Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

العزلة والثقافة، والتصوير من الجنين البنكرياس الإنسان الكتل الخليوي

Published: May 18, 2014 doi: 10.3791/50796
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Pediatric Diabetes Research Center, Department of Pediatrics, University of California, San Diego

Summary

بروتوكول لعزل، وصفت مجموعات والثقافة، وصورة الخلية جزيرة (ICCS) مشتقة من خلايا البنكرياس الجنين البشري. تفاصيل أسلوب الخطوات اللازمة لتوليد ICCS من الأنسجة والثقافة والطبقات الوحيدة أو في التعليق كما المجاميع، وصورة لعلامات الانتشار والبنكرياس القرارات مصير الخلية.

Abstract

لما يقرب من 30 عاما، وقد أثبتت العلماء أن الجنين ICCS البشرية المزروعة تحت كبسولة الكلى من الفئران عارية نضجت في أداء خلايا الغدد الصماء، كما يتضح من زيادة كبيرة في تعميم الإنسان C-الببتيد التالية التحفيز الجلوكوز 1-9. ولكن في المختبر، نشأة الخلايا المنتجة للانسولين من ICCS الجنين البشري هو انخفاض 10؛ النتائج تذكرنا التجارب الأخيرة أجريت مع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (HESC)، مصدر متجدد للخلايا التي تحمل وعودا كبيرة كعلاج العلاجية المحتملة لمرض السكري نوع 1. مثل ICCS، زرع HESC متباينة جزئيا توليد استجابة الجلوكوز والأنسولين الخلايا المنتجة، ولكن في نشأة المختبر من الخلايا المنتجة للانسولين من HESC هو أقل قوة بكثير 11-17. وهناك فهم كامل للعوامل التي تؤثر على نمو وتمايز الخلايا السلائف الغدد الصماء المرجح تتطلب ولدت البيانات من كلا ICCS وسعادةSC. في حين أن عددا من البروتوكولات الموجودة لتوليد خلايا انتاج الانسولين من HESC في المختبر 11-22، وجود عدد أقل بكثير لICCS 10،23،24. من المرجح أن يأتي جزء من التناقض من صعوبة العمل مع البنكرياس الجنين البشري. وتحقيقا لهذه الغاية، فقد واصلنا الاعتماد على الأساليب القائمة لعزل الجزر الجنين من بنكرياس الإنسان مع الأعمار الحمل تتراوح بين 12 إلى 23 أسبوعا، وتنمو الخلايا كما أحادي الطبقة أو في التعليق، والصورة لتكاثر الخلايا، وعلامات البنكرياس والهرمونات البشرية بما في ذلك الجلوكاجون وC-الببتيد. ICCS التي تم إنشاؤها بواسطة بروتوكول موضح أدناه النتيجة في الافراج C-الببتيد بعد زرع الكلى تحت الكبسولة من الفئران عارية التي تشبه إلى مستويات C-الببتيد التي حصلت عليها من زرع أنسجة جديدة 6. على الرغم من أن الأمثلة المعروضة هنا التركيز على انتشار الأديم الباطن والبنكرياس β نشأة الخلية، بروتوكول يمكن استخدامها لدراسة الجوانب الأخرى للتنمية البنكرياس، بما في ذلك إفرازات، الأقنية، والخلايا المنتجة للهرمون الأخرى.

Introduction

ومن القيود الأساسية للأنسولين علاجات استبدال خلية القاعدة في مرض السكري نوع 1 هو ندرة الجزر البشرية المتاحة للزرع. القدرة على تنظيم انتشار وتمايز الخلايا السلائف البنكرياس الإنسان إلى خلايا منتجة للأنسولين التي تلبي متطلبات التمثيل الغذائي للدولة على الأنسولين ناقصة لا يزال لبنة حاسمة لعلاج خلية مقرها لعلاج داء السكري من النوع 1.

حتى كان ينظر ظهور الخلايا المنتجة للانسولين HESC مشتقة، خلايا الغدد الصماء في البنكرياس الجنين البشري أو سلائفها كمصادر محتملة من الخلايا للزرع السريرية. على الرغم من أن المشهد العلمية والتنظيمية قد تغيرت في السنوات القليلة الماضية، لا تزال هناك حاجة حيوية لفهم كيفية تطور البنكرياس الجنين البشري. العديد من الآن عرض الاستخدام العلاجي للخلايا الجنينية البشرية من غير المحتمل، ولكن إذا تم إنشاء طرق فعالة وآمنة لتوسيع الخلايا، واستخدام العلاجية لهذه الخلايا يمكن AGعين يكتشفها. وهناك عقبة رئيسية ما تبقى هو أن التحول في المختبر من خلايا البنكرياس الإنسان الجنين المجاميع (ICCS) إلى جلوكوز استجابة، الأنسولين إفراز خلايا الغدد الصماء في الوقت الراهن عملية غير فعالة. على الرغم من أن هناك الكثير من العمل على مدى 30 عاما تقريبا وقد أوضحت وحددت الشخصى التعبير عن عوامل النسخ المطلوبة لتطوير البنكرياس الصماء، لا تزال هناك ثغرات في معرفتنا حول كيفية تنظيم التعبير الزماني للعوامل النسخ وتتعلق وظيفة الخلية.

