Summary
Inchworming yeterli odun talaşı ile bir test kafese konulduğunda BTBR T + Itpr 3TF / J (BTBR) fareler tarafından görüntülenen bir çok tekrarlı senkron kazma harekettir. Bu prosedür, çocuk sosyal etkileşim protokolünün bir modifikasyonu olup Otizm Spektrum Bozukluğu ile ilgili tekrarlayan motorlu stereotipileri değerlendirmek için burada kullanılır.
Abstract
Otizm Spektrum Bozukluğu (ASD) kısıtlı ilgi azalmış karşılıklı sosyal etkileşim, anormal iletişim ve tekrarlayıcı davranışlar ile karakterize bir davranışsal tanımlanan nörogelişimsel bozukluktur. Tanı, klinik kriterlere dayalı olarak, bu heterojen hastalığın potansiyel olarak ilgili kemirgen modelleri ideal bu farklı davranış özellikleri özetlemek gerekir. BTBR T + Itpr3 tf / J (BTBR) fare gibi artan tımar yanı sıra bilişsel kararlılık gibi tekrarlayıcı davranışlar sergileme, ASD kurulmuş bir hayvan modelidir. Sosyal etkileşim ve ilgi açısından, çocuk oyun Test ASD birden kemirgen modellerinde istihdam edilmiştir. Burada, biz BTBR fareler talaş yataklar içeren bir çocuk sosyal etkileşim muhafaza test edilir, onlar bir tekrarlayan senkron kazma hareketini göstermek olduğunu göstermektedir. Olarak adlandırılan bu tekrar eden motor davranışları, "inchworming," seçildizemin üzerinde yatay hareket ederken fareler tarafından sergilenen hareketlerin stereotip doğası çünkü. Inchworming fareler içe ve dışa doğru bir hareket tek bir minimum performans, yatak değiştirmesi için eşzamanlı olarak onların ön ve arka-uzuvları kullanmanız gerekir. BTBR ve C56BL/6J (B6) farenin her ikisi de bu davranışı sergiler, ancak BTBR fareler önemli ölçüde daha yüksek süresini ve sıklığını inchworming ve bir muhafaza tabakalı yerleştirildiğinde inchworming başlatmak için azalmış bir gecikme göstermektedir. Bu yeni tanımlanan davranışı kolaylıkla ASD hayvan modellerinde, ölçülebilen bir tekrarlayan motorlu stereotipi bir ölçüsünü sağlar sonucuna varıldı.
Introduction
Anormal sosyal karşılıklılık, iletişim bozuklukları ve tekrarlayan / stereotipik davranışlar 1: otizm spektrum bozuklukları (ASD) patofizyolojisi belirsizliğini koruyor olsa da, tanı üç geniş belirti kategoriden varlığına bağlıdır. En kemirgen modelleri aynı anda tek bir hayvanda her üç belirti üretemezler. Böylece, güvenilir bir bozukluk bazı veya tüm yönleriyle taklit edebilir modelleri etkili önleyici ve tedavi edici stratejilerin geliştirilmesi için büyük bir değer tutun. ASD üç yönlerini göstermek yapar Bir model BTBR fare 1,2 olduğunu.
Ultrasonik sesler ve sosyal yaklaşım deneyleri ile birlikte, çocuk sosyal etkileşim testi yaygın olarak pediatrik ASD fare modellerini karakterize etmek için kullanılır; Bu testler ölçü ASD temel özelliklerini temsil anormal sosyal davranışları azalmış ve. Çocuk sosyal etkileşim testine ek olarak, diğer birçoktestleri ASD hayvan modellerinde stereotipik davranışları ölçmek için kullanılmıştır. Örneğin, bir nesne karşılamak için çaba burun ve ön ayakların kullanılarak yatak malzemesinin yer değiştirmesi için bir hayvanın eğilimi inceler mermer gömme testi, caydırıcı 3,4 uyaranlara tepki olarak meydana gelen stereotipik kompulsif davranışlar ölçmek için düşünülmektedir. Buna göre, kazma testler ASD hayvan modellerinde ve kemirgenler 3,5-7 farklı türlerin bu yineleyici davranış ölçmek için uygulanmıştır. Kazma davranışları burun veya yatak malzemeleri yerinden için pençeleri açık yönettiği eylemler olarak tanımlanan ve tekrarlayıcı motor davranışları 4 duyarlı bir parametre olduğu ileri sürülmüştür.
