Summary
Inchworming является весьма повторяющиеся синхронное движение копания отображается BTBR T + Itpr 3TF / J (BTBR) мышей при размещении в испытательной клетке с достаточной опилками. Процедура представляет собой модификацию протокола социального взаимодействия несовершеннолетних и используется здесь для оценки повторяющиеся двигательные стереотипии, имеющие отношение к аутизма спектра расстройства.
Abstract
Расстройства аутистического спектра (ASD) является поведенчески определены развития нервной системы заболевание, характеризующееся снижением социального взаимодействия, нарушение связи, и повторяющимся поведением с ограниченным интересом. Как Диагноз основывается на клинических критериях, любые потенциально соответствующие модели на грызунах из этой гетерогенной расстройства в идеале должны повторять эти разнообразные поведенческие черты. BTBR Т + Itpr3 тс / J (BTBR) мышь является признанным животная модель ASD, отображения повторяющихся действий, таких как повышенная ухода, а также познавательной негибкости. Что касается социального взаимодействия и интерес, тест игра несовершеннолетних был принят на работу в нескольких моделях грызунов ASD. Здесь мы показываем, что когда мыши BTBR тестируются в отношении несовершеннолетних корпусе социального взаимодействия, содержащей опилками, они показывают повторяющиеся синхронное движение копания. Это повторяющимся поведением двигателя, называют "inchworming," был названиз-за стереотипного характера движений, проявляемых мышей при перемещении по горизонтали по полу. Inchworming мышей должны использовать свои передних и задних конечностей-синхронно вытеснять постельные принадлежности, выполняя как минимум один внутренний и один внешнее движение. Хотя оба BTBR и C56BL/6J (В6) мыши обнаруживают это поведение, мыши BTBR демонстрируют значительно более высокую продолжительность и частоту inchworming и уменьшенную задержку инициировать inchworming при размещении в местная корпуса. Мы пришли к выводу, что это недавно описано поведение представляет собой меру повторяющегося двигателя стереотипии которые могут быть легко измеряется в животных моделях ASD.
Introduction
Хотя патофизиология расстройства аутистического спектра (ASD), остается неясным, диагностика зависит от наличия три основные категории симптомов: аномальной социальной взаимности, нарушениями коммуникации и повторяющихся / стереотипных поведения 1. Большинство моделей грызунов не могут одновременно воспроизводить все три симптома в одного животного. Таким образом, модели, которые могут достоверно моделировать некоторые или все аспекты расстройства провести большое значение для развития эффективных профилактических и терапевтических стратегий. Одна модель, что действительно показывает все три аспекта ASD является мышь 1,2 BTBR.
В сочетании с ультразвуковыми вокализации и социальный подход анализов, тест по делам несовершеннолетних социальное взаимодействие обычно используется для характеристики модели мыши педиатрической ASD; эти тесты измеряют снизилась и аномальные социального поведения, которые представляют собой основные функции ASD. В дополнение к испытанию на несовершеннолетних социального взаимодействия, многие другиеТесты были использованы для оценки стереотипных поведения на животных моделях ASD. Например, тест захоронение мрамор, который рассматривает тенденцию животного вытеснять постельные принадлежности материала с помощью морда и передние лапы в попытке покрыть объект, как полагают, измерить навязчивые стереотипные поведения, которые происходят в ответ на отрицательные подкрепления 3,4. Соответственно, рытье Тесты были реализованы количественно этот повторяющимся поведением на животных моделях ASD и различных видов грызунов 3,5-7. Копаем поведения определяются как очевидных, направленных действий рыла или лапы, чтобы вытеснять подстилки и было предположить, чтобы быть чувствительным параметром повторяющимся поведением 4 двигателя.