حتى كان ينظر ظهور الخلايا المنتجة للانسولين HESC مشتقة، خلايا الغدد الصماء في البنكرياس الجنين البشري أو سلائفها كمصادر محتملة من الخلايا للزرع السريرية. على الرغم من أن المشهد العلمية والتنظيمية قد تغيرت في السنوات القليلة الماضية، لا تزال هناك حاجة حيوية لفهم كيفية تطور البنكرياس الجنين البشري. العديد من الآن عرض الاستخدام العلاجي للخلايا الجنينية البشرية من غير المحتمل، ولكن إذا فعالةوطرق آمنة لتوسيع أنشئت الخلايا، يمكن مرة أخرى أن تستكشف استخدام العلاجي من هذه الخلايا. وهناك عقبة رئيسية ما تبقى هو أن التحول في المختبر من خلايا البنكرياس الإنسان الجنين المجاميع (ICCS) إلى جلوكوز استجابة، الأنسولين إفراز خلايا الغدد الصماء في الوقت الراهن عملية غير فعالة. على الرغم من أن هناك الكثير من العمل على مدى 30 عاما تقريبا وقد أوضحت وحددت الشخصى التعبير عن عوامل النسخ المطلوبة لتطوير البنكرياس الصماء، لا تزال هناك ثغرات في معرفتنا حول كيفية تنظيم التعبير الزماني للعوامل النسخ وتتعلق وظيفة الخلية.

في الآونة الأخيرة، في مجال الخلايا الجذعية استخدمت المعارف المتراكمة حول الزمانية عامل النسخ التعبير خلال تطوير جزيرة لدفع إنتاج الخلايا التي تعبر عن علامات من خلايا الغدد الصماء ناضجة. على الرغم من أن نشأة الخلايا المنتجة للانسولين من HESC والخلايا المحفزة (التوجيهية) جعلت كبيرة وتقدما كبيرا في السنوات القليلة الماضية، والبروتوكولات الأكثر فعالية تتطلب متميزتين مراحل تمايز: 1) والتمايز في وقت مبكر في المختبر لتوليد الخلايا معربا عن العوامل السلائف النسخ البنكرياس، تليها 2) في الجسم الحي النضج بعد زرع - وهو ما يسمى ب "الصندوق الأسود "الفترة. للمضي قدما، والتقدم في فهم بيولوجيا الكامنة نضوج جزيرة في الجسم الحي، بغض النظر عن مصدر الخلية، ويجب أن يفهم على مستوى البيوكيميائية. التشابه بين النتائج التي تم الحصول عليها مع ICCS وHESC تشير إلى أن عددا من العمليات الكيميائية الحيوية الحرجة التي تنظم عملية انتقال الخلايا السلائف البنكرياس الإنسان في، والأنسولين إفراز الخلايا تستجيب الجلوكوز ناضجة في المختبر لا تزال مجهولة. وهناك جزء أساسي من هذا الفهم أن يكون لتطوير منهجيات جديدة لاشتقاق السكان الخلية الغدد الصماء وظيفية من الخلايا الاصلية البنكرياس وسوف HESC تتطلب ليس فقط APPR البيوكيميائيةoaches أن إلقاء الضوء على الأحداث النضج، ولكن أساليب لتحليل التغييرات.

لماذا نعتقد أن التصوير خلايا البنكرياس الجنين البشري هو أحد الجوانب الحاسمة لتحديد التغيرات في جزيرة النضج؟ الجواب يكمن جزئيا في السعي التاريخية لتوليد الخلايا المنتجة للأنسولين. وقد سمحت كل من نموذج وأنظمة الأنسجة الثقافة لالسلائف البنكرياس والجزر الباحثين لاستكشاف الاختلافات الكبيرة الموجودة بين النضج من الجزر والجزر الصغيرة الحيوانية البشرية في المختبر. وجود قيود لاستكشاف التنمية البنكرياس الجنين البشري هو أن الأعمار الحمل التي يمكن استخدامها قانونيا تعطي فقط لارتفاع المجاميع الخلية غير المتجانسة. على الرغم من أن الخلايا البشرية الجنين معزولة تشبه الجزر، وتلطيخ بعد الثقافة في المختبر من سن 9-23 أسابيع الحمل يكشف أقل من 15٪ تحتوي على علامات لخلايا الغدد الصماء، مع معظم الخلايا لا تلطيخ للهرمونات جزيرة. ومع ذلك، بعد زرع وفيفو النضج، فإن أغلبية كبيرة من الخلايا التعبير عن علامات الغدد الصماء 6،25. ويجري ردد النتائج من هذه الدراسات اليوم مع بروتوكولات HESC التمايز التي هي قادرة على توليد السكان متواضعة من هرمون واحد خلايا الغدد الصماء إيجابية إلا بعد التمايز في المختبر. في المختبر طرق لتعزيز السكان من هرمون إيجابية الخلايا ومن المرجح أن توفر نظرة ثاقبة في الجسم الحي جزيرة النضج. علاوة على ذلك، فهم الأحداث الجزيئية التي تدفع التنمية البنكرياس الجنين البشري من المرجح أن تحسين الجهود لاستخلاص خلايا انتاج الانسولين من HESC ومزيد ترسيم الآليات التي تنظم تجديد الخلايا β وtransdifferentiation خلية البنكرياس.

