Summary
분리하는 프로토콜은, 인간 태아의 췌장 세포에서 파생 된 문화, 이미지 섬 세포 클러스터 (ICCS)를 설명한다. 이 방법은 조직, 문화, 단일 층으로 또는 집계 등의 현탁액 및 확산 마커와 췌장 세포의 운명 결정에 대한 이미지에서 ICCS을 생성하는 데 필요한 단계를 자세히 설명합니다.
Abstract
거의 30 년 동안, 과학자들은 포도당 자극에 1-9 다음과 같은 인간의 C-펩타이드를 순환의 상당한 증가에 의해 입증 누드 마우스의 신장 캡슐 아래에 이식 된 인간 태아의 ICCS는 내분비 세포 기능에 성숙 것을 증명하고있다. 그러나 체외에서 인간의 태아 ICCS에서 인슐린 생산 세포의 기원이 낮은 10; 인간 배아 줄기 세포 (hESC의) 수행 최근의 실험을 연상 결과, 제 1 형 당뇨병에 대한 잠재적 인 치료 치료로 큰 약속을 잡고 세포의 재생 소스. ICCS처럼, 부분적으로 차별화 된 hESC의 이식은 혈당 반응, 인슐린 생산 세포를 생성하지만, hESC의에서 인슐린 생산 세포의 체외 기원에 훨씬 더 강력한 11 ~ 17입니다. 내분비 전구 세포의 성장과 분화에 영향을 미치는 요인의 완전한 이해 가능성 데이터 ICCS 그는 모두에서 생성 필요SC. 프로토콜의 수는 체외 11-22, ICCS 10,23,24에 대한 훨씬 적은 EXIST에 hESC의에서 인슐린 생산 세포를 생성하기 위해 존재하지만. 그 차이의 일부는 가능성이 인간의 태아 췌장 작업의 어려움에서 비롯됩니다. 그 끝으로, 우리는에 이르기까지 임신 주수와 인간의 췌장에서 태아의 섬을 분리하는 기존의 방법에 구축하기 위해 계속 12~23주, 단층으로 또는 현탁액의 세포 성장, 세포 증식, 췌장 마커와 인간의 호르몬에 대한 이미지 글루카곤과 C-펩타이드를 포함. ICCS 신선한 조직 6의 이식에 의해 얻어진 C-펩타이드 수치와 비슷합니다 누드 마우스의 신장 캡슐 아래 이식 후 C-펩타이드 릴리스에서 결과를 아래에 설명 된 프로토콜에 의해 생성 된. 여기에 제시된 예는 췌장 내배엽의 증식 및 β 세포 기원에 집중하지만, 프로토콜은 췌장 발달의 다른 양상을 연구하기 위해 사용될 수있다, 외분비, 유관, 기타 호르몬 생산 세포를 포함.
Introduction
제 1 형 당뇨병의 셀 기반 인슐린 대체 요법에 대한 기본 제한은 이식 가능한 인간 섬의 소수입니다. 인슐린 결핍 상태의 대사 요구를 충족 인슐린 생성 세포로 인간의 췌장 전구 세포의 증식과 분화를 조절하는 능력은 제 1 형 당뇨병을 치료하기위한 세포 기반 치료를위한 중요한 빌딩 블록 남아있다.
hESC의 유래 인슐린 생산 세포, 인간의 태아 췌장 내분비 세포 또는 전구 물질의 출현은 임상 이식을위한 세포의 잠재적 인 소스로 볼 때까지. 과학 및 규제 풍경은 지난 몇 년 동안 변경되었습니다 있지만, 인간의 태아 췌장이 어떻게 발전하는지 이해하는 중요한 필요가 남아있다. 현재 많은 세포를 확장하는 효과적이고 안전한 방법이 확립 된 경우 가능성, 그러나,이 세포의 치료 적 사용 AG 할 수있는 것처럼 인간의 태아 세포의 치료 사용을 볼 수탐험 하겠지. 남아있는 주요 장애물은 반응 포도당으로 인간 태아의 췌장 세포 집합체 (ICCS)의 생체 변환에, 내분비 세포가 분비하는 인슐린은 비효율적 인 과정이라는 것입니다. 많은 작업이 끝난 28 년 이상 해명 내분비 췌장의 개발에 필요한 전사 인자의 발현 프로파일을 묘사되었지만, 간극은 전사 인자의 일시적인 발현 조절 및 세포 기능에 관련된 방법에 대한 우리의 지식에 남아.
hESC의 유래 인슐린 생산 세포, 인간의 태아 췌장 내분비 세포 또는 전구 물질의 출현은 임상 이식을위한 세포의 잠재적 인 소스로 볼 때까지. 과학 및 규제 풍경은 지난 몇 년 동안 변경되었습니다 있지만, 인간의 태아 췌장이 어떻게 발전하는지 이해하는 중요한 필요가 남아있다. 많은 사람들이 지금, 그러나 효과적 가능성이 인간 태아 세포의 치료 사용을 볼 수그리고 세포가 설립되었다 확장하는 안전한 방법이 세포의 치료 사용을 다시 탐색 할 수 있습니다. 남아있는 주요 장애물은 반응 포도당으로 인간 태아의 췌장 세포 집합체 (ICCS)의 생체 변환에, 내분비 세포가 분비하는 인슐린은 비효율적 인 과정이라는 것입니다. 많은 작업이 끝난 28 년 이상 해명 내분비 췌장의 개발에 필요한 전사 인자의 발현 프로파일을 묘사되었지만, 간극은 전사 인자의 일시적인 발현 조절 및 세포 기능에 관련된 방법에 대한 우리의 지식에 남아.
