Summary
Inchworming是BTBR T + Itpr 3TF / J（BTBR）小鼠时，放置在一个测试笼有足够的锯末床上用品显示高度重复挖同步运动。该程序是青少年社会交互协议的修改，并在这里被用来评估有关自闭症重复刻板电机。
Abstract
自闭症谱系障碍（ASD）是一种行为上定义的神经发育疾病的特点是减少社会互动，通讯异常，并不断重复的行为与限制的兴趣。作为诊断依据临床标准，这异质性疾病的任何可能有关的啮齿动物模型应该理想地复述这些不同的行为特征。该BTBR T + Itpr3 TF / J（BTBR）鼠标是房间隔缺损的建立动物模型，显示重复的行为，如增加疏导，以及认知缺乏灵活性。关于社会交往和兴趣，少年播放测试已受聘于房间隔缺损的多个啮齿动物模型。在这里，我们表明，当BTBR小鼠在含有木屑床上用品青少年社会交往的外壳进行测试，它们显示重复挖同步运动。这种重复的运动行为，称作“inchworming”，被评为因为由小鼠同时水平移动在地板上展出了运动的刻板性质。 Inchworming鼠标必须使用他们的脱颖而出和后肢的同步置换的床上用品，向内，一个向外运动执行最低之一。虽然两者BTBR和C56BL/6J（B6）小鼠表现出这种行为，BTBR小鼠表现出显著更高的持续时间inchworming和频率以及减少延迟启动时，放置在一个层状外壳inchworming。我们得出结论，这种新近被描述的行为提供了一个重复的马达刻板，可以在ASD的动物模型中很容易地测量的度量。
Introduction
虽然自闭症谱系障碍（ASD）的病理生理机制仍不清楚，诊断依赖于三大类症状的存在：畸形的社会互惠，沟通障碍，以及重复/刻板行为1。大多数啮齿类动物模型不能同时重现这三个症状在一个单一的动物。因此，模型，可以可靠地模拟这种疾病的一些或所有方面的有效预防和治疗策略的发展具有很大的价值。一个模型，它确实显示ASD的所有三个方面是BTBR鼠标1,2。
在超声波发声和社会分析方法相结合，对青少年社会交往的测试通常用来表征小儿房间隔缺损的小鼠模型;这些测试测量下降，占ASD的核心功能不正常的社会行为。除了少年社会交往试验，许多其它试验已被用来测量在ASD动物模型刻板行为。例如，在大理石埋藏测试中，它检查动物的倾向用在努力鼻子和前爪覆盖的对象来取代寝具材料，被认为是衡量出现在响应厌恶刺激3,4强迫刻板行为。因此，挖掘试验已经实施量化ASD动物模型和不同的鼠类物种3,5-7这种重复行为。挖掘行为被定义为口鼻部或足掌来取代铺垫材料的明显指示行动，并已假设是重复的运动行为4个敏感参数。
在这里，我们报告了一种新类型的挖掘，这是我们在小鼠BTBR菌株称为“inchworming”。这种新颖的行为表征可提供稳健的计量重复性运动行为可用于进一步的缬氨酸idation啮齿类动物模型，如房间隔缺损，亨廷顿氏症或强迫行为8,9。我们定义“inchworming”作为前和后肢内侧后跟一个同步运动向外通入床上用品材料的位移中的至少一个同步运动。这不同于在许多方面典型的挖掘行为。首先，inchworming行为通常被观察到发作的组合，而不是一个孤立的事件。相比之下，挖掘可能会出现无论是作为后或前爪3单协调运动。此外，inchworming运动趋向水平地发生在整个外壳层，而不是在固定的位置是挖行为的特征。最后，下面描述的inchworming行为经常发生在小鼠的BTBR近交系，但在B6对照菌株中很少发现，而典型的挖掘行为是共同的小鼠B6和BTBR菌株
鉴于大理石掩埋，挖掘和发挥青少年建立价值用于测量ASD的小鼠模型异常行为时，inchworming行为补充了这些先前定义的刻板行为的测量。特别是，inchworming行为提供了在房间隔缺损8,11普遍认定低阶电机刻板行为的有用指标。此外，这种新的inchworming程序可能为研究人员提供的相关发育障碍，如房间隔缺损的重复运动行为的分析，一个额外的有价值的工具。
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Protocol
所有程序均在按照加拿大动物保护委员会，并经卡尔加里动物保健委员会的大学。
1，动物的制备
- 分离小鼠过夜（12小时）前测试。要做到这一点，本身，测试前一天将所有BTBR和B6小鼠（P35-P40）在笼子里所需要的实验分析。
- 将分离的小鼠中的行为分析室30分钟，在试验之前，使动物将习惯于以新颖的环境。
2，设备准备
- 将30×30厘米的有机玻璃，在考场可移动的盖盒。放置在桌子上的盒子和摄像机的位置，以45°的角度从底部;相机的当前位置将允许外壳和鼠标的整个地板的可视化。使用红外背光，以帮助从墙上最大限度地减少眩光盒子。
- 使用视频摄像头，具有高变焦功能带红外功能，在低照度环境优化拍摄。将相机对准机箱放大图像，使小鼠在整个框显示。
- 盖上锯末床上用品（应为约1英寸深）框的整个地板。
3测试程序
- 将一个内部应变对小鼠（BTBR - BTBR或B6-B6）的测试机箱内。
- 在测试室的灯打开了。
- 启动摄像机来记录和退出房间。这将防止对小鼠的行为实验者影响。记录活动11分钟。
- 一旦拍摄完毕后，再进入考场，并返回小鼠到原来的家笼。
