurso valioso para pesquisadores que examinam compulsividade e repetição em modelos de roedores de muitas doenças. As técnicas processuais são simples e podem ser concluídas com facilidade em um período de 24 horas. A análise dos dados é mais complexa e demorada, mas a gravação de vídeo o procedimento de teste permite ao pesquisador para completar a análise off-line e repetidamente para garantir a consistência entre avaliadores econfiabilidade.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem o apoio e conhecimento técnico e logístico prestado por Rose Tobias, Younghee Ahn, e David N. Ruskin. O trabalho aqui descrito foi financiado pela Fundação Hospitalar do Alberta Children e Instituto de Pesquisa Hospital do Alberta Children.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 cm X 30 cm Plexiglas box with lid | Can be constructed | ||
| IR Camera | Survshop (Calgary, Alberta) | Sony CCD Camera DP955V- 30’ Infrared Armor Dome | Find a camera with high-resolution and zoom capabilities |
| DVR | Supercircuits (Austin, Texas) | BLACK Enterprise-Class 4-Channel H.264 security DVR with DVD Burner | High data capacity |
| Sawdust | Same as bedding material |
References
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