Burada, biz farelerin BTBR zorlanma "inchworming," olarak adlandırdığı kazma bir roman türü, rapor. Bu yeni davranış karakterizasyonu daha val için kullanılabilen bir tekrar eden motor davranışları sağlam bir önlem sağlayabilirBöyle ASD, Huntington 'hastalığı ya da obsesif kompulsif davranış 8,9 gibi kemirgen modelleri idation. Bu içeriye doğru yatak malzemenin yer değiştirmesine neden olarak dışarı doğru bir senkron hareket ile, ardından ön ve Hind-kollarının en az bir senkron hareket olarak "inchworming" tanımlar. Bu pek çok açıdan tipik kazı davranış farklıdır. İlk olarak, inchworming davranış genellikle oldukça, tek bir olay üstünde bölüm bir birleşimi olarak görülmektedir. Buna karşılık, kazma Hind veya ön pençeleri 3 ya tek koordineli hareketi olarak ortaya çıkabilir. Buna ek olarak, hareketleri inchworming davranışları kazma karakteristiği olan sabit pozisyonları olarak karşı muhafaza zemin üzerinde yatay olarak oluşma eğilimindedir. Tipik bir kazma davranışları farelerin B6 ve BTBR suşlarında ortak olan ise, son olarak, aşağıda tarif edilen inchworming davranışı farelerin BTBR inbred soy sıklıkla ortaya çıkar, ancak nadiren B6 kontrol suşu olarak tanımlanır
Mermer gömülmesi, kazma, ve çocuk oyun ASD fare modellerinde anormal davranışını ölçmek için değer kurduk göz önüne alındığında, inchworming davranış stereotipik davranışları bu önceden tanımlı ölçümleri tamamlar. Özellikle, yaygın olarak inchworming davranış ASD 8,11 tanımlanır düşük sıra, motor sterotiplerin yararlı bir ölçü sağlar. Buna ek olarak, bu yeni inchworming yordam, ASD gibi gelişimsel bozukluklar ile ilgili tekrarlayan motor hareketlerin analizi için ek değerli bir araç olan araştırmacıların sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm prosedürler Kanada Hayvan Bakım Komitesi uygun olarak yapılmış ve Calgary Hayvan Bakım Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1.. Animal hazırlanması
- (12 saat) test öncesinde gecede fareler izole. Bunu yapmak için, kendi başlarına, bir gün önce test ile kafeslerde deneysel analiz için gerekli olan tüm BTBR ve B6 fareleri (P35-P40) yerleştirin.
- Hayvanlar yeni ortama alıştırmak böylece testten önce davranış analizi oda 30 dakika içinde izole edilmiş fareler yerleştirin.
2.. Ekipmanları Hazırlık
- 30 x 30 cm pleksiglas test odasında çıkarılabilir bir kapak ile kutu yerleştirin. Bir masaya kutusunu yerleştirin ve alttan bir 45 ° açıyla video kamera yerleştirmek; Kameranın bu konumu muhafaza ve fare tüm zemin görselleştirme izin verecektir. Duvarından parlamayı en aza indirmek için bir kızılötesi ışığını kullanınkutusu.
- Düşük lux ortamda filme optimize kızılötesi yetenekleri olan yüksek zoom fonksiyonu sahip bir video kamera kullanın. Fareler tüm kutusunda boyunca görsel böylece görüntü büyütme kasasındaki kamerayı odaklanın.
- Odun talaşı (yaklaşık 1 inç derin olmalıdır) ile kutunun tüm zemini örtün.
3 Test Prosedürü
- Test muhafaza içinde - Bir farelerin içi gerginlik çifti (BTBR veya B6-B6 BTBR) yerleştirin.
- Test odasında ışıkları kapatın.
- Odayı kaydetmek ve çıkmak için video kamera başlatın. Bu, farelerin davranışı üzerinde bir etki deneyi önleyecektir. 11 dakika boyunca aktivitesini kaydedin.