- 处置锯末铺垫，用70％乙醇洗整个测试中，并把新的锯末床上用品在测试底部外壳。
- 重复整个过程的内部污渍对的休息和恢复小鼠自己原来的家笼。
注意：要验证inchworming数据的可靠性，该过程可能会重复在随后的日子里以不同BTBR-BTBR和B6-B6对组合。这将确保所观察到的行为是不依赖于机箱中的特定的合作伙伴，但inchworming个人。
4，数据分析
- Inchworming被定义为动物的脱颖而出和后肢英尺同步向内和向外移动，以最小的一种共发生向内再向外后续动作，有效地取代了铺垫。手动观看和得分每个视频两次（一次为每个鼠标），以确定总的持续时间，频率和延迟在10分钟的视频，以尺蠖。 inchworming持续时间，频率和延迟的人工评分，应根据后续ING的定义：
Inchworming时间 ：是指每只小鼠花费在从事inchworming行为的总时间。得分inchworming的这个方面，使用可以被启动和停止计时器。开始计时，当鼠标开始蠕动和停止计时器，当鼠标停止inchworming。当（如果）鼠标开始再次尺蠖，重新启动和重新停止计时器。重复该定时器的启动和停止，每次10分钟的观察期的小鼠inchworms的持续时间。这将产生一个inchworming时间分数，0:00至10:00分之间。
Inchworming频率 ：定义为鼠标接合在10分钟观察期间inchworming行为的次数。单计数每次鼠标的启动和停止inchworming奖励。该inchworming频度得分将是介于0和∞数。
潜伏期尺蠖 ：是指在一定时间日在之前的首次发病inchworming通行证。启动定时器的视频开始时，这将是0:00，和停止计时器，当鼠标inchworms首次。如果鼠标不显示inchworming行为的潜伏期尺蠖将是10:00。在分析延迟到尺蠖，将获得0点01分至10:00分之间的分数。该失败尺蠖在测试周期的持续时间的小鼠应从样品群体中移除，以确保结果是相近的，以所显示的inchworming行为小鼠的群体。 - 计算总次数在视频inchworming每只小鼠的持续时间。计算所需的对中的第一个鼠标尺蠖的等待时间，以尺蠖该特定对小鼠的时间。这些参数是基于与在小鼠6重复挖掘行为之前的方法工作。
- 计算平均持续时间，频率，和延迟的分析（ 即 BTBR与B6）挖掘每个实验组。使用单因素方差分析或t-检验来比较菌株/实验组之间的数据。
注意：当程序完成的第二天，使用重复测量方差分析，以确保没有任何后续的审判效果或配对的效果。
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Representative Results
这里所描述的少年播放测试的修改后的版本可用于观察和分析新的重复挖掘行为称为inchworming。 Inchworming由BTBR小鼠比B6的控制表现出一个更大的程度。在一个典型的10分钟会议，BTBR老鼠会显示不同的inchworming行为（爪子同步向内和向外运动，以努力取代木屑床上用品）约5分钟，或一半的观察期。此外，潜伏期尺蠖是显著缩短为BTBR老鼠 - 它们通常会开始前10秒的记录会话的开始内inchworming。相比之下，对照组小鼠（B6）有一个平均潜伏期为4分尺蠖，花的时间非常小的部分实际显示的行为。这些研究结果是相似的，从对啮齿动物的3,6重复挖掘行为之前的研究数据。
FIGURË1描绘了正确的实验装置的测试程序。 图2给出了平均inchworming持续时间（A），频率（B）和延迟（ 三）尺蠖的BTBR小鼠和对照B6菌株。所有参数均菌株之间的显著差异。在本文报道的实验中，测试inchworming施用超过2天的试验期间，与在第二天备用配对，以及每一天的结果进行比较。没有发现显著的差异，从而保证效果不依赖于任何特定的鼠标配对或测试的重复。最后， 图3包含静态照片从事inchworming行为的两个主要组成部分不同的小鼠。
图1。设备设置为inchworming实验 。设备设置为inchworming实验。 A 30厘米的立方体有机玻璃框设置在红外变焦摄像机放置在一个45°角的前面的表。所述外壳的所述底部覆盖全面的偶数层中的至少1英寸的木屑。
图2。平均inchworming持续时间，频率和延迟显示的对BTBR和B6小鼠的 BTBR（N = 8）和B6（N = 8）小鼠在P35-P40测试，在两天的测试期，打进了inchworming行为一）BTBR株显示显著更长的平均持续时间inchworming的比B6的对照菌株（P <0.001）。 二）BTBR小鼠显示signific相对于B6的对照组（P <0.001）inchworming的antly更高的频率。 三）有在BTBR一个显著差异（N = 8）和B6（N = 7）延迟挖掘与BTBR显示的时间明显减少了把要显示的行为相比，B6的对照组（P = 0.001）。
图3不同的小鼠在inchworming行为的两个方面的说明性表示。上面板是老鼠在inchworming行为的延伸相位的一个例子，而下面的盘在inchworming行为的收缩相位小鼠的一个例子。 Inchworming被定义为前部的同步向内和向外的同步运动和后腿鼠标肢体置换寝具。