최근 줄기 세포 필드는 성숙한 내분비 세포 마커를 발현하는 세포의 생산을 구동 베이 개발 중에 시간적 전사 인자의 발현에 대한 축적 된 지식을 사용했다. hESC의와 유도 만능 세포 (IPSC)에서 인슐린 생산 세포의 기원은 상당한 만든 있지만- 소위 "블랙 박스 2 다음 췌장 전구체 전사 인자) 이식 후 생체 내 성숙을 발현하는 세포를 생성하는 1) 초기 체외 분화 : 지난 몇 년 동안 상당한 발전이 가장 효과적인 프로토콜은 두 가지 차별화 단계를 필요로 "기간. 앞으로 이동에 관계없이 셀 소스의, 생화학 수준에서 이해되어야한다, 생체 내에서 생물학 기초 섬의 성숙을 이해 진행한다. ICCS 및 hESC의 얻어진 결과 간의 유사성은 시험 관내에서 성숙, 글루코스 응답하여 인슐린 분비 세포로 인간의 췌장 전구 세포의 전이를 조절할 중요한 생화학 적 과정의 수를 알 수 남아 있다고 제안한다. 이러한 이해의 중앙 부분은 췌장 전구 세포의 기능 내분비 세포 집단을 유도하기 위해 새로운 방법을 개발하는 것입니다 hESC의 생화학 하거든 Appr뿐만 아니라 필요합니다변경 사항을 분석 할 수있는 성숙 이벤트,하지만 방법을 명료하게 oaches.
왜 우리는 인간 태아의 췌장 세포 이미징은 섬의 성숙의 변화를 식별하는 중요한 측면이라고 생각합니까? 대답은 인슐린 생산 세포를 생성하는 역사적 탐구에 부분적으로있다. 췌장 전구체와 독도에 대한 모델 및 조직 배양 시스템은 모두 연구자가 시험 관내에서 동물과 인간의 섬 독도의 성숙 사이에 존재하는 상당한 차이를 탐구 할 수있다. 인간의 태아 췌장 개발의 탐사에 대한 제한은 합법적으로 사용할 수있는 임신 주수는 이종 세포 집합체를 야기 할 것입니다. 고립 된 태아 인간의 세포는 섬, 염색은 임신 주수 9-23주에서 체외 배양 후 15 % 미만이 대부분의 세포는 섬 호르몬에 염색하지로, 내분비 세포 마커를 포함 계시 유사하지만. 그러나 이식 후와의성숙을 생체 세포의 대다수는 내분비 마커 6,25을 표현한다. 이 연구의 결과는 시험 관내 분화 후 호르몬 양성 세포의 인구를 강화하는. 체외 방법은 가능성이 생체 내 섬에 대한 통찰력을 제공 할 것입니다 만 하나의 호르몬 양의 내분비 세포의 겸손한 인구를 생성 할 수 있습니다 hESC의 분화 프로토콜 오늘 반향되고있다 성숙. 또한, 인간의 태아 췌장 개발을 드라이브 분자 이벤트를 이해하는 것은 가능성의 hESC에서 인슐린 생산 세포를 유도하고 추가 β 세포 재생 및 췌장 세포의 분화를 조절하는 메커니즘을 묘사하기위한 노력을 향상시킬 것입니다.
인간 태아 췌장 세포 및 hESC의 성숙 간의 유사성은 세포의 기능을 확장 할 수있다. 쥐의 세포처럼, 인간의 태아 세포와 차별화 된 hESC의 모두는 포도당에 반응하여 인슐린을 해제 할 수 없습니다생체 외 (26, 27)에있는 섬 neoformation 후. 그러나, 누드 마우스 및 성숙, 두 사람의 섬 같은 클러스터와 hESC의 전시 내분비 표현형에서 파생 된 인슐린 생산 세포로 이식시. 석 달 이식 후 인구 중 하나의 이식 세포의 거의 90 %가 인슐린 긍정적이며, C-펩타이드 17,26의 석방 결정에 따라 정상적으로 작동합니다. 이러한 결과는 이식이 섬의 성숙을 촉진 컨텍스트와 알 수없는 단서를 제공한다는 것을 나타냅니다. 이러한 인간의 태아 췌장 세포가 성숙을 조절하고 가속 요인을 확인하기 위해 검색에 도움이됩니다에, 여기에 설명 된 것과 같은 최적화 된 영상 프로토콜. 개발 단계에서 내분비 계통으로 분화 된 인간 태아의 췌장 세포와 hESC의 근본적인 생화학 탐사는 성숙의 효율성을 측정하기위한 필수적입니다.