- Kayıt tamamlandıktan sonra, test odası yeniden girin ve orijinal kafeslerine fareler dönün.
- , Talaş yatak imha% 70 etanol ile tüm test kutusu yıkama ve test altındaki yeni talaş yatak yerleştirmekmuhafaza.
- Intra-leke çiftlerinin geri kalanı için tüm prosedürü tekrarlayın ve orijinal kafeslerine fareler dönün.
Not: inchworming verilerin güvenilirliğini doğrulamak için, prosedür farklı BTBR-BTBR ve B6-B6 çifti kombinasyonları ile daha sonraki günlerde tekrar edilebilir. Bu görülen davranış, muhafazanın spesifik ortak bağımlı değildir, ancak tek tek inchworming sağlayacaktır.
4.. Veri Analizi
- Inchworming etkili bir şekilde değiştirir, bir yatak içeri doğru ve daha sonra ortak olarak meydana gelen daha sonraki dışa doğru bir hareket, minimum hayvanın ön ve Hind feet senkron içe doğru ve dışa doğru hareketi olarak tanımlanır. El ile izlemek ve 10 dk video inchworm için toplam süresini, sıklığını ve gecikme tespit etmek için iki kez (bir kez her fare için), her bir videoyu atar. Süresi, sıklığı ve gecikme inchworming Manuel puanlama takip dayalı olmalıdırtanımları ing:
Inchworming Süre: Her bir fare inchworming davranış yapan harcadığı toplam süre olarak tanımlanır. Inchworming bu yönünü puan, başlamış ve durdurulabilir bir zamanlayıcı kullanın. Fare, fare inchworming durduğunda zamanlayıcıyı inchworm ve durdurmak başladığında zamanlama başlayın. Fare, tekrar yeniden bir başlangıç inchworm ve zamanlayıcı yeniden durdurmak başladığında ve eğer. 10 dk gözlem süresi her zaman fare inchworms süresince zamanlayıcı başlatma ve durdurma tekrarlayın. Bu 0:00 ve 10:00 dakika arasında bir süre inchworming puan üretecektir.
Inchworming Frekans: fareyi 10 dakika gözlem süresi içinde inchworming davranış yürütmektedir kat sayısı olarak tanımlanır. Tek sayımı her zaman fare başlar ve durur inchworming verilir. Inchworming sıklığı skoru 0 ve ∞ arasında bir sayı olacaktır.
Inchworm için Gecikme: zaman inci gibi tanımlanmış mıaz önce inchworming ilk başlangıcı geçer. Video başladığında sayacını başlatmak, bu sefer 00:00 olabilir ve Sayacı durdurmak ne zaman ilk kez fare inchworms. Fare inchworming davranışlar sergilerler yoksa inchworm için gecikme 10:00 olacaktır. Inchworm gecikmeye analiz ederken, 0:01 ve 10:00 dakika arasında bir puan elde edilecektir. Test süresinin süresince inchworm başarısız Fareler sonuçların inchworming davranışlar farelerde bir nüfusa için uygun olduğundan emin olmak için, numune popülasyonundan çıkarılmalıdır. - Toplam sıklığını ve video her fare için inchworming süresini hesaplayın. Farelerin belirli çifti için inchworm için gecikme için inchworm için çiftindeki birinci fare için gereken zamanı hesaplanır. Bu parametreler farelerde 6 tekrarlayan kazı davranışlarla ilgili önceki metodolojik çalışmalarına dayanmaktadır.
- Ortalama süresini hesaplamak, frekans,ve gecikme analizi (B6 vs yani BTBR) her deney grubu için kazmak. Bir ANOVA veya soylar / deney grupları arasında verileri karşılaştırmak için t-testi kullanın.
Not: işlem ikinci gününde tamamlandığında, hiçbir sonraki duruşma etkisi veya eşleştirme etkileri vardı emin olmak için bir tekrarlanan ölçümler için ANOVA kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada açıklanan çocuk oyun testinin değiştirilmiş bir versiyonu gözlemlemek ve yeni tekrarlayan kazma davranış inchworming adlandırılır analiz etmek için kullanılabilir. Inchworming B6 kontrollerden daha BTBR fareler tarafından çok daha büyük ölçüde sergilenmektedir. Tipik bir 10 dk oturumda, BTBR fareler yaklaşık 5 dakika, ya da gözlem döneminin yarısı kadar (talaş yatak değiştirmesi için bir çaba pençeleri senkron içe ve dışa doğru hareket) ayrı inchworming davranışı gösterecektir. Ayrıca, inchworm için gecikme BTBR fareler için anlamlı olarak daha kısadır - onlar genellikle kaydedilen oturumun başlangıcında ilk 10 saniye içinde inchworming başlar. Bunun aksine, kontrol fareleri (B6) 4 dakika inchworm bir ortalama gecikme ve aslında davranışlar zaman çok küçük porsiyonlarda geçirmek. Bu bulgular kemirgenlerde 3,6 tekrarlayan kazı davranışlar önceki çalışmalardaki verilere benzer.
FigürE 1 test prosedürleri için doğru ayarlanmış deneysel. 2. BTBR fareler ve kontrol B6 suşu için inchworm için ortalama inchworming süresini (A), frekans (B) ve gecikme (C) göstermektedir gösteriyor. Tüm parametreler suşları arasında anlamlı farklıydı. Burada bildirilen deneyde, inchworming testi ikinci gün alternatif eşleşmeleri ile, 2 günlük deneme süresi içinde uygulanmıştır, ve her gün sonuçlar karşılaştırıldı. Anlamlı bir fark böylece etkilerinin özel fare eşleşmeleri ve testin tekrarı ya da bağımlı değildi sağlanması bulunmuştur. Son olarak, Şekil 3 inchworming davranışının iki temel bileşenleri yapan farklı farelerin hala fotoğraf içerir.
Şekil 1. Ekipmanları inchworming deney için kurulmuş. Inchworming deney için kurulmuş donatım. A 30 cm küp pleksiglas kutu 45 ° açıyla yerleştirilmiş bir kızılötesi kamera zoom önünde bir tablo yer almaktadır. Muhafazanın alt talaş en az 1 inç bir çift tabaka ile tamamen kaplanır.
Şekil 2,. Ortalama inchworming süresi, sıklığı ve gecikme BTBR ve B6 farelerinin çiftleri tarafından görüntülenen. BTBR (n = 8) ve B6 (n = 8) farenin iki günlük bir test süresi boyunca P35-P40 ile test edilmiş ve inchworming skorlandırıldı davranış. A) BTBR gerginlik B6 kontrol gerginlik daha inchworming bir anlamlı ölçüde daha uzun ortalama süresi (p <0.001). B) BTBR fareler bir signific görüntülenen görüntülenenB6 kontrollerden (p <0.001) olarak inchworming arasında antly yüksek frekans. C) Orada BTBR anlamlı fark saptanmadı (n = 8) ve B6 (n = 7) gecikme BTBR zaman içinde belirgin bir azalma göstererek kazmak için o B6 kontrollerden (p = 0.001) davranışını görüntülemek için aldı.
Alt panel inchworming davranışının daralma aşamasında farelerin bir örnek ise Şekil 3,. Inchworming davranış her iki açıdan farklı farelerin örnekleri temsilidir. Üst panel, inchworming davranış uzatma aşamasında farelerin örneğidir . Inchworming önü içe ve senkron dışa doğru hareketi olarak tanımlanır ve yatak yerinden için fare arka kol ve bacakların edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inchworming örneğin ASD gibi stereotipileri sergileyen birçok bozuklukları incelemek için kullanılabilir tekrarlayıcı davranış yeni bir ölçüsüdür. Modifiye çocuk sosyal etkileşim protokolü güvenilir inchworming verilerin üretilmesi için kritik öneme sahip olan 4 adım vardır: 1) uzun süre izolasyon inchworming testi için gereklidir ve protokol kaldırılır ya da kısaltılmış olmamalıdır. Bu gereklilik, burada açıklanan çiftli inchworming test özgüdür. 2) uygun bir şekilde yer alan video kamera ve fareler, tam olarak tüm Plexiglas mahfaza boyunca görüntülenmiştir böylece odaklanması gerekmektedir. 3) muhafaza iyice akım davranışları farelerin önceki çiftinden kokular etkisinde emin olmak için test çiftleri arasında temizlenmesi gerekir. 4) muhafaza için yatak malzemesi yeterli olmalıdır (~ 1 inç derin) ve talaş olmalıdır; fareler az / hiç yatak veya zaman inchworming davranış göstermezdiğer yatak materyallerinin üzerine yerleştirilecek.