Здесь мы сообщаем тип романа копания, который мы назвали "inchworming" в штамме BTBR мышей. Характеристика этого нового поведения может обеспечить надежную меру повторяющегося моторного поведения, которые могут быть использованы для дальнейшего валidation моделей грызунов, таких как ASD, Хантингтон "болезни или обсессивно-компульсивного поведения 8,9. Определим "inchworming", как по крайней мере один синхронного движения передних и задних конечностей-внутрь с последующим синхронным движением наружу, что приводит к перемещению подстилочного материала. Это отличается от типичного поведения копания во многих отношениях. Во-первых, inchworming поведение обычно наблюдается в виде комбинации эпизодов, а не одного изолированного события. В противоположность этому, копания может произойти в одном скоординированного движения либо ланью или передних лапах 3. Кроме того, inchworming движения, как правило, происходят по горизонтали по полу корпуса, в отличие от стационарных позиций, которые характерны для рытья поведения. Наконец, inchworming поведение описано ниже часто встречается в BTBR инбредной линии мышей, но редко определены в контрольного штамма В6, в то время как типичные формы поведения копания распространены в В6 и BTBR линий мышей
Учитывая, что мрамор захоронение, рытье и несовершеннолетних игра установили значение для измерения аномального поведения в мышиных моделях ASD, поведение inchworming дополняет эти ранее определенные измерения стереотипных форм поведения. В частности, inchworming поведение обеспечивает полезную меру нижних двигательных стереотипии порядка, которые обычно определенных в ASD 8,11. Кроме того, эта новая процедура inchworming может обеспечить исследователей с дополнительным ценным инструментом для анализа повторяющихся автомобильных поведения, имеющих отношение к нарушениями развития, таких как ASD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры были проведены в соответствии с Комитетом по канадской уход за животными и одобрены Университета Калгари комитета по уходу за животными.
1. Подготовка животных
- Изолировать мышей в течение ночи (12 ч) до начала испытаний. Чтобы сделать это, поместите все BTBR и мышей В6 (P35-P40) необходимы для экспериментального анализа в клетках сами по себе, за день до тестирования.
- Поместите изолированный мышей в поведенческой анализ номер 30 минут до тестирования, так что животные привыкают к новой среде.
2. Подготовка оборудования
- Поместите см оргстекло 30 х 30 коробка со съемной крышкой в комнату тестирования. Поместите коробку на стол и расположите видеокамеру под углом снизу 45 °; такое расположение камеры позволит визуализацию всей этаже корпуса и мыши. Используйте инфракрасный подсветку, чтобы помочь свести к минимуму блики от стеныкоробка.
- Используйте видеокамеру, которая обладает высокой функцию масштабирования с инфракрасными возможностями для оптимизации съемки в условиях низкой люкс. Сфокусируйтесь на корпусе Увеличение изображения так, что мыши визуализируются в течение всего окне.
- Накройте весь пол коробку с опилками (должна быть примерно 1 дюйм глубиной).
3 Проведение испытания
- Поставьте пару внутри линии мышей (BTBR - BTBR или B6-В6) в течение испытательного корпуса.
- Выключить свет в комнату тестирования.
- Запустите видеокамеру, чтобы записать и выйдите из комнаты. Это позволит предотвратить экспериментатора влияние на поведение мышей. Запишите деятельность в течение 11 мин.
- После завершения записи, повторно ввести тестирование комнаты и вернитесь мышей в свои родные дома клетках.
- Утилизировать опилками, вымыть всю коробку тестирования с 70% этанола, и поместите новый опилками в нижней части тестированиякорпус.
- Повторить всю процедуру для остальных пар внутри пятна и вернуть мышей в их исходные домашних клетках.
Примечание: Для проверки достоверности данных inchworming, процедура может повторяться в последующие дни с различной BTBR-BTBR и комбинаций B6-В6 пары. Это будет гарантировать, что наблюдаемое поведение не зависит от конкретного партнера в корпусе, но inchworming индивидуальный.
4. Анализ данных
- Inchworming определяется как синхронный входе и выходе движения животного передних и задних футов, с минимумом одного сопутствующих внутрь, а затем последующей внешней движения, которое эффективно вытесняет постельные принадлежности. Вручную смотреть и забивать все видео дважды (один раз для каждой мыши), чтобы установить общую продолжительность, частоту и латентность до Inchworm в 10 мин видео. Руководство озвучивание inchworming длительность, частоту и время задержки должно быть основано на последующихING определения:
Inchworming Продолжительность: Определяется как общее время каждая мышь тратит занимается поведения inchworming. Чтобы забить этот аспект inchworming, использовать таймер, который может быть запущен и остановлен. Начните времени, когда мышь начинает Inchworm и остановки таймера, когда мышь останавливается inchworming. Когда и если мышь начинает снова Inchworm, повторного запуска и вновь остановить таймер. Повторите запуск и остановку таймера на время 10-минутного периода наблюдения каждый раз, когда inchworms мыши. При этом генерируется счет длительности inchworming, что между 0:00 и 10:00 мин.
Inchworming Частота: Определяется как количество раз, мышь участвует в inchworming поведение в 10 мин периода наблюдения. Один счетчик присуждается каждый раз при запуске мыши и остановки inchworming. Inchworming оценка частоты будет число от 0 до ∞.
Задержка в Inchworm: Определяется как время-йна проходит до первого наступления inchworming. Запустите таймер при запуске видео, это будет время 0:00, и остановки таймера, когда inchworms мыши впервые. Если мышь не отображает inchworming поведение задержка в Inchworm будет 10:00. При анализе задержки в Inchworm, оценка между 0:01 и 10:00 мин будут получены. Мыши, которые не Inchworm на время периода тестирования должны быть удалены из выборки населения, чтобы гарантировать, что результаты имеют отношение к популяции мышей, которые отображают поведение inchworming. - Рассчитайте общую частоту и продолжительность inchworming для каждой мыши в видео. Вычислить время, необходимое для первого мыши в паре с Inchworm для задержки в Inchworm для этой конкретной пары мышей. Эти параметры на основе предварительного методологической работы, связанной с повторяющимися землеройных поведения у мышей 6.
- Рассчитать среднюю продолжительность, частота,и задержки копать для каждой экспериментальной группы в анализе (т.е. BTBR против В6). Используйте ANOVA или т-тест для сравнения данных между штаммами / экспериментальных групп.
Примечание: Если процедура завершается на второй день, используйте повторных измерений ANOVA для того, чтобы не было никаких последующих испытаний эффекты или эффекты спаривания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Модифицированная версия несовершеннолетних плей испытанию, описанному здесь, может использоваться наблюдать и анализировать роман повторяющимся поведением копания называется inchworming. Inchworming проявляется в гораздо большей степени BTBR мышей, чем В6 управления. В типичной мин сессии 10, мыши BTBR покажет явное поведение inchworming (синхронный внутрь и наружу движение лапы в попытке сместить опилками) в течение примерно 5 мин, или половине периода наблюдения. Кроме того, задержка в Inchworm значительно короче для мышей BTBR - они обычно начинают inchworming в течение первых 10 сек от начала записанного сеанса. В противоположность этому, контрольные мыши (В6) имеют среднюю задержку в Inchworm 4 мин и провести очень небольшие порции времени фактически отображения поведение. Эти данные аналогичны данным предыдущих исследований на повторяющихся землеройных поведения у грызунов 3,6.
Figurе 1 изображает правильное Экспериментальная установка для процедур тестирования. Рисунок 2 показывает среднюю продолжительность inchworming (А), частоты (В) и задержки (С) Inchworm для мышей BTBR и B6 контрольного штамма. Все параметры были значительно отличается между штаммами. В эксперименте сообщили здесь, тест inchworming вводили на протяжении 2 дней пробного периода, с альтернативными спариваниях в второй день, и результаты каждого дня были сопоставлены. Никаких существенных различий не было обнаружено, что обеспечивает, что последствия не были зависимы от либо конкретных пар мыши или повторении теста. Наконец, Рисунок 3 содержит неподвижные фотографии разных мышей, занятых в двух основных компонентов поведения inchworming.
Рисунок 1. Комплект оборудования для эксперимента inchworming. Комплект оборудования для эксперимента inchworming. Коробка 30 см куб из оргстекла установлен на столе перед инфракрасной камерой зума при под углом 45 °. В нижней части корпуса покрыта полностью с ровным слоем не менее 1 дюйма опилок.
Рисунок 2. Средняя продолжительность inchworming, частоты и задержки отображается парами BTBR и мышей В6. BTBR (N = 8) и В6 (N = 8) мышей тестировали при P35-P40 в течение двух дней тестирования и оценивают inchworming поведение.) Штамм BTBR проявили значительно больше средняя продолжительность inchworming чем контрольного штамма В6 (р <0,001). Б) Мышей BTBR проявили significantly высокая частота inchworming по сравнению с В6 управления (р <0,001). C) Был значительная разница в BTBR (п = 8) и В6 (п = 7) задержки копать с BTBR отображения заметное снижение времени, которое взял, чтобы отобразить поведение по сравнению с В6 управления (р = 0,001).