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Discussion
Inchworming是一种新型的测量，可以用于研究许多疾病表现出刻板如ASD重复的行为。有4个步骤，是极为重要的，从改性少年社会交互协议产生可靠inchworming数据：1）延长的隔离期是必不可少的inchworming测试，不应该从协议中删除或缩短。这项规定是专门针对inchworming的测试在这里描述对。 2）视频摄像机需要被适当地定位和聚焦，以使小鼠可以在整个有机玻璃外壳完全可视化。 3）外壳应测试对之间进行彻底的清洗，以确保当前行为不受从现有对小鼠的气味的影响。 4）床上用品材料的外壳必须足够（〜1寸深），且必须是锯末;老鼠不小/无被褥或当显示inchworming行为放在其他铺垫材料。
虽然这里没有描述，我们已经观察到类似的层状单独的外壳（而不是成对）置于非隔离，社会安置BTBR老鼠inchworming行为。在这些条件下，本BTBR小鼠仍然尺蠖，但是在较低的频率和持续时间，从而表明该inchworming行为是一个刻板行为可能引起的社会焦虑（数据未显示）。然而，由于研究未能可靠地证明BTBR和B6对照组之间的差异在焦虑，焦虑很可能与其他因素相互作用而引起这种行为12。然而，这种方法的文章的重点是标准化的修改，青少年社会交往的协议，因为它引出的行为，快速，可靠，具有BTBR和B6小鼠之间的巨大差异。此外，数据是从两种动物在单个会话中收集的，从而增加了通知通报BULLETIN从每个测试期间获得的。在我们的实验室中，inchworming行为只被证实P35-P55的年龄范围。虽然它可能是老鼠年轻和年长的会显示此重复的行为，查明故障后inchworming其他年龄可能表明该行为是特定于青少年和年轻成年小鼠。
从这个实验中，数据清楚地表明，在BTBR小鼠品系接合在重复inchworming行为更加迅速，更加频繁和更长的持续时间比B6的控制。因此，inchworming行为可能为研究人员提供与其他自闭症重复性的行为和疾病模式的一项新措施。虽然目前尚不清楚是什么驱使这种重复挖掘动作，BTBR小鼠也显示更高层次的自我疏导和社交回避1，9。由于挖掘是在老鼠天生的基因调节特性，对inchworming行为的测试可以bË容易应用到其他菌株和有可能成为评估其他疾病模型运动的刻板和强迫行为的有价值的工具的潜力。
其中一个标志性的行为特征所特有的ASD是有限制的利益9的重复行为。除了突出了宝贵的马达刻板，这个实验已经通过展示类似的临床表现马达刻板在ASD患者的额外的重复行为增加ASD的BTBR小鼠模型的有效性。 Inchworming被同时显示在BTBR（ASD）小鼠和B6对照组小鼠，虽然行为是比较罕见的B6小鼠。最相似inchworming的行为挖掘行为在啮齿目动物。托马斯等人。4表明，对于啮齿类动物，挖掘供应各种功能，包括粮食储存，逃避捕食者和保护厌恶的环境。由于这些功能都没有NEC埃森在实验室环境，谁展示高水准的挖掘行为小鼠可实现一种强迫行为需要4。此外，Silverman 等。9表明挖行为应当纳入少年群居相互作用试验作为非社会活动的度量的分析。
综上所述，inchworming是一个高度重复的显著更为普遍行为BTBR小鼠（房间隔缺损的模型）相比，B6小鼠（对照菌株）。虽然该行为的病因目前尚不清楚，它可能是研究人员研究强迫症和重复许多疾病的啮齿类动物模型的宝贵资源。程序技术简单，可以在24小时的时间段容易地完成。数据分析更复杂和耗时的，但视频记录测试过程允许研究者完成分析离线和重复，以确保评判间一致性和可靠性。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
作者感谢由玫瑰托比亚斯，Younghee安贞焕和大卫N.罗斯金所提供的技术和后勤援助和专门知识。这里所描述的工作是由亚省儿童医院基金会和亚省儿童医院研究所。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 cm X 30 cm Plexiglas box with lid | Can be constructed | ||
| IR Camera | Survshop (Calgary, Alberta) | Sony CCD Camera DP955V- 30’ Infrared Armor Dome | Find a camera with high-resolution and zoom capabilities |
| DVR | Supercircuits (Austin, Texas) | BLACK Enterprise-Class 4-Channel H.264 security DVR with DVD Burner | High data capacity |
| Sawdust | Same as bedding material |
References
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