أوجه التشابه بين الإنسان خلية البنكرياس الجنين وHESC النضج يمكن أن تمتد إلى وظيفة الخلية. مثل خلايا الفئران، سواء الخلايا الجنينية البشرية وHESC متباينة غير قادر على إفراز الأنسولين استجابة إلى جلوكوزبعد neoformation جزيرة في المختبر 26،27. ومع ذلك، عند زرع في الفئران عارية والنضج، سواء مجموعات مثل جزيرة البشرية والخلايا المنتجة للأنسولين المستمدة من HESC المعرض النمط الظاهري الغدد الصماء. بعد ثلاثة أشهر التطعيم، ما يقرب من 90٪ من الخلايا التي تم زرعها من السكان هم من الأنسولين إما إيجابية، وتعمل بشكل طبيعي على النحو الذي يحدده إطلاق سراح C-الببتيد 17،26. هذه النتائج تشير إلى أن زرع مجهولون توفر السياق والعظة التي تعزز جزيرة النضج. بروتوكولات التصوير الأمثل، مثل واحد هو موضح هنا، لخلايا البنكرياس الجنين الإنسان سوف تساعد في البحث لتحديد العوامل التي تعدل وتسريع النضج. استكشاف البيوكيميائية الأساسية للخلايا البنكرياس الجنين البشري وHESC متباينة نحو النسب الغدد الصماء في هذه المرحلة من التنمية أمر أساسي لقياس كفاءة النضج.

بروتوكول التالية، الواردة في الارقام ..ه 1، ويوفر أسلوبنا الحالي لعزل خلايا البنكرياس الجنين البشري، ودعا ICCS من البنكرياس كله الجنين البشري والتصوير من هذه الخلايا. هذا البروتوكول يتطلب الإعداد الأولي من الخلايا من الأنسجة، والتي يمكن زراعتها في وقت لاحق كما أحادي الطبقة أو في التعليق. يوصف إعداد الخلايا لتصوير علامات تستخدم عادة من الغدد الصماء تكاثر الخلايا والنضج.

جيل والتصوير من ICCS في غياب أو وجود مجموعة متنوعة من العوامل الكيميائية تعديل يوفر طريقة سريعة، مقارنة مع نماذج زرع، للمساعدة في تحديد الشروط الثقافة والمركبات التي تسريع نضوج خلايا البنكرياس الجنين البشري في إفرازات تعمل بكامل طاقتها، الأقنية، أو هرمون إنتاج خلايا البنكرياس.

Protocol

تلاحظ قبل بدء:

  1. تم الحصول على بنكرياسات الجنين البشري من العيوب الخلقية مختبر أبحاث، جامعة واشنطن (سياتل، واشنطن، الولايات المتحدة الأمريكية) الذين حصدوا الأنسجة. تم الحصول على الموافقة المستنيرة للتبرع الأنسجة، والتخزين، واستخدام عينات من الجهات المانحة من قبل المركز. وقدم البيان موافقة البروتوكول في الكتابة وجامعة كاليفورنيا، سان دييغو وافق برنامج حماية البحوث الإنسانية دراسة كاملة (بروتوكول 081237XT #).
  2. فمن الضروري للحفاظ على كل من البنكرياس الجنين البشري والحاوية عقد البنكرياس على الجليد خلال الإجراء بأكمله. يجب أن يتم تنفيذ التفكك والهضم في أسرع وقت ممكن.
  3. إرسال العيادة حيث تم الحصول على البنكرياس الجنين البشري من المخزن المؤقت لتخزين ونقل البنكرياس. (RPMI-1640 + 10٪ مصل الإنسان العادي (NHS)، 300 ملي طرهالوز سان جرمان، البنسلين / الستربتوميسين، وfungizone).