Burada tarif olmasa da, benzer bir kisilik muhafaza yalnız (yerine çiftleri daha) yerleştirilen izole olmayan, sosyal yer BTBR farelerde inchworming davranışlarını gözlemledim. Bu koşullar altında, BTBR fareler hala inchworm, ama daha düşük bir frekans ve süresi de, bu nedenle inchworming davranış, muhtemelen, sosyal anksiyete (veriler gösterilmemiştir) ile oluşturulan bir stereotipik davranış olduğunu göstermektedir. Ancak, çalışmalar güvenilir BTBR ve B6 kontrol fareler arasında anksiyete farklılıkları göstermek için başarısız olduğu göz önüne alındığında, anksiyete olasılıkla bu davranışı 12 uyardığı diğer faktörler ile etkileşim olduğunu. Bu BTBR ve B6 fareler arasında dramatik farklılıklar ile, hızlı ve güvenilir davranışı ortaya çıkarır Ancak, bu metodolojik makalenin odak noktası çocuk sosyal etkileşim protokolüne standart değişiklik oldu. Buna ek olarak, veri böylece bilgilendirmek artırarak, tek oturumda iki hayvanlardan toplanantirme her test dönemi kazandı. Laboratuvarımızda, inchworming davranış yalnızca P35-P55 yaş aralığında teyit edilmiştir. Farelerin genç ve yaşlı bu yineleyici davranış gösterecektir ki mümkün olsa da, diğer yaşlarda inchworming tanımlamak için başarısızlık davranış ergen ve genç yetişkin farelere özgü olduğunu gösteriyor olabilir.
Bu deneyden elde edilen veriler, fare suşu BTBR daha sık ve B6, kontrol grubuna göre daha uzun süreler için, daha hızlı bir şekilde tekrarlayan inchworming davranış yürütmektedir olduğunu açık bir şekilde göstermektedir. Inchworming davranış nedenle tekrarlayan diğer ASD davranışları ve hastalık modellerinde yeni bir ölçü ile araştırmacılara sağlayabilir. Bu tekrarlayan kazma hareketi neyin henüz belli olmasa da, BTBR fareler aynı zamanda kendini tımar ve sosyal kaçınma 1, 9 yüksek seviyelerini görüntüleyebilir. Kazma farelerde bir doğal genetik olarak düzenlenmiş bir özellik olduğu için, inchworming davranış testi be diğer suşlara kolaylıkla uygulanabilen ve diğer hastalık modellerinde motor stereotipileri ve kompulsif davranışları değerlendirmek için değerli bir araç olma potansiyeline sahiptir.
ASD karakterize damgasını davranışsal özelliklerinden biri kısıtlanmış ilgi 9 ile tekrarlayan davranıştır. Değerli bir motorlu Stereotipi vurgulayarak ek olarak, bu deney ASD hastalarında motor sterotiplerin klinik benzer bir ek yineleyici davranış göstererek ASD BTBR fare modelinin geçerliliğini artmıştır. Davranış B6 farelerde nispeten nadir olmasına rağmen Inchworming, BTBR (ASD) fareler ve B6 kontrol farelerinde hem de gösterilir. En yakından inchworming benzeyen davranışı kemirgenlerde davranışları kazma. Thomas ve ark. 4 kemirgenler için, kazma gıda depolama, yırtıcı kaçırma ve caydırıcı ortamlardan korunması da dahil olmak üzere çeşitli fonksiyonları hizmet ettiğini göstermektedir. Bu işlevler yerde sınıflandırılmamış değil gibiaçıklı laboratuvar ortamında, kazma davranış yüksek düzeylerde fareler bir kompulsif davranış ihtiyacı 4 yerine olabilir. Ayrıca, Silverman ve ark. 9 kazma davranışı olmayan sosyal aktivitenin bir ölçüsü olarak çocuk sosyal etkileşim testi analiz içine dahil edilmesi gerektiğini göstermektedir.
Özet olarak, inchworming B6 farelerinin (kontrol suşu) ile karşılaştırıldığında BTBR farelerde önemli ölçüde daha yaygın bir çok tekrarlanan davranışı (ASD bir modeli). Davranış etyolojisi halen bilinmemekle birlikte, birçok hastalığın kemirgen modellerinde compulsivity ve tekrarı incelenmesi araştırmacılar için değerli bir kaynak olabilir. Prosedürel teknikler basit ve 24 saatlik bir süre içinde kolaylıkla tamamlanabilir. Veri analizi daha karmaşık ve zaman alıcıdır, ancak test prosedürü video kaydı araştırmacı off-line analizi tamamlamak ve arkaya hakemlerarası tutarlılığı sağlamak için izin verir vegüvenilirlik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar Gül Tobias, Younghee Ahn, ve David N. Ruskin tarafından sağlanan teknik ve lojistik destek ve uzmanlık için minnettarız. Burada anlatılan çalışma Alberta Çocuk Hastanesi Vakfı ve Alberta Çocuk Hastanesi Araştırma Enstitüsü tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 cm X 30 cm Plexiglas box with lid | Can be constructed | ||
| IR Camera | Survshop (Calgary, Alberta) | Sony CCD Camera DP955V- 30’ Infrared Armor Dome | Find a camera with high-resolution and zoom capabilities |
| DVR | Supercircuits (Austin, Texas) | BLACK Enterprise-Class 4-Channel H.264 security DVR with DVD Burner | High data capacity |
| Sawdust | Same as bedding material |
References
- McFarlane, H. G., Kusek, G. K., Yan, M., Phoenix, J. L., Bolivar, V. J., Crawley, J. N. Autism-like behavioral phenotypes in BTBR T+tf/J mice. Genes, Brain, and Behavior. 7, 152-163 (2008).
- Crawley, J. N. Designing mouse behavioral tasks relevant to autistic-like behaviors. Mental Retardation and Developmental Disabilities Research Reviews. 10 (4), 248-258 (2004).
- Deacon, R. Digging and marble burying in mice: simple methods for in vivo identification of biological impacts. Nature Protocols. 1 (1), 122-124 (2006).
- Thomas, A., Burant, A., Bui, N., Graham, D., Yuva-Paylor, L. A., Paylor, R. Marble burying reflects a repetitive and perseverative behavior more than novelty-induced anxiety. Psychopharmacology. 204, 361-373 (2009).
- Dudek, B. C., Adams, N., Boice, R., Abbott, M. E. Genetic influences on digging behaviours in mice (Mus musculus) in laboratory and seminatural settings. Journal of Comparative Psychology. 97 (3), 249-259 (1983).
- Webster, D., Williams, M. H., Owens, R., Geiger, V., Dewsbury, D. A. Digging behavior in 12 taxa of muriod rodents. Animal Learning and Behavior. 9 (2), 173-177 (1981).
- Pobbe, R. H., Pearson, B. L., Defensor, E., Bolivar, V. J., Blanchard, D. C., Blanchard, R. J. Expression of social behaviours of C57BL/6J versus BTBR inbred mouse strains in the visible burrow system. Behavioural Brain Research. 214, 443-449 (2010).
- Lewis, M. H., Tanimura, Y., Lee, L., Bodfish, J. Animal models of restricted repetitive behavior in autism. Behavioural Brain Research. 176, 66-74 (2007).
- Silverman, J. L., Yang, M., Lord, C., Crawley, J. N. Behavioural phenotyping assays for mouse models of autism. Nature Reviews. 11, 490-502 (2010).
- Deacon, R., Rawlins, J. Hippocampal lesions, species-typical behaviours and anxiety in mice. Behavioural Brain Research. 156, 241-249 (2005).
- Pearson, B. L., et al. Motor and cognitive sterotypies in the BTBR T+tf/J mouse model of autism. Genes, Brain, and Behavior. 10, 228-235 (2011).
- Pobbe, R. H., Defensor, E., Pearson, B. L., Bolivar, V. J., Blanchard, D. C., Blanchard, R. J. General and social anxiety in the BTBR T+ tf/J mouse strain. Behavioural Brain Research. 216 (1), 446-451 (2011).