Рисунок 3. Иллюстративный представление различных мышей в обоих аспектах поведения inchworming. Верхняя панель является примером мышей в фазе расширение inchworming поведения, в то время как нижняя панель является примером мышей в фазе сжатия поведения inchworming . Inchworming определяется как синхронного внутрь и синхронного наружу движения передних и задних конечностей мыши, чтобы вытеснить постельные принадлежности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inchworming является новым мера повторяющимся поведением, которые могут быть использованы для изучения многих заболеваний, которые демонстрируют стереотипии, например, ASD. Есть 4 шага, которые имеют решающее значение для создания надежных данных inchworming из модифицированного протокола в отношении несовершеннолетних социального взаимодействия: 1) длительный период изоляции имеет важное значение для теста inchworming и не должны быть удалены из протокола или сокращен. Это требование относится только к тестированию inchworming в парах, описанных здесь. 2) видеокамера должна быть соответствующим образом расположены и направлены таким образом, что мыши могут быть полностью визуализируются в течение всего корпуса из плексигласа. 3) Корпус должен быть тщательно очищены от тестирования пар для того, чтобы нынешние поведения не зависит от ароматов от предварительного пары мышей. 4) Постельные принадлежности материал для корпуса должна быть достаточной (~ 1 дюйм глубиной) и должны быть опилки; мыши не отображать inchworming поведение с небольшим / без постельных принадлежностей или приразмещены на других постельных принадлежностей материалов.
Хотя здесь не описана, мы наблюдали inchworming поведение в неизолированных, социально размещены BTBR мышей, помещенных в покое (а не в парах) в аналогичной с двумя кроватями корпус. В этих условиях, мыши BTBR еще Inchworm, но при более низкой частоте и длительности, что свидетельствует о том, что inchworming поведение является стереотипное поведение, возможно, индуцированный социальной тревожности (данные не показаны). Однако, учитывая, что исследования не смогли надежно продемонстрировать различия в тревожности между BTBR и контрольных мышей В6, беспокойство, вероятно, взаимодействуя с другими факторами, чтобы вызвать это поведение 12. Тем не менее, в центре внимания этой методологической статье был стандартизированный модификация с протоколом социального взаимодействия несовершеннолетних, потому что это вызывает поведение быстро и надежно, с драматическими различия между BTBR и мышей В6. Кроме того, данные собираются из двух животных в одном сеансе, тем самым увеличивая сообщитьAtion получила от каждого периода тестирования. В нашей лаборатории, inchworming поведение только было подтверждено в возрасте от P35-P55. Хотя не исключено, что у мышей, молодых и пожилых покажет этот повторяющимся поведением, неспособность определить inchworming в других возрастов может означать, что поведение является специфическим для подростков и молодых взрослых мышей.
Данные этого эксперимента ясно показывают, что штамм BTBR мышь участвует в повторяющимся поведением inchworming быстрее, чаще и на более длительные по сравнению с контрольными В6. Поэтому inchworming поведение может обеспечить исследователей с новым меры повторяющихся действий в другой ASD и моделей заболеваний. Хотя это еще не ясно, что движет этим повторяющиеся движения копания, мыши BTBR также отображать более высокие уровни самостоятельного ухода и социальной избежании 1, 9. Как копания является врожденной генетически регулируются черта у мышей, тестирование inchworming поведения можно бе легко наносится на других штаммов и имеет потенциал, чтобы быть ценным инструментом для оценки двигательных стереотипии и компульсивное поведение в других моделях болезни.
Один из отличительных поведенческих черт, которые характеризуют ASD является повторяющимся поведением с ограниченными интересами 9. В дополнение к освещению ценный двигателя стереотипии, этот эксперимент увеличилось обоснованность модели BTBR мыши ASD, демонстрируя дополнительный повторяющимся поведением похож на клинической картине двигательных стереотипии у пациентов ASD. Inchworming отображается в обоих BTBR (ASD) мышей и контрольных мышей В6, хотя поведение сравнительно редко встречается в мышей В6. Поведение, которое больше всего напоминает inchworming копает поведения у грызунов. Томас и др.. 4 показывает, что для грызунов, рытье подают разнообразные функции, включая хранения продуктов питания, уклонения от уплаты хищника, и защиты от отвращение средах. Поскольку эти функции не включенные в другие группировкиходимо в лабораторных условиях, мыши, которые проявляют высокий уровень копать поведения может быть выполнение компульсивное поведения необходимость 4. Кроме того, Сильверман и др.. 9 показывает, что копать поведение должны быть включены в анализ теста по делам несовершеннолетних социального взаимодействия в качестве меры без общественной деятельности.