Figur에서 설명하는 다음과 같은 프로토콜,전자 (1)는, 이러한 세포의 전체 인간 태아의 췌장 및 이미징에서 ICCS라는 인간 태아의 췌장 세포의 분리에 대한 현재의 방법을 제공한다. 이 프로토콜은 이후 단층 또는 정지에서 재배 할 수있는 조직의 세포의 초기 준비가 필요합니다. 내분비 세포 증식 및 성숙의 일반적으로 사용되는 마커의 이미징을위한 세포의 제조가 설명된다.
화학 개질제의 다양한의 부재 또는 존재의 생성 및 ICCS의 영상은 배양 조건 및 완전한 기능을 외분비, 유관, 또는에 인간 태아의 췌장 세포의 성숙을 촉진 화합물을 식별하는 데 도움이, 이식 모델에 비해 빠른 방법을 제공한다 호르몬의 췌장 세포를 생산.
Protocol
시작하기 전에주의 사항 :
- 인간의 태아 pancreata은 출생 결함 연구소, 조직을 수확 워싱턴 대학 (시애틀, 워싱턴, USA)에서 얻을 수 있었다. 샘플 조직 기증, 저장 및 사용에 대한 동의는 센터에서 기증자로부터 얻은 것입니다. 프로토콜의 동의 문을 서면으로 제공하고 캘리포니아 대학 샌디에이고, 인간의 연구 울타리 프로그램은 전체 연구 (프로토콜 # 081237XT)을 승인했다.
- 그것은 인간 태아 췌장 전체 절차 동안 얼음에 췌장 채 컨테이너 모두를 유지하는 것이 필수적이다. 해리와 소화 가능한 한 빨리 수행되어야한다.
- 인간의 태아 췌장 저장 및 췌장의 전송을위한 버퍼로부터 얻은 병원을 보냅니다. (RPMI-1640 + 10 % 보통 사람의 혈청 (NHS), 300 MM의 트레할로스 SG, 페니실린 / 스트렙토 마이신, 및 fungizone).
인간의 태아 췌장의 1. 해부
- 2.5 ㎎ / ㎖의 최종 농도를 수득 HBSS에서 RT 콜라게나 XI 5 ㎎을 녹인다. 4 ℃에서 살균 (멸균) 섬광 유리 병 및 저장소에 0.22 미크론 주사기 필터 솔루션을 살균 필터 조직 문화 후드에서 2 멸균 페트리 접시, 멸균 작은 도가니 (도가니를 사용할 수없는 경우, 작은 비커가 치환 될 수있다), 멸균 가위와 집게를 설정합니다. 췌장을 세척 한 배양 접시에 2 ㎖ HBSS를 추가합니다. 약 1 ㎖를 떠나 태아의 췌장을 포함하는 관에서 대기음 액체.
- HBSS없이 60mm 페트리 접시에 집게로 췌장을 제거합니다. 이 실험을 위해, 태아 ICCS는 9~23주까지 임신 주수와 신선한 pancreata에서 생성됩니다. 이전 gestionational 연령별 pancreata로부터 격리 인해 췌장의 크기로 어렵다. 프로토콜 23 주 P는 그러나 인수 이후 임신 주수에 적용 가능할ancreata이 시간 이후에 있기 때문에 연방 (미국) 제한으로 어렵습니다. 때때로, 태아의 췌장 비장, 지방, 또는 원래의 해부에서 연결된 결합 조직에 도착합니다. 여분의 조직을 육안으로 쉽게 볼 수 있고 프로토콜을 시작하기 전에 췌장에서 제거되어야한다.
- 페트리 접시에 차가운 HBSS (~ 0.5 ㎖)의 최소 볼륨에서 췌장을 씻어.
- 얼음 양동이에 멸균 핀셋과 장소를 사용하여 작은 멸균 도가니로 청소 췌장 이동합니다. 50 ML의 원심 분리기 튜브의 홀더에 도가니를 배치하고, 가위 2 쌍을 사용하여, 적극적으로 몇 분 동안 췌장 슬라이스. (일반적으로 2 ~ 5 분간 만 시간은 조직의 크기와 견고성에 달려있다). 기술을 절단하는 것이 중요합니다. 단지 대향 핸들을 이동 고정 위치가 위의 한 쪽을 잡아. 위의 조건에 도가니의 바닥에 휴식한다. 작은으로 췌장을 깰 빠른 가위 운동을 계속조각. 조직 조각이 작을수록 콜라게나가 작동 할 것이다.