1. تشريح الجنين بنكرياس الإنسان

  1. 5 ملغ من حل RT كولاجيناز الحادي عشر في HBSS لإعطاء تركيز النهائي من 2.5 ملغ / مل. تصفية تعقيم الحل مع فلتر حقنة 0.22 ميكرون إلى العقيمة (تعقيمها) قارورة التلألؤ وتخزينها في 4 درجات مئوية. في نسيج الثقافة هود، المبينة 2 أطباق بتري معقمة، بوتقة صغيرة معقمة (إذا بوتقة غير متوفر، قد تكون بديلا كوب صغير)، مقص تعقيمها، وملقط. إضافة 2 مل HBSS إلى واحدة طبق بتري لغسل البنكرياس. السائل نضح من الأنبوب الذي يحتوي على البنكرياس الجنين، وترك حوالي 1 مل.
  2. إزالة البنكرياس مع ملقط في طبق بتري 60 ملم دون HBSS. لهذه التجارب، يتم إنشاء ICCS الجنين من بنكرياسات جديدة مع الأعمار الحمل تتراوح 9-23 أسابيع. بمعزل عن بنكرياسات في سن gestionational في وقت سابق من الصعب نظرا لحجم البنكرياس. البروتوكول ينطبق المرجح أن تتجاوز الأعمار الحمل 23 أسبوعا، ولكن اكتساب عancreata بعد هذا الوقت صعب بسبب الفيدرالية (الولايات المتحدة) القيود. في بعض الأحيان، البنكرياس الجنين مع وصول الطحال، والدهون، أو الأنسجة الضامة المرفق من تشريح الأصلي. النسيج اضافية مرئيا بسهولة بالعين المجردة، وينبغي إزالتها من البنكرياس قبل البدء في البروتوكول.
  3. شطف البنكرياس في حجم الحد الأدنى من HBSS الباردة (~ 0.5 مل) في طبق بتري.
  4. نقل البنكرياس تنظيفها إلى بوتقة صغيرة معقمة باستخدام ملقط معقم ووضعه في دلو الجليد. وضع في بوتقة حامل ل50 مل أنبوب الطرد المركزي و، وذلك باستخدام 2 أزواج من مقص، شريحة بقوة البنكرياس لعدة دقائق. (عادة 2-5 دقيقة، ولكن والوقت يعتمد على حجم ومتانة النسيج). تقنية القطع هو المهم. عقد جانب واحد من مقص في موقف ثابت تتحرك فقط مقابض المعاكس. يجب على نصائح من مقص راحة على الجزء السفلي من بوتقة. تواصل مع الحركة السريعة مقص لكسر في البنكرياس الصغيرةقطعة. أصغر قطعة من النسيج، وأفضل كولاجيناز ستعمل.
  5. إضافة 1.5 مل من HBSS + البنكرياس المفروم حتى القارورة التي تحتوي على كولاجيناز والمكان في مجموعة شاكر حمام المياه إلى 37 درجة مئوية في 200 دورة في الدقيقة لمدة تصل إلى 10 دقيقة. لا تحقق بشكل متكرر أكثر من مرة واحدة خلال أول 5 دقائق. الوقت الهضم يعتمد على نوعية الأنسجة، قد يكون اقل من 6 دقائق كافية. نقطة النهاية هو عندما جزيئات صغيرة وموحدة.
  6. ملء قارورة (10-15 مل) مع HBSS الباردة لوقف النشاط كولاجيناز. وضع على الجليد والسماح للكتل لتسوية لمدة 10 دقيقة. في كثير من الأحيان في هذه المرحلة، وقد وقعت بعض موت الخلايا ويتم تحريرها الحمض النووي في وسائل الإعلام. هذا يمكن أن يجعل وسائل الإعلام "مفتول العضلات"؛ في هذه الحالة، إضافة 100 ميكرولتر الدناز (10 ملغ / مل الأسهم) إلى الحل.
  7. بعد أن استقر الأنسجة في قارورة التلألؤ لمدة 10 دقيقة، نضح قبالة الطبقة العليا تركها أقل قليلا من نصف كامل (7-8 مل). نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل، إضافة 5 مل HBSS. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 × ز.
  8. نضح HBSS و resuspend الخلايا في 5 مل تحتوي على وسائل الاعلام RPMI-1640، glutamax، و 10٪ مصل الإنسان العادي (NHS)، 10 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.2، البنسلين / الستربتوميسين، وfungizone. لوحة على 60 مم طبق بتري. للباحثين في محاولة لتوليد خلايا β، إضافة HGF (10 نانوغرام / مل النهائي) إلى وسائل الإعلام. بالإضافة إلى ذلك، تظاهر عدد من المجموعات التي المكمل وسائل الإعلام والثقافة مع هرمون GLP-1 incretin يزيد أيضا خلايا β 28. ينبغي أن تترك الخلايا في التعليق لمدة 72 ساعة لتجميع وتشكيل ICCS.
  9. بعد 72 ساعة في التعليق، والخلايا يمكن مطلي على مصفوفة من خط الخلية البشرية HTB9 المصفوفة كما هو موضح سابقا 29. بغض النظر عن ظروف النمو، وسائل الإعلام يجب أن يتم تغيير كل 48 ساعة.

2. المناعي للعلامات من الغدد الصماء انتشار الخليوي ونضوج في ICCS يزرع في التعليق، أحادي الطبقة، أو على coverslips الزجاج

  1. لقياس تكاثر الخلايا، يتم تنفيذ وضع العلامات BrdU إما الخلايا الملتصقة أو خلايا في تعليق لمدة 12 ساعة قبل PFA التثبيت. يتم تخفيف BrdU كاشف 1:100 وتصفية تعقيمها في RPMI-1640، glutamax، 10٪ NHS، 10 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.0، البنسلين / الستربتوميسين، وfungizone.
  2. للخلايا في التعليق: الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 x ج ونضح مستنبت. إضافة 10 مل PBS لغسل ICCS، أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 x ج ونضح. إذا كان ICCS ستكون جزءا لا يتجزأ من البارافين، يرجى اتباع البروتوكول الاختياري ل3،1-3،17 الخلايا الملتصقة: إزالة مستنبت وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح أعلاه. إصلاح الخلايا لمدة 20 دقيقة مع PFA 4٪ على RT، ثم يغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني. عند هذه النقطة، لوحات يمكن أن تكون ملفوفة مع parafilm وتخزينها في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع.
  3. احتضان الخلايا مع 0.2٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في RT. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني وتطبيق حظر مؤقت (2٪ تفعلn والمصل، 2٪ ألبومين المصل البقري، و 50 ملي جليكاين المخفف في برنامج تلفزيوني) لمدة 1 ساعة. غسل الخلايا مع العازلة العامل (حظر مؤقت المخفف 1:10). تمييع الضد العازلة في العمل. للخلايا المزروعة في coverslips الزجاج، ويخفف من الأجسام المضادة في 60 ميكرولتر اجمالى حجم. للخلايا في طبق 6 جيدا، وتمييع الضد في الحجم الكلي 600 ميكرولتر. وصمة عار الحواتم متعددة، مزيج من الأجسام المضادة يمكن تطبيقها. كعنصر تحكم، استخدم مفتش أو المصل المناعي قبل بدلا من الأجسام المضادة المحددة. يجب حضنت العينات التحكم مع التحكم مفتش من نفس الأنواع من الأجسام المضادة الأولية المستخدمة.
  4. احتضان الأجسام المضادة الأولية إما 1.5 ساعة على RT أو O / N عند 4 درجة مئوية. نضح الأجسام المضادة الأولية وغسل 3X مع العازلة العامل في RT.
  5. تمييع الضد الثانوية في 1:200 لرودامين وFITC الأجسام المضادة مترافق، 1:500 - 1:1،000 عن الأجسام المضادة مترافق اليكسا. من المهم أن نلاحظ أن جميع الأجسام المضادة الثانوية خفيفة حساسة. تغطية العيناتفي رقائق الألومنيوم لمنع فقدان الإشارة. احتضان لمدة 1 ساعة على RT.
    اختياري: لتصور نوى، دابي ويمكن أن يضاف في 1:500 خلال الحضانة الثانوية. وهذا مفيد لتحديد الكميات من البروتين التعبير في مجموع السكان الخلية.
  6. نضح الضد الثانوية وغسل 3X مع العازلة العامل في RT. للخلايا المزروعة في ساترة، ورفع بلطف ساترة مع ملقط بينما مغمورة في المخزن المؤقت؛ غسله بواسطة تخبط في برنامج تلفزيوني. للخلايا تزرع في لوحة 6 جيدا، إضافة PBS لغسل ونضح. عند هذه النقطة انهم مستعدون لدراسة تحت مجهر مقلوب.
  7. تلمس حافة ساترة بلطف على Kimwipe للتخلص من برنامج تلفزيوني الزائدة. إضافة قطرة من تصاعد الجل على شريحة زجاجية وعكس ساترة على الشريحة. إزالة الزائدة هلام التركيب بواسطة الشفط. اضغط على ساترة بلطف مع الجزء الخلفي من غيض 200 ميكرولتر الماصة لإزالة الفقاعات.
  8. الجاف في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة أو O / N عند 4 ° C ودراسة تحت فلوريداuorescent أو المجهر متحد البؤر.

