Summary
Inchwormingは十分なおがくずのベッドでのテストケージに入れたときBTBR T + Itpr 3TF / J（BTBR）マウスで表示される反復性の高い同期掘削運動である。手順は、少年の社会的相互作用プロトコルの変形例であり、自閉症スペクトラム障害に関連した反復運動常を評価するためにここで使用されます。
Abstract
自閉症スペクトラム障害（ASD）は、制限された興味を持って減少した相互の社会的相互作用、通信異常、および反復行動によって特徴づけられる行動定義されている神経発達障害である。診断は臨床基準に基づいているため、この不均一性障害のいずれかの関連する可能性の齧歯類モデルは、理想的には、これらの多様な行動特性を再現する必要があります。 BTBR T + Itpr3 TF / J（BTBR）マウスなどの増加グルーミングだけでなく、認知硬直などの反復行動を表示する、ASDの確立された動物モデルである。社会的相互作用および目的に関して、若年プレイテストは、ASDの複数のげっ歯類モデルにおいて有効に用いられている。ここでは、BTBRマウスをおがくずのベッドを含む少年社会的相互作用の筐体でテストしたとき、彼らは繰り返し同期掘削の動きを表示することを示している。と称されるこの反復的な運動行動、「inchworming」は、命名された床の上を水平に移動しながら、マウスが示す動きのステレオタイプな性質のため。 Inchwormingマウスは、内向きと外向きの1運動1以上を実行する、ベッドを移動させるために同期して、その前後と後肢を使用する必要があります。 BTBRとC56BL/6J（B6）マウスの両方がこの挙動を示すが、BTBRマウスは有意に高い期間と頻度inchwormingのとベッドのエンクロージャ内に置かれたときinchworming開始まで低下し、待ち時間を示しています。我々は、この新たに説明した動作を容易にASDの動物モデルにおいて測定することができる反復運動常の尺度を提供すると結論付けている。
Introduction
異常な社会的相互性、コミュニケーションにおける障害、および反復的な/常同行動1：自閉症スペクトラム障害（ASD）の病態生理は不明のままであるが、診断は大きく3つの症状カテゴリーの存在に依存する。ほとんどの齧歯類モデルは、同時に単一の動物に3つのすべての症状を再現することはできません。このようにして、確実に障害の一部またはすべての側面をシミュレートすることができますモデルは、効果的な予防と治療戦略の開発のための大きな価値を保持します。 ASDのすべての3つの側面が表示されない1つのモデルはBTBRマウス1,2である。
超音波発声および社会的アプローチアッセイと組み合わせて、若年社会的相互作用試験は、一般に小児ASDのマウスモデルを特徴付けるために使用され;これらのテストの測定値は、ASDのコアの特徴を表す異常な社会的行動を減少させます。若年社会的相互作用試験に加えて、他の多くの試験は、ASDの動物モデルにおいて常同行動を測定するために使用されてきた。例えば、オブジェクトを覆うように努力スナウトと前足を使用して寝具材料を変位させる、動物の傾向を調べ、ガラス玉覆い隠し試験は、3,4嫌悪刺激に応答して発生強迫常同行動を測定すると考えられている。したがって、掘削試験は、ASDの動物モデルおよびげっ歯類3,5-7の異なる種で、この反復的な行動を定量化するために実施されてきた。掘削動作は寝具材料を変位させるスナウトまたは足の明らかな指向の行動として定義され、反復的な運動行動4の敏感なパラメーターであると仮定されている。
ここで、我々は、マウスのBTBR株中で「inchwormingを」と呼ばれた、掘るの新しいタイプを報告します。この新規な挙動の特徴付けは、更に、valのために使用することができる反復運動行動のロバスト尺度を提供することができるこのようなASD、ハンチントン病や強迫行動8,9などの齧歯類モデルのidation。私たちは、内側に寝具材料の変位につながる外側に同期移動が続く前後と後肢の少なくとも1同期運動として「inchworming」を定義します。これは多くの点で、典型的な掘削動作とは異なります。まず、inchwormingの動作は通常のエピソードとの組み合わせではなく、単一の孤立イベントとして観測される。これとは対照的に、掘削は、後肢または前部足3のいずれか一つの協調運動として発生する可能性があります。また、inchworming動きが行動を掘るの特徴である静止位置とは対照的に、エンクロージャの床の上を水平方向に発生する傾向がある。典型的な掘削行動がマウスのB6およびBTBR株で共通しているのに対し、最終的には、以下に述べるinchworming動作がマウスのBTBR近交系で頻繁に発生しますが、まれにB6の対照株で識別されていない