- 최대 10 분 동안 200 rpm에서 37 ° C에 물 목욕 셰이커 세트의 콜라게나과 장소를 포함하는 유리 병에 HBSS는 + 다진 췌장의 1.5 ML을 추가합니다. 처음 5 분 동안 더 자주 번 이상 확인하지 않습니다. 소화 시간이 조직의 품질에 따라, 적은 6과 같은 분은 충분하다. 입자가 작고 균일 때 종점이다.
- 콜라게나 제 활성을 중지 차가운 HBSS와 유리 병 (15 ㎖)를 입력합니다. 얼음에 넣고 덩어리가 10 분 동안 정착 할 수 있습니다. 종종이 시점에서, 일부 세포의 죽음이 발생하고 DNA는 미디어에 배포됩니다. 이 매체 '힘줄'할 수있다; 이 경우, 용액에 100 μL의 DNA 분해 효소 (10 밀리그램 / 밀리리터)를 추가한다.
- 섬광 유리 병의 조직 (7-8 ㎖)에 약간의 절반 이하 전체를 떠나는 최상층시 10 분, 대기음에 정착 한 후. 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송합니다5 ㎖의 HBSS를 추가합니다. 300 X g에서 5 분 원심 분리기.
- HBSS를 기음과 RPMI-1640 루타, 10 % 보통 사람의 혈청 (NHS), 10 mM의 HEPES 산도 7.2, 페니실린 / 스트렙토 마이신, 및 fungizone을 포함하는 5 ㎖ 미디어 세포를 재현 탁. 60mm 페트리 접시를 접시. β 세포를 생성하는 것을 시도 연구원, 언론에 HGF를 (10 NG / ML 최종)를 추가합니다. 또한, 그룹의 개수는 인크 레틴 호르몬 GLP-1과 배지를 보충하는 것도 β 세포 28을 증가 시킨다는 것을 증명하고있다. 세포는 ICCS를 집계하고 형성하는 72 시간 동안 정지로 유지되어야합니다.
- 현탁액을 72 시간 후, 세포는 앞서 설명한 바와 같이 29 인간 세포주 HTB9 행렬의 행렬에 도금 될 수있다. 에 관계없이 성장 조건의 미디어마다 48 시간을 변경해야합니다.
서스펜션 성장 ICCS에있는 내분비 세포의 증식과 성숙의 마커의 2. 면역 형광, 단층, 또는 유리 Coverslips는에
- 세포 증식을 측정하기 위해, 현탁액에 부착 세포 또는 세포의 하나의 BrdU 라벨링 전에 PFA 고정 내지 12 시간 동안 수행된다. BrdU의 시약을 희석 1:100 및 RPMI-1640 살균 필터, 루타, 10 % NHS, 10 mM의 HEPES 산도 7.0, 페니실린 / 스트렙토 마이신, 및 fungizone.
- 정지 세포의 경우 : 300 XG와 대기음 배양 배지에서 5 분 동안 원심 분리기. 300 XG와 대기음에서 5 분 동안 원심 분리기를 ICCS을 씻어 10 ML PBS를 추가합니다. ICCS 파라핀에 포함 할 예정이라면, 선택 의정서 3.1-3.17를 따르십시오 자기편 세포를 들면 다음과 같습니다. 배지를 제거하고 상기 한 바와 같이 PBS로 세포를 씻어. 다음 PBS로 두 번 세척, 실온에서 4 % PFA로 20 분 동안 세포를 고정합니다. 이 시점에서, 플레이트는 파라 필름으로 포장 될 수 있으며, 최대 1 주일 동안 4 ° C에서 PBS에 저장됩니다.
- 실온에서 10 분 동안 PBS에서 0.2 % 트리톤 - X 100에 세포를 품어. PBS로 두 번 세포를 세척하고 버퍼를 차단 적용 (2 % 할nkey 혈청, 2 % 소 혈청 알부민, 1 시간 동안 PBS)에 희석 된 50 mM의 글리신. (버퍼 1:10 희석 차단) 작업 버퍼로 세포를 씻으십시오. 작업 버퍼에 항체를 희석. 유리 커버 슬립에 성장 세포의 경우, 60 μl의 총 볼륨의 항체를 희석. 6 잘 접시에 세포를 들어, 600 ㎕의 총 부피의 항체를 희석. 여러 항원을 염색하기 위해 항체의 칵테일을 적용 할 수있다. 대조군으로서, IgG를 사용하거나 특정 항체 대신 면역 혈청을 미리. 차 항체를 사용하는 것으로 제어 샘플은 같은 종에서 컨트롤의 IgG와 함께 배양해야합니다.
- 4 ℃에서 RT 또는 O / N에서 1.5 시간 중 하나를 기본 항체를 품어 차 항체를 대기음 RT에서 근무하는 버퍼로 3 회 세척한다.
- 알렉사 결합 된 항체에 대한 1:1,000 - 로다 민과 FITC 결합 된 항체, 1:500에 1:200에서 이차 항체를 희석. 그것은 모든 차 항체는 광 감응성하는 것이 중요합니다. 샘플을 커버신호의 손실을 방지하기 위해 알루미늄 호일. 실온에서 1 시간 동안 배양한다.
옵션 : 핵을 시각화하기 위해, DAPI 보조 배양 동안 1:500 추가 할 수 있습니다. 이는 전체 세포 인구의 단백질 발현의 정량에 유용합니다. - 이차 항체를 대기음 RT에서 근무하는 버퍼로 3 회 세척한다. 버퍼에 열중하는 동안 커버 슬립에 성장 세포를 들어, 부드럽게 집게로 커버 슬립을 들어 올려 PBS에 담가 씻는다. 6 잘 접시에서 자란 세포의 경우, PBS 세척 및 흡 인물을 추가 할 수 있습니다. 이 시점에서 그들은 거꾸로 현미경으로 검사 할 준비가 된 것입니다.
- 과량의 PBS를 제거하는 킴 와이프에 부드럽게 커버 슬립의 가장자리를 터치합니다. 유리 슬라이드에 장착 젤 한 방울을 추가하고 슬라이드에 coverslip에 반전. 흡인 초과 장착 젤을 제거합니다. 거품을 제거하기 위해 200 μL 피펫 팁의 뒤쪽으로 가볍게 커버 슬립을 누릅니다.
- 4 ° C에서 약 20 분 또는 O / N 실온에서와 플로리다에서 검사 드라이uorescent 또는 공 초점 현미경.
파라핀 ICCS에서 단백질의 3. (선택 사항) 면역 형광 염색법
- 3 % 아가로 오스 솔루션을 준비하고 시원한에 55 ~ 60 ° C.에게하자
- 실온에서 5 분 동안 1,500 XG에 15 ML 원뿔 관에 현탁 배양 ICCS, 원심 분리기를 전송합니다.
- 세포에서 미디어를 기음과 실온에서 10 분 동안 500 ㎕의 4 % PFA로 고정합니다. 펠릿이 매우 큰 경우를 제외하고, 펠릿을 혼합하지 마십시오.
- 750 ㎕의 PBS로 두 번 펠렛을 씻으십시오. 4 % PFA와 같이,이 폐기물은 위험한 것으로 간주하며, 기관의 유해 폐기물 규정에 따라 처리해야합니다.
- 조심스럽게 15 ML 원뿔 튜브의 벽 아래로 아가로 오스의 150 ~ 200 μl를 풀고 추가하는 세포 펠렛을 가볍게.
- 부드럽게 튜브를 가볍게 치면 혼합하지만, 거품을 형성하지 않습니다.
- 5 ~ 10 분 동안 4 ° C에서 고화 할 수 있습니다.
- 꺼 내려 21 G 바늘을 사용하여신선한 15 ML 원뿔 관에있는 펠릿과 장소.
- 슬라이드에 파라핀의 임베딩 및 섹션의 준비는 마이크로톰을 사용하여 현장에서 또는 핵심 현미경 시설에 의해 수행 할 수 있습니다.
- 조직, 수화물을 Deparaffinize, 신속하게 물로 세척한다.
- 나머지 알데히드를 해소하기 위해 RT에서 30 분 동안 0.2 M 글리신을 추가합니다.
- 2 분 각각 PBS로 두 번 슬라이드를 씻으십시오.
- 항원 검색을 위해, 핫 플레이트를 통해 비등 된 10 mM 구연산 완충액 (pH 6.0)를 가져옵니다. 그것은 다시 익혀까지 기다린 다음 15 분 동안 기다린 버퍼에 슬라이드를 담가.
- 열판에서 비커를 제거합니다. 버퍼에 냉각 슬라이드 약 40 분을 기다립니다.
- 5 분마다 H 2 O로 두 번 슬라이드를 씻으 5 분마다 PBS로 두 번 슬라이드를 씻어 1 시간 동안 PBS 2 % 정상 당나귀 혈청 차단합니다.
- 0.2 % 트리톤 X-100을 함유하는 버퍼에서 올바른 작업 농도로 희석 차 항체와 함께 배양한다.일반적으로, 기본 항체 밤새 배양 전사 인자에 대한 1.5 시간 동안 염색 한 경우 작은 호르몬, 증식 마커 및 / 또는 분화를 위해 염색.
- 위에서 설명한 단계 2.3-2.9를 수행합니다.
Representative Results
태아 ICCS 조심 제제는이 프로토콜의 성공에 매우 중요하다. 세포는 일반적으로 도금 한 후 정의 된 기간 어떻게 보면 대표 사진을 그림 2에 나타내었다. 정제 한 후, 갓 도금 세포 집합체는 몇 가지 세포 (그림 2A)를 포함 작은, 스파 명확한 클러스터를 나타납니다. 제 24시 (도 2B) 후에, 셀 클러스터의 대부분은 커지고 있지만, 다수의 작은 클러스터가 남아있다. 48 시간으로 클러스터는 크게 확대하지만, (그림 2C) 비대칭 남아있다. 72 시간에서 ICCS는 크기와 모양 (그림 2D)에서 비교적 균일 명확해야한다. 그것은 세포 역시 이러한 HTB-09 24 시간 전에 면역 형광 또는 유전자의 발현을 변경할 수없는 경우 또는 화학 물질이나 약물의 존재 하에서 또 다른 72 시간 동안 성장시키고도 행렬에 도금 될 수 있다는 것을이 점에서이다 췌장 내분비 세포 G에 필요한eneration. 3 하이라이트에게 췌장 내배엽으로 ICC의 증식 또는 분화 하나를 평가하기 위해 일반적으로 사용되는 항체의 수를 그림. 그림 (a)에, ICCS는 HTB-9에 도금 된 4 일 동안 성장하고, PDX1, 췌장 개발의 중요한 마커 스테인드. ICCS의 생체 염색이 우리의 실험실에서 일상적으로 수행하고 있지만, 더 자주, 인간의 태아 ICCS는 누드 마우스의 신장 캡슐 아래 이식 및 증식 및 생체 6,9,30-32에서 차별화 할 수 있습니다. 이식 후 지정된 시간에, 마우스를 희생하고 이식 ICCS 함유 신장을 제거하고, 4 % 파라 포름 알데히드에서 고정하고, 파라핀. 연속 5 μm의 섹션은 마이크로톰을 사용하여 사이트 나 코어 현미경 시설에서 하나 생성됩니다. 에피토프 마스크 해제 및 면역 형광 현미경 파라핀 조직에서 단백질의 염색은 선택 의정서 3.10-3에 설명되어 있습니다.. 세포 증식을 평가하고 Ki67 (빨간색)로, 17도 3b에 이식 ICCS는 상피 세포 마커 팬 아세포 (녹색 PanCK)로 염색 하였다. 또 다른 예에서, 인간 인슐린 (녹색)과 글루카곤 (빨간색) 모두가 누드 마우스 (그림 3C)의 신장 캡슐 아래 이식과 성숙 후에 발견되었다.
그림 1. 면역 형광 인간 태아 ICC 준비 및 염색의 흐름도.
그림 2. 0의 대표 태아 ICCS 준비, 도금 후 24, 48, 또는 72 시간. (A) ICCS정지에 즉시 도금 후 몇 군데 있었다, 도금, 또는 (D) 도금 후 72 시간 후 (B) 24 시간 도금 후, (C) 48의 시간. AC에 대한 스케일 바, 10 배 배율 = 300 μm의, D에 대한 스케일 바 = 100 μm의 20 배율. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
.. (, 녹색 팬 CK)과 확산 (Ki67, 빨강), (C) 인슐린 도금 ICCS 그림 3 면역 형광 검사는 정기적으로, ICCS는 (A) 췌장 내배엽 마커 PDX1 (녹색), (B) 내분비 세포가 몇 군데 있습니다 (녹색)과 글루카곤 (빨간색). AC를위한 가늠자 바, 40X 배율 = 20 μm의.
Discussion
여기에 제시된 방법은 세포 증식 및 췌장 내배엽의 마커에 대한 인간의 태아 췌장 및 이후 이미지에서 ICCS를 생성하는 하나의 수 있습니다. 인간 태아 췌장의 해리 처리는 72 시간 ICC 형성 기간, 마우스에서 β 세포 전구 세포를 분리 프로토콜에서 실질적으로 다른 방식으로,이어서 약 90 분을 요구했다. 여기에 제시된 프로토콜은 연구자가 인간 태아의 췌장 개발을 탐험 할 수있는 재생 가능한 방법을 제공한다. 종 공부의 두 가지 종류가 수행 될 수있다. 첫째, 다른 임신 나이에서 기능성 췌장 세포 유형 (유관 세포 외분비 세포, 호르몬 양성 세포)를 생성 할 가능성이 이식 후에 평가 될 수있다. 둘째, 하나의 재태 연령에서 ICCS는 문화에서 자란 선택되는 약물 치료와 차이를 탐구하는 ICC 문화 중 서로 다른 시간 지점에 이식 할 수 있습니다세포의 운명에. 현재 인슐린 생성 세포로의 분화의 hESC에 지시되는 엄청난 노력으로, 생리 학적 자극에 반응하여 인슐린 분비와 관련된 문제는 다시 부활되고있다. 인간의 ICCS는 태아의 췌장 세포의 증식 및 β 세포 발달이 중요한 측면을 연구 할 수있는 독특한 모델 시스템을 제공합니다.
조직에서 세포를 분리하는 모든 프로토콜과 마찬가지로, 세부 사항은 성공을 위해 중요하다. 파라미터의 개수는 실험을 행하는 기관 담당자의 통제 밖에서 불행히도이다. 이 실험에 의해 발생하는 두 가지 문제는 빈약 한 출발 물질의 품질 및 비 췌장 조직의 배달이 (가) 있습니다. 건강한 태아의 췌장 조직은 가위 컷에 회사입니다. 티슈 커트도 용이하면 췌장 효소는 췌장 자체를 소화하기 시작한다는 표시이다. 이에서 거기 복구 불행히도없고 준비가 가장 취소됩니다. 가끔,에췌장을 제거하는 숙련 된 기술자가 췌장의 창자의 섹션을 혼동합니다. 이 샘플은 췌장보다 훨씬 더 탄력을하고 주목할만한 루멘 존재합니다. 다시 말하지만, 이러한 샘플은 폐기되어야한다.
위에 언급 된 프로토콜을 준수하는 경우, 트랙 떨어져 격리를 던져 발생하는 모든 문제는 거의 없습니다. 부드러운 격리를 보장하기 위해 기억해야 할 몇 가지 포인트는 정확한 췌장 절단 날카로운 가위를 사용하는 소화하기에 너무 큰 어떤 조직 샘플을 두지 않는 것을 확인하고, 있습니다. 상처가 충분히 작지 않은 경우, 다음 콜라게나 효과적으로 작동하지 않으며, 몇 ICCS이 형성된다. 콜라의 새로운 배치를 사용하는 경우 소화 IU (국제 단위)가 이전에 사용 된 경우 반대로, 비슷한 레벨로 시작합니다. 그러나, 이상 소화가 발생하지 않도록하기 위해 배양 시간을 줄입니다. 이 문제 해결의 기술은 IU 레이블이 배치에서 학사 학위를 크게 변화하지 않는 것을 보장TCH.
관점에서 촬영, 인간의 태아 ICCS의 분리를위한이 기술 분야에서 상대적으로 표준입니다. 대부분의 실험실은 미디어에 HGF의 첨가는 세포가 33 생존하고 증식하는 데 도움이 우리의 연구 결과를 확인했다. 요약하면, 우리는 9~23주까지 임신 주수와 인간의 태아 ICCS에게 신선한 pancreata을 분리하는 방법을 개발했습니다. 세포는 췌장 내분비 전사 인자와 인간의 인슐린을 시각화하는 단층 또는 실험 현탁액으로 성장시킬 수있다.
Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 재생 의학 (RB3-02266)에 대한 캘리포니아 연구소와 NIH (DK54441)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trehalose SG | Hayashibara | Trehalose SG | |
| Collagenase XI | Sigma | C-9407 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 24020-117 | |
| RPMI 1640 with glutamate | Life Technologies | 11879020 | no glucose or HEPES |
| Human AB Sera, Male Donors | Omega Scientific | HS-30 | |
| Fungizone | Life Technologies | 15290018 | |
| Gentamicin Solution 50 mg/ml | Invitrogen | 15750060 | |
| 1 M Hepes, pH 7.0 | Life Technologies | 15630080 | |
| Penicillin/streptomycin 100x solution | Life Technologies | 15070063 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Peprotech | 100-39 | |
| GLP-1 | Peprotech | 130-08 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000-044 | |
| Dnase | Sigma | DN25 | |
| Sterile Petri dishes, 60 x 15 mm; stackable, venting ribs | Spectrum Laboratory Products, Inc. | D210-13 | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| 16% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| BrdU | Life Technologies | 00-0103 | |
| anti-insulin (mouse monclonal; 1:1,000) | Sigma | I2018 | |
| anti-glucagon (mouse monoclonal; 1:2,000) | Sigma | G2654 | |
| PDX1 (mouse monoclonal) | Novus Biologicals | NBP1-47910 | |
| PDX1 (goat polyclonal) | AbCam | 47383 | |
| PDX1 (rabbit polyclonal) | AbCam | 47267 | |
| Alexa Fluor 546 (rabbit) | Invitrogen | A11010 | |
| Alexa Fluor 546 (mouse) | Invitrogen | A11003 | |
| Alexa Fluor 488 (rabbit) | Invitrogen | A11008 | |
| Alexa Fluor 488 (mouse) | Invitrogen | A11001 | |
| Ki67 | Lab Vision Neomarkers | RM 9016-50 | |
| pan-CK (mouse monoclonal; 1:100) | Immunotech | 2128 | |
| CK19 | AbD Serotech | MCA 2145 | |
| DAPI | Cell Signaling | 4083 | |
| HTB9 cell line | ATCC | 5637 | see Beattie 1997 reference to generate matrix |
| Agarose | Sigma | A-6013 |
References
- Tuch, B. E., Ng, A. B. P., Jones, A., Turtle, J. R. Histologic differentiation of human fetal pancreatic explants transplanted into nude mice. Diabetes. 33, 1180-1187 (1984).
- Tuch, B. E., Grigoriou, S., Turtle, J. R. Growth and hormonal content of human fetal pancreas passaged in athymic mice. Diabetes. 35, 464-469 (1986).
- Hullett, D. A., Falany, J. L., Love, R. B., Butler, J. A., Sollinger, H. W. Human fetal pancreas: Potential for transplantation. Transplantation Proceedings. XIX (1), 909-910 (1987).
- Hullett, D. A., Bethke, K. P., Landry, A. S., Leonard, D. K., Sollinger, H. W. Successful long-term cryopreservation and transplantation of human fetal pancreas. Diabetes. 38, 448-453 (1989).