3. (اختياري) مناعي تلطيخ من البروتينات من البارافين جزءا لا يتجزأ من ICCS

  1. إعداد الحل الاغاروز 3٪ والسماح لتبرد إلى 55-60 درجة مئوية.
  2. نقل ICCS المحتضنة في التعليق إلى أنبوب مخروطي 15 مل، وأجهزة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. نضح وسائل الإعلام من الخلايا وإصلاح مع 500 ميكرولتر PFA 4٪ لمدة 10 دقيقة في RT. لا تخلط بيليه، إلا إذا كان بيليه هو كبير جدا.
  4. يغسل بيليه مرتين مع 750 ميكرولتر PBS. مثل PFA 4٪، وتعتبر هذه النفايات الخطرة ويجب التخلص من المواصفات وفقا لمؤسستكم النفايات الخطرة.
  5. نفض الغبار بلطف بيليه الخلية لتخفيف وإضافة 150-200 ميكرولتر من الاغاروز أسفل جدار أنبوب 15 مل المخروطية.
  6. مزيج من قبل عبها بلطف الأنبوب، ولكن لا تشكل الفقاعات.
  7. السماح ليصلب في 4 درجات مئوية لمدة 5-10 دقيقة.
  8. استخدام إبرة 21 G لطردبيليه ومكان في أنبوب 15 مل المخروطية الطازجة.
  9. ويمكن أن يتم تضمين البارافين وإعداد المقاطع على الشرائح في الموقع باستخدام مشراح أو عن طريق الفحص المجهري مرافق الأساسية الخاصة بك.
  10. Deparaffinize الأنسجة، وهيدرات، ويغسل بالماء بسرعة.
  11. إضافة 0.2 M جليكاين لمدة 30 دقيقة في RT لإرواء ألدهيد المتبقية.
  12. غسل الشريحة مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 2 دقيقة لكل منهما.
  13. لاسترجاع مستضد، وجلب 10 ملي السيترات العازلة (درجة الحموضة 6.0) لتغلي على طبق ساخن. تزج الشرائح في المخزن المؤقت، انتظر حتى أعود ليغلي، والانتظار لمدة 15 دقيقة.
  14. إزالة كوب من موقد. انتظر حوالي 40 دقيقة للالشرائح لتبرد في المخزن المؤقت.
  15. تغسل الشرائح مرتين مع H 2 O لمدة 5 دقائق لكل منهما، غسل الشرائح مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما، منع مع 2٪ مصل حمار عادي في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة.
  16. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية المخففة التركيز الصحيح في مخزن العامل تحتوي على 0.2٪ تريتون X-100.عموما، وحضنت الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها إذا تلطيخ لعوامل النسخ وعن 1.5 ساعة إذا تلطيخ للهرمونات، وعلامات الانتشار، و / أو التمايز.
  17. اتبع الخطوات من 2،3-2،9 المذكورة أعلاه.