ガラス玉覆い隠し、掘る、そして少年の遊びは、ASDのマウスモデルで異常な行動を測定するための値が確立されていることを考えると、inchwormingの動作では、常同行動のこれらの以前に定義された測定値を補完します。特に、inchworming動作は一般的に、ASD 8,11で識別され、下位運動常の有用な尺度を提供しています。さらに、この新しいinchworming手順は、例えば、ASDなどの発達障害に関連する反復的な運動行動の分析のための追加の貴重なツールを研究者に提供することができる。
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Protocol
すべての手順は、カナダ動物管理委員会に合わせて行われ、カルガリー大学の動物実験委員会によって承認された。
1。動物の準備
- （12時間）、試験前に一晩、マウスを分離します。これを行うには、自分自身、試験の前の日でケージで実験的分析に必要BTBRのすべてとB6マウス（P35-P40）を配置します。
- 動物が新しい環境に慣らすしめる行動分析室で、試験前に30分を分離したマウスを置きます。
2。機器の準備
- 試験室での取り外し可能な蓋付き30×30センチメートルプレキシガラスボックスを配置します。テーブルの上に箱を置いて、下から45°の角度にビデオカメラを配置。カメラのこの場所は、エンクロージャとマウスのフロア全体の可視化を可能にする。の壁からまぶしさを最小限に抑えるために赤外線ライトを使用ボックス。
- 低ルクス環境下での撮影を最適化するために、赤外線機能を備えた高ズーム機能を有するビデオカメラを使用してください。マウスをボックス全体を通して可視化されるように画像を拡大囲いの上にカメラの焦点を合わせる。
- おがくず寝具（約1インチの深さでなければなりません）と箱のフロア全体をカバーしています。
3試験手順
- テストエンクロージャ内 - マウスの株内のペア（BTBRまたはB6-B6 BTBR）を配置します。
- 試験室の照明をオフにします。
- 部屋を記録し、終了するには、ビデオカメラを起動します。これは、マウスの挙動に実験者の影響を防ぐことができます。 11分間の活動を記録する。
- 録音が完了したら、試験室を再入力し、元のホームケージにマウスを返す。
- 、おがくずのベッドを処分70％エタノールで全試験ボックスを洗って、テストの底に新しいおがくずのベッドを配置しますエンクロージャ。
- 内染色のペアの残りの手順全体を繰り返し、元のケージにマウスを返す。
注意：inchwormingデータの信頼性を確認するには、手順が異なるBTBR-BTBRとB6-B6対の組み合わせで、その後の日に繰り返すことができる。これは観察された挙動は、エンクロージャ内の特定のパートナーに依存しませんが、inchworming個々のことが保証されます。
4。データ解析
- Inchwormingを効果的にベッドを変位1内側にして、共起その後の外側への移動を最小限に抑えて、動物の前後とHind-フィートの同期内向きと外向きの運動として定義されています。手動で10分のビデオで尺取虫する合計時間、周波数、および待ち時間を確認するために二回（一回各マウス用）各ビデオを見て、スコア。期間、頻度、およびレイテンシをinchwormingの手動採点は以下に基づいている必要がありますINGの定義：
Inchworming時間は各マウスinchworming行動に従事するに費やす総時間として定義されます。 inchwormingのこの側面を獲得するために、開始および停止することができ、タイマーを使用しています。マウスはマウスがinchwormingを停止したときにタイマーをインチワームおよび停止し始めたタイミングを開始します。マウスは、再び再スタートを尺取虫、タイマーを再停止を開始するとしている場合。マウスinchwormsたびに10分の観察期間の間、タイマの開始と停止を繰り返します。これは午後12時と10時分の間にあるinchworming期間スコアを生成します。
Inchworming周波数は ：マウスが10分の観察期間中inchworming行動に従事した回数として定義されます。シングルカウントは毎回マウスが開始され、停止しinchwormingを授与されている。 inchworming頻度スコアは0と∞の間の数になります。
尺取虫の待ち時間は ：時間THとして定義されているinchwormingの最初の発症前のパスで。ビデオの開始時に、これは時間が午後12時であること、そしてときにマウスinchworms初めてタイマーを停止し、タイマーを起動します。マウスがinchworming振る舞いが表示されない場合は尺取虫する待ち時間が10時になります。尺取虫するレイテンシを分析する際に、午前0時01分〜10:00分の間のスコアが得られるであろう。試験期間の間、尺取虫に失敗するマウスは、結果がinchworming挙動を示すマウスの集団に関連していることを確認するためにサンプル集団から除去されるべきである。 - ビデオで各マウスについてinchwormingの合計頻度と持続時間を計算します。マウスの特定のペアに対して尺取虫するレイテンシ尺取虫するペアの最初のマウスに必要な時間を計算します。これらのパラメータは、マウス6における反復掘削行動に関連する先行方法論的作業に基づいています。