- Tuch, B. E. Reversal of diabetes by human fetal pancreas. Transplantation. 51, 557-562 (1991).
- Beattie, G. M., Lopez, A. D., Otonkoski, T., Hayek, A. Transplantation of human fetal pancreas: fresh vs. cultured fetal islets or ICCS. J Mol Med. 77, 70-73 (1999).
- Joglekar, M. V., et al. The miR-30 family microRNAs confer epithelial phenotype to human pancreatic cells. Islets. 1, 137-147 (2009).
- Joglekar, M. V., Joglekar, V. M., Joglekar, S. V., Hardikar, A. A. Human fetal pancreatic insulin-producing cells proliferate in vitro. J Endocrinol. 201, 27-36 (2009).
- Kayali, A. G., et al. The SDF-1alpha/CXCR4 Axis is Required for Proliferation and Maturation of Human Fetal Pancreatic Endocrine Progenitor Cells. PLoS One. 7, (2012).
- Otonkoski, T., et al. Hepatocyte growth factor/scatter factor has insulinotropic activity in human fetal pancreatic cells. Diabetes. 43, 947-953 (1994).
- D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 24, 1392-1401 (2006).
- Xu, X., et al. Endoderm and pancreatic islet lineage differentiation from human embryonic stem cells. Cloning Stem Cells. 8, 96-107 (2006).
- Jiang, J., et al. Generation of insulin-producing islet-like clusters from human embryonic stem cells. Stem Cells. 25, 1940-1953 (2007).
- Shim, J. H., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells towards a pancreatic cell fate. Diabetologia. 50, 1228-1238 (2007).
- Kroon, E., et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol. 26, 443-452 (2008).
- Van Hoof, D., D'Amour, K. A., German, M. S. Derivation of insulin-producing cells from human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 3, 73-87 (2009).
- Schulz, T. C., et al. A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells. PLoS One. 7, (2012).
- Lees, J. G., Tuch, B. E. Conversion of embryonic stem cells into pancreatic beta-cell surrogates guided by ontogeny. Regen Med. 1, 327-336 (2006).
- Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61, 2016-2029 (2012).
- Bai, L., Meredith, G., Tuch, B. E. Glucagon-like peptide-1 enhances production of insulin in insulin-producing cells derived from mouse embryonic stem cells. J Endocrinol. 186, 343-352 (2005).
- Semb, H. Definitive endoderm: a key step in coaxing human embryonic stem cells into transplantable beta-cells. Biochem Soc Trans. 36, 272-275 (2008).
- Van Hoof, D., Mendelsohn, A. D., Seerke, R., Desai, T. A., German, M. S. Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endoderm in patterned size-controlled clusters. Stem Cell Res. 6, 276-285 (2011).
- Beattie, G. M., Otonkoski, T., Lopez, A. D., Hayek, A. Maturation and function of human fetal pancreatic cells after cryopreservation. Transplantation. 56, 1340-1343 (1993).
- Sandler, S., et al. Tissue culture of human fetal pancreas. Effects of nicotinamide on insulin production and formation of isletlike cell clusters. Diabetes. 38 Suppl 1, 168-171 (1989).
- Otonkoski, T., Beattie, G. M., Cirulli, V., Mally, M. I., Hayek, A. Pancreatic regeneration. Sharvetnick, N., Landes, R. G. , (1997).
- Otonkoski, T., Beattie, G. M., Mally, M. I., Ricordi, C., Hayek, A. Nicotinamide is a potent inducer of endocrine differentiation in cultured human fetal pancreatic cells. J Clin Invest. 92, 1459-1466 (1993).
- Xie, R., et al. Dynamic chromatin remodeling mediated by polycomb proteins orchestrates pancreatic differentiation of human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 224-237 (2013).
- Hardikar, A. A., et al. Functional maturation of fetal porcine beta-cells by glucagon-like peptide 1 and cholecystokinin. Endocrinology. 143, 3505-3514 (2002).
- Beattie, G. M., Cirulli, V., Lopez, A. D., Hayek, A. Ex vivo expansion of human pancreatic endocrine cells. J Clin Endocrinol Metab. 82, 1852-1856 (1997).
- Beattie, G. M., et al. Trehalose: a cryoprotectant that enhances recovery and preserves function of human pancreatic islets after long-term storage. Diabetes. 46, 519-523 (1997).
- Hayek, A., Beattie, G. M. Experimental transplantation of human fetal and adult pancreatic islets. J Clin Endocrinol Metab. 82, 2471-2475 (1997).
- Otonkoski, T., Beattie, G. M., Lopez, A. D., Hayek, A. Use of hepatocyte growth factor/scatter factor to increase transplantable human fetal islet cell mass. Transplant. Proc. 26, 33-34 (1994).
- Beattie, G. M., et al. A novel approach to increase human islet cell mass while preserving beta-cell function. Diabetes. 51, 3435-3439 (2002).