Representative Results

التحضير المتأني للICCS الجنين أمر بالغ الأهمية لنجاح هذا البروتوكول. وتظهر الصور ممثل كيف تبدو الخلايا عادة في فترات محددة بعد الطلاء في الشكل 2. بعد تنقية، تظهر المجاميع الخلية مطلي حديثا، والتكتلات واضحة متفرق الصغيرة والتي تحتوي على عدد قليل من الخلايا (الشكل 2A). بعد ساعة ال 24 الأولى (الشكل 2B)، فإن العديد من مجموعات الخلايا تصبح أكبر، ولكن لا تزال العديد من المجموعات الصغيرة. قبل 48 ساعة، وسعت المجموعات بشكل ملحوظ، ولكن لا تزال غير المتكافئة (الشكل 2C). في 72 ساعة، يجب أن تكون واضحة ICCS، موحدة نسبيا في الحجم والشكل (الشكل 2D). هو في هذه المرحلة أن الخلايا يمكن مطلي إما على المصفوفات، مثل HTB-9، لمدة 24 ساعة قبل المناعي أو السماح لتنمو لمدة 72 ساعة أخرى في غياب أو وجود مواد كيميائية أو الأدوية التي قد يغير التعبير عن الجينات المطلوبة لخلية البنكرياس الصماء زeneration الشكل 3 يسلط الضوء على عدد من الأجسام المضادة تستخدم عادة لتقييم إما الانتشار المحكمة الجنائية الدولية أو تمايز الأديم الباطن نحو البنكرياس. في الشكل 3A، كانت مطلية ICCS على HTB-9، ونمت لمدة 4 أيام، وملون لPDX1، علامة حاسمة للتنمية البنكرياس. على الرغم من أن في المختبر تلطيخ ICCS تتم بشكل روتيني في المختبر لدينا، في كثير من الأحيان، يتم زرع الجنين ICCS الإنسان تحت كبسولة الكلى من الفئران عارية وسمحت لتتكاثر والتفريق في الجسم الحي 6،9،30-32. في أوقات محددة بعد الزرع، يتم التضحية الفئران وتتم إزالة الكلى المزروعة التي تحتوي على ICCS، ثابتة في بارافورمالدهيد 4٪، وجزءا لا يتجزأ من البارافين. يتم إنشاء أقسام متسلسلة 5 ميكرون إما على الموقع باستخدام مشراح أو منشأة المجهري الأساسية. يوصف فضح حاتمة وتلطيخ البروتينات من البارافين جزءا لا يتجزأ من النسيج لمناعي المجهري في البروتوكول الاختياري 3،10-3.17 في الشكل 3B، كانت ملطخة ICCS زرعها مع علامة الخلية الظهارية عموم cytokeratin (PanCK؛ الأخضر) ومع Ki67 (أحمر) لتقييم تكاثر الخلايا. في مثال آخر، تم الكشف عن كل من الأنسولين البشري (الخضراء) والجلوكاجون (الحمراء) بعد زرع والنضج تحت كبسولة الكلى من الماوس عارية (الشكل 3C).

الشكل 1
الشكل 1. تدفق الرسم البياني إعداد ICC الجنين الإنسان وتلطيخ للالمناعي.

الرقم 2
الشكل 2. إعداد ICCS الجنين الممثل في 0، 24، 48، أو 72 ساعة بعد الطلاء. (A) ICCSفي تعليق تم تصوير مباشرة بعد الطلاء، (B) 24 ساعة بعد الطلاء، ساعة (C) 48 بعد الطلاء، أو (D) 72 ساعة بعد الطلاء. شريط النطاق لميلان، 10X التكبير = 300 ميكرون، شريط النطاق لD، 20 التكبير = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
. الرقم 3 المناعي من ICCS مطلي بشكل روتيني، يتم تصوير ICCS ل(أ) PDX1 البنكرياس الأديم الباطن علامة (الأخضر)، (B) خلايا الغدد الصماء (عموم CK؛ الأخضر) وانتشار (Ki67، أحمر)، (C) الانسولين (الأخضر) والجلوكاجون (الحمراء). شريط النطاق لميلان، 40X التكبير = 20 ميكرون.

Discussion

الأساليب المعروضة هنا تمكن واحد لتوليد ICCS من البنكرياس الجنين البشري، وبعد ذلك صورة لعلامات من تكاثر الخلايا والأديم الباطن البنكرياس. عملية البنكرياس الجنين البشري تفارق المطلوبة حوالي 90 دقيقة، تليها فترة تشكيل المحكمة الجنائية الدولية 72 ساعة، وهو نهج يختلف كثيرا عن البروتوكولات لعزل الخلايا الاصلية الخلايا β من الماوس. بروتوكول المعروضة هنا يوفر طريقة استنساخه التي تسمح للباحث لاستكشاف التنمية البنكرياس الجنين البشري. نوعين مختلفين من الدراسات الطولية يمكن أن يؤديها. أولا، القدرة على توليد أنواع وظيفية البنكرياس خلية (خلايا الأقنية، الخلايا الإفرازية وخلايا إيجابية هرمون) من مختلف الأعمار الحمل يمكن تقييمها بعد الزرع. الثانية، ICCS من العمر الحملي واحد يمكن زراعتها في الثقافة، وتعامل مع وكلاء الدوائية المختارة والمزروعة في نقاط زمنية مختلفة خلال ثقافة المحكمة الجنائية الدولية لاستكشاف الاختلافاتفي مصير الخلية. مع الجهود الهائلة التي توجه حاليا في HESC التمايز إلى خلايا انتاج الانسولين، ومرة ​​أخرى يجري إحياؤها المشاكل المرتبطة إفراز الأنسولين استجابة للمؤثرات الفسيولوجية. توفير ICCS الإنسان نظام نموذجا فريدا لدراسة هذا الجانب الهام من البنكرياس الجنين تكاثر الخلايا ونمو الخلايا β.