- 平均期間を計算、周波数、および分析の各実験群（ すなわち BTBR対B6の）のために掘るの待ち時間。株/実験群との間でデータを比較するためにANOVAまたはt検定を使用してください。
注：手順は二日目に完了すると、後続の試行の効果やペアリングの影響がなかったことを確認するために、反復測定分散分析を使用しています。
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Representative Results
ここで説明する少年再生テストの修正版は、反復的な掘削挙動がinchwormingと呼ばれる小説を観察し、分析することができる。 InchwormingはB6コントロールよりBTBRマウスで遠くがより一層発揮される。典型的な10分のセッションでは、BTBRマウスは約5分、または観察期間の半分（おがくずのベッドを移動させるための努力に足の同期内向きと外向きの運動）の異なるinchwormingの動作を表示します。さらに、尺取虫するレイテンシはBTBRマウスで有意に短くなっている - 彼らは、一般的に記録されたセッションの開始の最初の10秒以内にinchworming始める。対照的に、対照マウス（B6）は、4分の尺取虫までの平均待ち時間を有しており、実際の挙動を表示するそれらの時間の非常に小さな部分を費やす。これらの知見は、げっ歯類3,6における反復掘削行動に関する以前の研究からのデータに似ています。
FigurE 1は図2 BTBRマウスと対照B6株について尺取虫、平均inchworming時間（A）、周波数（B）と遅延（C）を示しているテスト手順のために設定の適切な実験を示している。すべてのパラメータは、系統間で有意差が認められた。ここに報告された実験では、inchworming試験は二日目に代替ペアで、2日間の試用期間にわたって投与し、毎日の結果を比較した。有意差は、このような効果は、特定のマウスのペアリングやテストの繰り返しのどちらかに依存していなかったことを確認して、発見されなかった。最後に、 図3は、まだinchworming行動の2つの主要コンポーネントに従事異なるマウスの写真が含まれています。
図1。機器inchworming実験用に設定 。 inchworming実験用に設定機器。 30cmのプレキシガラス立方体ボックスは45°の角度で配置赤外線ズームカメラの前にテーブルの上にセットされる。筐体の底部は、おがくずの少なくとも1インチの均一な層で完全に覆われている。
図2。平均inchwormingの期間、頻度および待ち時間BTBRとB6マウスのペアで表示される。BTBR（N = 8）とB6（N = 8）マウスを2日間のテスト期間にわたってP35-P40でテストされ、inchwormingのためにスコア化した行動。A）BTBR株はB6コントロール株よりもinchwormingのかなり長い平均時間（P <0.001）。B）BTBRマウスはsignificを表示する表示されたantly高いBTBRに有意な差が認められたB6コントロールと比較してinchwormingの周波数（P <0.001）。C）（N = 8）とB6（N = BTBRは時間それの著しい低下を表示して掘る7）のレイテンシB6コントロール（P = 0.001）と比較した挙動を示すのにかかった。
下のパネルはinchworming行動の収縮期のマウスの例であるのに対し、 図3。inchworming行動の両方の面で異なるマウスの実例表現。上のパネルは、inchworming行動の延長期のマウスの例です。 。 Inchwormingは前面の内側に同期および同期外側への移動のように定義してベッドを移動させるには、マウスの後肢ている。
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Discussion
Inchwormingは、ASDなどの常を示す多くの疾患を研究するために使用することができる反復的な行動の新規尺度である。修正された少年の社会的相互作用プロトコルから信頼性の高いinchwormingデータを生成する極めて重要である4つのステップがあります：1）拡張隔離期間がinchwormingテストに不可欠であり、プロトコルから削除又は短縮すべきではありません。この要件は、ここで説明するペアでinchwormingの試験に特異的である。 2）ビデオカメラは、マウスが完全に全体プレキシガラス筐体を通して視覚化することができるように適切に配置し、集束させる必要がある。 3）エンクロージャは完全に現在の行動は、マウスの前にペアから香りに影響されないことを保証するための試験のペアの間に清掃する必要があります。 4）エンクロージャの寝具材料が十分でなければならない（〜1インチの深さ）とおがくずでなければなりません。マウスは少し/いいえ寝具を使用して場合やinchworming動作を表示しない他の寝具材料上に配置した。
ここで説明されていないが、我々は同じような層状の筐体に単独（むしろペアに比べて）置か非絶縁型、社会的に収容されたBTBRマウスでinchworming挙動を観察した。これらの条件下で、BTBRマウスは依然としてシャクトリムシが、より低い頻度および持続時間で、このようにしてinchworming現象はおそらく社会不安（データは示していない）によって誘発される常同行動であることを示す。しかし、研究は確実にBTBR及びB6対照マウスとの間の不安の差を示すことができなかったことを考えると、不安は、おそらく、この現象12を誘導するために他の因子と相互作用している。それはBTBRとB6マウスとの間の劇的な違いは、迅速かつ確実に行動を誘発ので、この方法論の記事の焦点は、少年の社会的相互作用プロトコルに標準化された修正した。また、データは、このよう知らせる増加、単一のセッションで2匹の動物から採取されATIONは、各テスト期間から得られた。当研究室では、inchworming動作は、P35〜P55の年齢範囲で確認されている。それはマウスが若いと古いが、この反復的な行動を表示することは可能ですが、他の年齢でinchworming識別するために、失敗は行動が青年および若年成人マウスに特異的であることを示すことがあります。
この実験からのデータはBTBRマウス系統は、より頻繁に、B6のコントロールよりも長い期間のために、より迅速に反復的なinchworming行動に従事していることを明確に示している。 inchwormingの動作は、それゆえ、他のASDと疾病モデルで反復行動の新しいメジャーを研究者に提供することがあります。それは、この反復的な掘削の動きを駆動何未だ明らかではないが、BTBRマウスは、自己グルーミングと社会的回避1、9より高いレベルを表示します。掘削は、マウスにおける先天性の遺伝的調節性形質であるように、inchworming行動のテストができるBEは、他の株に容易に適用し、その他の疾患モデルにおける運動常と強迫的行動を評価するための貴重なツールとなる可能性があります。
ASDを特徴づける特徴で行動特性の一つは、制限された利益の9と反復的な行動である。貴重なモーター常を強調することに加えて、この実験は、ASD患者における運動常の臨床症状に類似の追加の反復的な行動を示すことにより、ASDのBTBRマウスモデルの妥当性を増加している。動作はB6マウスでは比較的まれですがInchwormingは、BTBR（ASD）マウスとB6コントロールマウスの両方に表示されます。最も密接inchwormingに似ている動作は、げっ歯類での行動を掘っている。トーマスら 4はげっ歯類のために、掘削は食品保存、捕食回避、そして嫌悪の環境からの保護を含め、様々な機能を提供していますことを示唆している。これらの機能は、NECではないのでessary実験室の設定で、掘り挙動を高レベルで表示したマウスは、強迫的行動の必要性を満たす4てもよい。さらに、シルバーマンら 9は掘り挙動は、非社会的活動の尺度として若年社会的相互作用試験の分析に組み込まれるべきであることを示唆している。
要約すると、inchwormingはB6マウス（対照株）に比べBTBRマウス（ASDのモデル）で有意により流行高度に反復動作です。行動の病因は現在のところ不明であるが、多くの疾患のげっ歯類モデルにおいてcompulsivityおよび繰り返しを検査する研究者にとって貴重なリソースであってもよい。手続き型の技術は単純であり、24時間の期間内に容易に完了することができる。データ分析は、より複雑で時間がかかるが、試験手順を記録したビデオは、研究者、オフライン分析を完了するために繰り返し評価者間の一貫性を確保することを可能にし、信頼性。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者は、ローズトビアス、Younghee安、とDavid N.ラスキンによって提供される技術や物流支援と専門知識に感謝しています。ここで説明する作業は、アルバータ州の小児病院財団とアルバータ州の小児病院研究所によって資金を供給された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 cm X 30 cm Plexiglas box with lid | Can be constructed | ||
| IR Camera | Survshop (Calgary, Alberta) | Sony CCD Camera DP955V- 30’ Infrared Armor Dome | Find a camera with high-resolution and zoom capabilities |
| DVR | Supercircuits (Austin, Texas) | BLACK Enterprise-Class 4-Channel H.264 security DVR with DVD Burner | High data capacity |
| Sawdust | Same as bedding material |
References
- McFarlane, H. G., Kusek, G. K., Yan, M., Phoenix, J. L., Bolivar, V. J., Crawley, J. N. Autism-like behavioral phenotypes in BTBR T+tf/J mice. Genes, Brain, and Behavior. 7, 152-163 (2008).
- Crawley, J. N. Designing mouse behavioral tasks relevant to autistic-like behaviors. Mental Retardation and Developmental Disabilities Research Reviews. 10 (4), 248-258 (2004).
- Deacon, R. Digging and marble burying in mice: simple methods for in vivo identification of biological impacts. Nature Protocols. 1 (1), 122-124 (2006).
- Thomas, A., Burant, A., Bui, N., Graham, D., Yuva-Paylor, L. A., Paylor, R. Marble burying reflects a repetitive and perseverative behavior more than novelty-induced anxiety. Psychopharmacology. 204, 361-373 (2009).
- Dudek, B. C., Adams, N., Boice, R., Abbott, M. E. Genetic influences on digging behaviours in mice (Mus musculus) in laboratory and seminatural settings. Journal of Comparative Psychology. 97 (3), 249-259 (1983).
- Webster, D., Williams, M. H., Owens, R., Geiger, V., Dewsbury, D. A. Digging behavior in 12 taxa of muriod rodents. Animal Learning and Behavior. 9 (2), 173-177 (1981).
- Pobbe, R. H., Pearson, B. L., Defensor, E., Bolivar, V. J., Blanchard, D. C., Blanchard, R. J. Expression of social behaviours of C57BL/6J versus BTBR inbred mouse strains in the visible burrow system. Behavioural Brain Research. 214, 443-449 (2010).
- Lewis, M. H., Tanimura, Y., Lee, L., Bodfish, J. Animal models of restricted repetitive behavior in autism. Behavioural Brain Research. 176, 66-74 (2007).
- Silverman, J. L., Yang, M., Lord, C., Crawley, J. N. Behavioural phenotyping assays for mouse models of autism. Nature Reviews. 11, 490-502 (2010).
- Deacon, R., Rawlins, J. Hippocampal lesions, species-typical behaviours and anxiety in mice. Behavioural Brain Research. 156, 241-249 (2005).
- Pearson, B. L., et al. Motor and cognitive sterotypies in the BTBR T+tf/J mouse model of autism. Genes, Brain, and Behavior. 10, 228-235 (2011).
- Pobbe, R. H., Defensor, E., Pearson, B. L., Bolivar, V. J., Blanchard, D. C., Blanchard, R. J. General and social anxiety in the BTBR T+ tf/J mouse strain. Behavioural Brain Research. 216 (1), 446-451 (2011).