Таким образом, inchworming является весьма повторяется поведение значительно более распространены у мышей BTBR (модель ASD) по сравнению с мышами В6 (контроль деформации). Хотя этиология поведения в настоящее время неизвестно, оно может быть ценным ресурсом для исследователей, рассматривающих Компульсивность и повторение в моделях грызунов многих заболеваний. Процедурные методы просты и могут быть завершены с легкостью в период времени с 24 часами. Анализ данных является более сложным и трудоемким, но видеозапись процедуру тестирования позволяет исследователю для завершения анализа офф-лайн и повторно, чтобы обеспечить между оценщик согласованности инадежность.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность за техническую и материально-технической помощи и экспертизы, предоставленной Rose Тобиас, Younghee Ан, и Дэвид Н. Раскин. Работа, описанная здесь было профинансировано Альберты детской больницы фонда и больницы научно-исследовательского института Альберты детей.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 cm X 30 cm Plexiglas box with lid | Can be constructed | ||
| IR Camera | Survshop (Calgary, Alberta) | Sony CCD Camera DP955V- 30’ Infrared Armor Dome | Find a camera with high-resolution and zoom capabilities |
| DVR | Supercircuits (Austin, Texas) | BLACK Enterprise-Class 4-Channel H.264 security DVR with DVD Burner | High data capacity |
| Sawdust | Same as bedding material |
References
- McFarlane, H. G., Kusek, G. K., Yan, M., Phoenix, J. L., Bolivar, V. J., Crawley, J. N. Autism-like behavioral phenotypes in BTBR T+tf/J mice. Genes, Brain, and Behavior. 7, 152-163 (2008).
- Crawley, J. N. Designing mouse behavioral tasks relevant to autistic-like behaviors. Mental Retardation and Developmental Disabilities Research Reviews. 10 (4), 248-258 (2004).
- Deacon, R. Digging and marble burying in mice: simple methods for in vivo identification of biological impacts. Nature Protocols. 1 (1), 122-124 (2006).
- Thomas, A., Burant, A., Bui, N., Graham, D., Yuva-Paylor, L. A., Paylor, R. Marble burying reflects a repetitive and perseverative behavior more than novelty-induced anxiety. Psychopharmacology. 204, 361-373 (2009).
- Dudek, B. C., Adams, N., Boice, R., Abbott, M. E. Genetic influences on digging behaviours in mice (Mus musculus) in laboratory and seminatural settings. Journal of Comparative Psychology. 97 (3), 249-259 (1983).
- Webster, D., Williams, M. H., Owens, R., Geiger, V., Dewsbury, D. A. Digging behavior in 12 taxa of muriod rodents. Animal Learning and Behavior. 9 (2), 173-177 (1981).
- Pobbe, R. H., Pearson, B. L., Defensor, E., Bolivar, V. J., Blanchard, D. C., Blanchard, R. J. Expression of social behaviours of C57BL/6J versus BTBR inbred mouse strains in the visible burrow system. Behavioural Brain Research. 214, 443-449 (2010).
- Lewis, M. H., Tanimura, Y., Lee, L., Bodfish, J. Animal models of restricted repetitive behavior in autism. Behavioural Brain Research. 176, 66-74 (2007).
- Silverman, J. L., Yang, M., Lord, C., Crawley, J. N. Behavioural phenotyping assays for mouse models of autism. Nature Reviews. 11, 490-502 (2010).
- Deacon, R., Rawlins, J. Hippocampal lesions, species-typical behaviours and anxiety in mice. Behavioural Brain Research. 156, 241-249 (2005).
- Pearson, B. L., et al. Motor and cognitive sterotypies in the BTBR T+tf/J mouse model of autism. Genes, Brain, and Behavior. 10, 228-235 (2011).
- Pobbe, R. H., Defensor, E., Pearson, B. L., Bolivar, V. J., Blanchard, D. C., Blanchard, R. J. General and social anxiety in the BTBR T+ tf/J mouse strain. Behavioural Brain Research. 216 (1), 446-451 (2011).