كما هو الحال مع أي بروتوكول لعزل الخلايا من الأنسجة، والتفاصيل هي الحاسمة للنجاح. وهناك عدد من المعلمات للأسف خارج سيطرة العاملين في المختبرات أداء التجربة. اثنين من المشاكل التي واجهت هذا المختبر تشمل رداءة نوعية المواد الانطلاق والتسليم من الأنسجة غير البنكرياس. نسيج البنكرياس الجنين صحية ثابتة لخفض مقص. إذا كانت التخفيضات الأنسجة بسهولة جدا، بل هو علامة على أن أنزيمات البنكرياس قد بدأت لهضم البنكرياس نفسها. من هذا هناك للأسف هناك انتعاش وأفضل إلغاء الإعداد. نادرا، وهو فيسوف فني من ذوي الخبرة إزالة البنكرياس الخلط بين أقسام القناة الهضمية للالبنكرياس. وهذه العينات لديها مرونة أكثر من ذلك بكثير من البنكرياس وسوف التجويف ملحوظ تكون موجودة. مرة أخرى، يجب التخلص من هذه العينات.

عند اتباع البروتوكول كما هو موضح أعلاه، هناك نادرا أي القضايا التي تنشأ لرمي العزلة عن مسارها. وتشمل بضع نقاط لنتذكر لضمان عزلة على نحو سلس، لاستخدام مقص حاد لقطع البنكرياس دقيقة وللتأكد من عدم ترك أي عينة الأنسجة كبيرة جدا لهضم. إذا التخفيضات ليست صغيرة بما فيه الكفاية، ثم كولاجيناز لا يعمل على نحو فعال، وتتشكل القليلة ICCS. على العكس من ذلك، عند استخدام دفعة جديدة من كولاجيناز، وتبدأ مع مستوى مماثل إذا وحدة دولية (وحدة دولية) لعملية الهضم كما تستخدم في السابق. ومع ذلك، خفض فترة حضانة لضمان أن ما يزيد على الهضم لا يحدث. هذه التقنية استكشاف الأخطاء وإصلاحها يضمن أن تسمية وحدة دولية لا تختلف اختلافا كبيرا من دفعة لدرجة البكالوريوسطشه.

التي اتخذت في المنظور، هذه التقنية لعزل ICCS الجنين البشري هو المعيار نسبيا في هذا المجال. وأكد معظم المختبرات النتائج التي توصلنا إليها أن إضافة HGF إلى وسائل الإعلام يساعد الخلايا على البقاء والتكاثر 33. باختصار، قمنا بتطوير طريقة لعزل ICCS الجنين البشري بنكرياسات جديدة مع الأعمار الحمل تتراوح 9-23 أسابيع. يمكن زراعتها الخلايا كما أحادي الطبقة أو في تعليق للتجارب لتصور عوامل النسخ الغدد الصماء في البنكرياس والأنسولين البشري.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل معهد كاليفورنيا للطب التجديدي (RB3-02266) والمعاهد الوطنية للصحة (DK54441).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trehalose SG Hayashibara Trehalose SG
Collagenase XI  Sigma C-9407
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) Life Technologies 24020-117
RPMI 1640 with glutamate Life Technologies 11879020 no glucose or HEPES
Human AB Sera, Male Donors Omega Scientific HS-30
Fungizone Life Technologies 15290018
Gentamicin Solution 50 mg/ml Invitrogen 15750060
1 M Hepes, pH 7.0 Life Technologies 15630080
Penicillin/streptomycin 100x solution Life Technologies 15070063
Glutamax Life Technologies 35050061
Hepatocyte Growth Factor (HGF) Peprotech 100-39
GLP-1 Peprotech 130-08
Fetal Bovine Serum Invitrogen 16000-044
Dnase Sigma DN25
Sterile Petri dishes, 60 x 15 mm; stackable, venting ribs Spectrum Laboratory Products, Inc. D210-13
PBS Gibco 14190
16% PFA Electron Microscopy Sciences 15710
Triton X-100 Sigma T9284
Donkey Serum Jackson ImmunoResearch 017-000-121
BrdU Life Technologies 00-0103
anti-insulin (mouse monclonal; 1:1,000) Sigma I2018
anti-glucagon (mouse monoclonal; 1:2,000) Sigma G2654
PDX1 (mouse monoclonal) Novus Biologicals NBP1-47910
PDX1 (goat polyclonal) AbCam 47383
PDX1 (rabbit polyclonal) AbCam 47267
Alexa Fluor 546 (rabbit) Invitrogen A11010
Alexa Fluor 546 (mouse) Invitrogen A11003
Alexa Fluor 488 (rabbit) Invitrogen A11008
Alexa Fluor 488 (mouse) Invitrogen A11001
Ki67 Lab Vision Neomarkers RM 9016-50
pan-CK (mouse monoclonal; 1:100) Immunotech 2128
CK19 AbD Serotech MCA 2145
DAPI Cell Signaling 4083
HTB9 cell line ATCC 5637 see Beattie 1997 reference to generate matrix
Agarose Sigma A-6013

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tuch, B. E., Ng, A. B. P., Jones, A., Turtle, J. R. Histologic differentiation of human fetal pancreatic explants transplanted into nude mice. Diabetes. 33, 1180-1187 (1984).
  2. Tuch, B. E., Grigoriou, S., Turtle, J. R. Growth and hormonal content of human fetal pancreas passaged in athymic mice. Diabetes. 35, 464-469 (1986).
  3. Hullett, D. A., Falany, J. L., Love, R. B., Butler, J. A., Sollinger, H. W. Human fetal pancreas: Potential for transplantation. Transplantation Proceedings. XIX (1), 909-910 (1987).
  4. Hullett, D. A., Bethke, K. P., Landry, A. S., Leonard, D. K., Sollinger, H. W. Successful long-term cryopreservation and transplantation of human fetal pancreas. Diabetes. 38, 448-453 (1989).
  5. Tuch, B. E. Reversal of diabetes by human fetal pancreas. Transplantation. 51, 557-562 (1991).
  6. Beattie, G. M., Lopez, A. D., Otonkoski, T., Hayek, A. Transplantation of human fetal pancreas: fresh vs. cultured fetal islets or ICCS. J Mol Med. 77, 70-73 (1999).
  7. Joglekar, M. V., et al. The miR-30 family microRNAs confer epithelial phenotype to human pancreatic cells. Islets. 1, 137-147 (2009).
  8. Joglekar, M. V., Joglekar, V. M., Joglekar, S. V., Hardikar, A. A. Human fetal pancreatic insulin-producing cells proliferate in vitro. J Endocrinol. 201, 27-36 (2009).
  9. Kayali, A. G., et al. The SDF-1alpha/CXCR4 Axis is Required for Proliferation and Maturation of Human Fetal Pancreatic Endocrine Progenitor Cells. PLoS One. 7, (2012).
  10. Otonkoski, T., et al. Hepatocyte growth factor/scatter factor has insulinotropic activity in human fetal pancreatic cells. Diabetes. 43, 947-953 (1994).
  11. D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 24, 1392-1401 (2006).
  12. Xu, X., et al. Endoderm and pancreatic islet lineage differentiation from human embryonic stem cells. Cloning Stem Cells. 8, 96-107 (2006).
  13. Jiang, J., et al. Generation of insulin-producing islet-like clusters from human embryonic stem cells. Stem Cells. 25, 1940-1953 (2007).
  14. Shim, J. H., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells towards a pancreatic cell fate. Diabetologia. 50, 1228-1238 (2007).
  15. Kroon, E., et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol. 26, 443-452 (2008).
  16. Van Hoof, D., D'Amour, K. A., German, M. S. Derivation of insulin-producing cells from human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 3, 73-87 (2009).
  17. Schulz, T. C., et al. A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells. PLoS One. 7, (2012).
  18. Lees, J. G., Tuch, B. E. Conversion of embryonic stem cells into pancreatic beta-cell surrogates guided by ontogeny. Regen Med. 1, 327-336 (2006).
  19. Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61, 2016-2029 (2012).
  20. Bai, L., Meredith, G., Tuch, B. E. Glucagon-like peptide-1 enhances production of insulin in insulin-producing cells derived from mouse embryonic stem cells. J Endocrinol. 186, 343-352 (2005).
  21. Semb, H. Definitive endoderm: a key step in coaxing human embryonic stem cells into transplantable beta-cells. Biochem Soc Trans. 36, 272-275 (2008).
  22. Van Hoof, D., Mendelsohn, A. D., Seerke, R., Desai, T. A., German, M. S. Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endoderm in patterned size-controlled clusters. Stem Cell Res. 6, 276-285 (2011).
  23. Beattie, G. M., Otonkoski, T., Lopez, A. D., Hayek, A. Maturation and function of human fetal pancreatic cells after cryopreservation. Transplantation. 56, 1340-1343 (1993).
  24. Sandler, S., et al. Tissue culture of human fetal pancreas. Effects of nicotinamide on insulin production and formation of isletlike cell clusters. Diabetes. 38 Suppl 1, 168-171 (1989).
  25. Otonkoski, T., Beattie, G. M., Cirulli, V., Mally, M. I., Hayek, A. Pancreatic regeneration. Sharvetnick, N., Landes, R. G. , (1997).
  26. Otonkoski, T., Beattie, G. M., Mally, M. I., Ricordi, C., Hayek, A. Nicotinamide is a potent inducer of endocrine differentiation in cultured human fetal pancreatic cells. J Clin Invest. 92, 1459-1466 (1993).
  27. Xie, R., et al. Dynamic chromatin remodeling mediated by polycomb proteins orchestrates pancreatic differentiation of human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 224-237 (2013).
  28. Hardikar, A. A., et al. Functional maturation of fetal porcine beta-cells by glucagon-like peptide 1 and cholecystokinin. Endocrinology. 143, 3505-3514 (2002).
  29. Beattie, G. M., Cirulli, V., Lopez, A. D., Hayek, A. Ex vivo expansion of human pancreatic endocrine cells. J Clin Endocrinol Metab. 82, 1852-1856 (1997).
  30. Beattie, G. M., et al. Trehalose: a cryoprotectant that enhances recovery and preserves function of human pancreatic islets after long-term storage. Diabetes. 46, 519-523 (1997).
  31. Hayek, A., Beattie, G. M. Experimental transplantation of human fetal and adult pancreatic islets. J Clin Endocrinol Metab. 82, 2471-2475 (1997).
  32. Otonkoski, T., Beattie, G. M., Lopez, A. D., Hayek, A. Use of hepatocyte growth factor/scatter factor to increase transplantable human fetal islet cell mass. Transplant. Proc. 26, 33-34 (1994).
  33. Beattie, G. M., et al. A novel approach to increase human islet cell mass while preserving beta-cell function. Diabetes. 51, 3435-3439 (2002).

Tags

الطب، العدد 87، البنكرياس الجنين البشري، كتلة الخلية جزيرة (ICC)، زرع، المناعي، تكاثر الخلايا والغدد الصماء، والتمايز، C-الببتيد
العزلة والثقافة، والتصوير من الجنين البنكرياس الإنسان الكتل الخليوي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lopez, A. D., Kayali, A. G., Hayek,… More

Lopez, A. D., Kayali, A. G., Hayek, A., King, C. C. Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters. J. Vis. Exp. (87), e50796, doi:10.3791/50796 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter