Summary
במאמר זה וידאו, אנו מתארים assay אוטומטי כדי למדוד את ההשפעה של רעב או שובע על התנהגות חיפוש מזון תלויה בריח הפירות המבוגרים לעוף melanogaster דרוזופילה.
Abstract
לבעלי חיים רבים, רעב מקדם שינויים במערכת ההרחה באופן שמקל את החיפוש אחר מקורות מזון מתאימים. במאמר זה וידאו, אנו מתארים assay אוטומטי כדי למדוד את ההשפעה של רעב או שובע על התנהגות חיפוש מזון תלויה בריח הפירות המבוגרים לעוף melanogaster דרוזופילה. בתיבת אור חזק המוארת באור אדום שהוא בלתי נראה לזבובי פירות, מצלמה קשורה לתוכנת רכישת נתונים המותאמת אישית עוקבת אחר מצבם של שישה זבובים בו זמנית. כל זבוב הוא מוגבל ללכת בזירות בודדות המכילות ריח אוכל במרכז. זירות הבדיקות לנוח על רצפה נקבובית שפונקציות כדי למנוע הצטברות ריח. חביון לאתר את מקור הריח, מדד המשקף את רגישות חוש הריח תחת מצבים פיסיולוגיים שונים, נקבע על ידי ניתוח תוכנה. כאן, אנו דנים את המכניקה הקריטית של הפעלת הפרדיגמה ההתנהגות הזה ונכסה נושאים ספציפיים לגבי loadi זבובng, זיהום ריח, טמפרטורת assay, איכות נתונים, וניתוח סטטיסטי.
Introduction
הברית הרעב לקדם שני סוגים של התנהגויות תיאבון: חיפוש מזון וצריכת מזון 1. assay התנהגותיים פשוט זו שימושי לחקר התנהגויות הקשורות לחיפוש מזון chemotactic 2,3. באופן ספציפי, הוא עוקב אחר עמדה לטוס, מהירות הליכה והשהיה לאיתור יעד ריח אוכל. מיסות של ממצא מזון משמשת כמדד למדידת שינויים ברגישות של מערכת זיהוי הריח של הזבוב במורד הזרם של שינויים במצב התיאבון הפנימי שלה. גרסה ידנית של assay זה הייתה בשימוש בעבר כדי להראות איתות הקולטן GABA-B חשובה ללוקליזציה ריח התנהגות במבוגרים עף 3. הגרסה האוטומטית הנוכחית של assay סייעה במחקר של כמה קצר איתות נוירופפטידים-F (sNPF) מעצבת מחדש את מפת חוש הריח בדרוזופילה והשפעות appetitive התנהגויות 2.
בדיקה נעשה בחדר מבוקר כהה, טמפרטורה ולחות. דיגיטלימצלמות וידאו נקבעות מעל צלחות בדיקות אקריליק ברורות לעקוב אחר הזבובים מוארים בתאורת LED 660 ננומטר. מידע מהמצלמה מעובד בזמן אמת על ידי מחשב שהוצב בסמוך לאזור הבדיקה. אנו משתמשים בתוכנת רכישת נתונים כדי להקליט ולשמור את הקואורדינטות של עמדות לטוס בתקופת הבדיקה.
בפרדיגמה זו, הנושא הוא שוחרר לזירה המכילה ריח אוכל במרכז; אובייקט הריח יוצר שיפוע ריח אוכל בזירה שגורמת מזון התנהגות חיפוש בזבוב. פרוטוקול חיפוש ריח דומה כבר מיושם כלפי המחקר של chemosensation בזחלי דרוזופילה אחת 7. בעוד מבחני התנהגות אחרים כגון ארבעת שדה olfactometer 4,5 או t-מבוך 6 להעריך התנהגויות סלידה או משיכה ריח, פרדיגמה זו היא מתאימה ביותר כדי להעריך התנהגויות רגישות וchemotaxis חוש הריח.
כמה יתרונות מרכזיים ילוו את אסא זהy. ראשית, הוא מאפשר רכישה מהירה של ערכות נתונים גדולות, כי איסוף הנתונים וניתוחם בעיקר אוטומטיים. שנית, assay זה מבודד ומודד את התנהגותם של זבובים יחיד, ובכך לחסל רמזי חוש הריח חברתיים שעשויים להשפיע על ההתנהגויות שלהם. שלישית, את הפשטות של הפרוטוקול ועיצוב ניסיוני פשוט לעשות את assay יעיל וקל ללמד אחרים.
בנוסף, assay זה יכול לשמש כדי לחקור עוד יותר מעגלים עצביים שבבסיס מזון התנהגות חיפוש על ידי שילוב עם ערכת הכלים הגנטיים הנרחב זמינים לmelanogaster דרוזופילה 8. ביטוי ממוקד של transgenes שניתן להשיג תאי עצב שתיקה או לרגש עם כלים כגון מערכת GAL4-כטב"מ כמו גם TS1 כטב"מ-shibire, כטב"מ-טטנוס הרעלן, וכטב"מ-TrpA1 (ב ') transgenes 9-12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. טוס איסוף ורעב
- אחורי הזבובים הניסיוניים בתנאי טמפרטורה ולחות מבוקרים (למשל 21 ° C, 50-60% לחות יחסית) ב12-HR מחזור אור / חושך.
- אסוף נקבת הזבובים ביום eclosion ולמקם אותם, יחד עם 4-5 זכרים, לתוך צלוחיות חדשות מזון (30 למקסימום בקבוקון). גיל עף 2-5 ימים.
- הכן את התאים להרעבה לטוס.
- לדחוף את רקמה בודדת (4.8 x 8.4 אינץ') עד לתחתית של בקבוקון פלסטיק ריק. לחלוטין לספוג את הרקמה עם מים מזוקקים. השתמש אובייקט לדחוף כלפי מטה על הרקמות ובעדינות לסחוט את המים עודפים.
- הפוך את הבקבוקון כדי לבטל את תוספת המים. צריך להיות מספיק מים כדי לשמור על כמות מים בזבובים וקאמרי הרעב לח, אבל לא מספיק כדי להטביע את הזבובים.
- העבר את הזבובים מבקבוקון המזון לתוך תא רעב ולסתום את הבקבוקון על 18-24 שעה לפני הניסוי מתחיל. אחסןבקבוקונים בתנאי טמפרטורה ולחות מבוקרים עד לילה שהניסוי יתחיל ביום שלמחרת.
2. הכנת ריח המזון
- הכן את פתרון agarose 1% על ידי הוספת 0.1 גרם של טמפרטורת התכה נמוכה agarose ל10 מיליליטר של מים מזוקקים בבקבוק זכוכית. מחממים את פתרון agarose במיקרוגל רק עד שהוא מתחיל לרתוח, אבל גם לפני שהוא רותח מעל.
- לעצור את המיקרוגל ולערבל את הבקבוק פעם אחת. חזור על פעולה זו עוד פעמיים עד agarose נמס לגמרי. שמור את פתרון agarose במצב נוזלי על ידי שמירה על חם בקבוק על פלטה חמה להגדיר ב50 ° C.
- הוספת 990 μl של פתרון agarose 1% ו10 μl של חומץ תפוחים לצינור 1.5 מיליליטר Eppendorf לבצע פתרון חומץ תפוחים 1%. ורטקס הפתרון עד מעורב ומקום בחממה אמבטיה יבשה מוגדרת 50 ° C.
3. חדר בדיקה והתקנת לשכת התנהגות
- הפעל את פנל LED (660 ננומטר).
- יש לשטוף את מסננות וצלחות בדיקות עם מים חמים ולחמם אותם בתנור ייבוש עד שכל הרטיבות התאדתה. לקרר את מסננות וצלחות עד לטמפרטורת חדר בדיקות לפני ניסויים מתחילים.
- מקם צלחת רדודה על גבי צלחת המפזר ולמלא אותו במים כדי להגדיל את הלחות המקומית וכדי להסוות את המים באגל agarose.
- מקם את הנפות מעל קערת המים.
4. טוס טוען לצלחות הבדיקה
ניתן למצוא תרשימים עם מפרט לצלחות בדיקות בסעיף משלימה הקבצים. צלחת הבדיקות עשויה אקריליק ברור וכוללת 6 זירות בדיקות. מחוון פשוט מכיל תאים מחזיקים המאפשרים טעינת זבוב, בלימה זמנית, ושחרורו הזמני של 6 זבובים לתוך התאים שלהם בתחילת הניסוי. קרוס שערות חרוטות במרכזה של כל זירה בצלחת לציין היכן צריך להיות pipetted הניחוח.
- הכנס את המחוונים לתוך צלחת בדיקות אקרילי.
- החלק בעדינות את aspirator לתוך בקבוקון העבר את תקע הכותנה ולאפשר כ -6 זבובים ללכת לaspirator.it הוא קריטי כדי להיות עדין ככל האפשר בטיפול בהם. אפשר לנצל את phototactic התנהגות לטוס כדי לגרום לזבובים לזחול כלפי aspirator ידי ההצבעה פתיחת הבקבוקון לכיוון מקור אור עמום. במידת צורך, ניתן גם להחיל שאיבה עדינה כדי לשאוב כ 6 זבובים ממין נקבה.
- הכנס את קצה aspirator לתוך החור הראשון של צלחת הבדיקה. לאפשר זבוב אחד לעבור לתא המעצר ובעדינות לקדם את המחוון קדימה כדי לטעון זבוב לתוך החור הבא. המשך עד שזבובים לכבוש את כל 6 תאי המעצר של הצלחת.
- פיפטה 5 μl של 1% פתרון agarose חומץ תפוחים ישירות על גבי מרכז CRoss-שערות על הפנים הפנימיים של צלחת הבדיקה.
5. מיצוב פלייט הבדיקה
- כדי למרכז את צלחת הבדיקה, פתח את הקובץ בשם "מיקום Tool.vi." "VI LabVIEW למיקום כלי. ניתן למצוא vi בסעיף משלימה הקבצים. הפעל את הקובץ על ידי לחיצה על החץ הלבן בפינה השמאלית העליונה של המסך.
- מניחים את צלחת הבדיקה על גבי המסננת כזו שפתיחת זירת פרצופים רצפת המסננת ויעד הריח הוא על התקרה של הצלחת. יישר את הכוונת חרוטה לתוך אחורי של צלחת הבדיקה עם שערות צלב על מסך הצג.
- כאשר יישור הושלם, להפיל ביצוע על ידי לחיצה על הנקודה האדומה הממוקמת בסמוך לפינה השמאלית העליונה של המסך.
6. להקליט את המיקום טוס במהלך הניסוי
- כדי לעקוב ולהקליט את הקואורדינטות של הזבוב במהלך כל ניסוי חיפוש מזון, פתח את קובץ תוכנת רכישה "פלורידהy מעקב - שש Zones.vi "LabVIEW VIS ל" טוס מעקב -. ניתן למצוא שש Zones.vi" בסעיף משלימה הקבצים הפעל את הקובץ על ידי לחיצה על החץ הלבן בפינה השמאלית העליונה של המסך. .
- להקצות לקובץ שם ולחץ על "אישור".
- לקדם את המחוונים בתאי הבדיקה כדי לשחרר את הזבובים לזירות בדיקות. היזהר שלא להעביר את התאים לבדיקה כמו זה יוביל ליישור לא תקין עם קואורדינטות תוכנה לניתוח.
- לחץ על "התחל" (הקלטה מתחילה) ולהבטיח שמקור האור היחיד בחדר הבדיקה הוא פנל LED 660 ננומטר.
- כאשר הניסוי נגמר, להסיר את המסננת וקאמרית התנהגות. הרם את צלחת הבדיקה מהמסננת ולהסיר את הזבובים על ידי השריית את הצלחת בקרח. לנקות בעדינות את הצלחת עם מים חמים ולהסיר כל פסולת agarose. מקם את צלחות בדיקות בתנור ייבוש להסרת לחות.
- לאוורר את אזור הבדיקה על ידי הפעלת smalאוהד l למשך כ 2 דקות. הפעל את המאוורר ומלטעון את הקבוצה הבאה של זבובים לתוך צלחת הבדיקות הבאה.
7. ניתוח נתונים באמצעות תוכנה מותאמת אישית
ניתן למצוא "ניתוח נתונים למעקב Fly-שישה אזורים" בסעיף משלימה הקבצים. במהלך רכישת נתונים, עמדת הזבוב בודדת רשומות תוכנת רכישת המתאם עבור כל נקודה בקובץ טקסט בזמן. מצלמה דיגיטלית יחידה הממוקמת מעל צלחות הבדיקות רוכשת תמונות בקצב מסגרת של 0.5 הרץ. ניתוח התוכנה "ניתוח נתונים למעקב Fly-שישה אזורים" מחלץ מידע מקובץ טקסט ל) לחשב את המהירות הממוצעת, ב) לקבוע את נקודת הזמן שבו זבוב ממוקם בהצלחה את מקור הריח, ג) לבנות חלונות גרפיים המאפשרים למשתמש להציג: לטוס מיקום, מרחק של הזבוב ממקור הריח לאורך זמן ומהירות זבוב ממוצע לאורך זמן. הוא גם מעצב את הנתונים ליצוא קל לspreתכנית adsheet. במקרו זה, חביון חיפוש מזון מוגדר כנקודת הזמן שבה טסה לבלות לפחות 5 שניות ברדיוס של 5 מ"מ ממרכז הזירה.
- פתח את קובץ תוכנה לניתוח "ניתוח נתונים עבור טוס מעקב - שישה אזורים". תחת הלשונית "Windows", לחץ על "צור טבלה חדשה." חזור על פעולה זו עד לשישה שולחנות כבר נוצרו.
- תחת לשונית "פקודות מאקרו", לחץ על "Foodfinding". פנל ראשי אמור להופיע עם האפשרויות הבאות: פתח את קובץ נתונים גולמיים לפריסה; להרחיב גלם קובץ נתונים לקובץ נתונים; מיקום Fly; מרחק; מהירות; פריסה; FormatDataFile.
- כדי להציג את הנתונים גולמיים ללא צירוף ערכים לקובץ טקסט, לחץ על "פתח קובץ נתונים הגולמיים לפריסה." אתר ובחר את קובץ נתוני הניסוי בחלון הדפדפן שמופיע. לחץ על "פתח".
- לחץ על "ארץ טוס" כדי להציג את המיקום של כל זבוב בכל אחד משש הזירות (שש חלקות XY המתארות כל זבוב 'עמדה של לאורך הזמן אמורה להופיע על המסך).
- לחץ על "מרחק" כדי להציג המרחק של כל זבוב ממקור הריח (שש חלקות המתארות את מרחקו של הזבוב ממקור הריח לאורך הזמן אמורות להופיע על המסך). הקו האופקי בy = 5 מ"מ מציין את הסף שבו לטוס נחשב להיות ממוקמים במקור המזון.
- לחץ על "מהירות" כדי להציג את המהירות הממוצעת של כל זבוב במהלך המשפט (שש חלקות המתארות את מהירותו של הזבוב לאורך הזמן אמורות להופיע על המסך).
- לחץ על "פריסה" לתצוגת פריסה בכל מיקום זבוב, מרחק, מהירות והגרפים בנוסף למהירות הממוצעת (במהלך 50 שניות הראשונות) וזמן האחזור של מציאת מקור ריח לכל זבוב (איור 1). כדי להציג את הפריסה כמו שצריך, ייתכן שיהיה צורך להתאים את השוליים. לשם כך, לחץ תחילה על חלון הפריסה. תחת הלשונית "קובץ", לחץ על "הגדרת עמוד לפריסה." לאפס את השוליים כדי0.2 סנטימטרים ולחצו על "אישור". מייד עזב את כל עלילת מיקום הוא שולחן קטן עם הכותרות "מהירות" ו "חביון". הערכים נכנסו תחת כל כותרת לציין את המהירות הממוצעת במ"מ / השני והשהית חיפוש מזון בשניות. ערכים ריקים תחת חביון מצביעים על הזבוב לא הצליח לאתר את מקור הריח. חביון חיפוש מזון מוגדר כנקודת הזמן שבה הזבובים בילו לפחות 5 שניות ברדיוס של 5 מ"מ ממרכז החדר.
- כדי להדפיס פריסה, לחץ על אזור הפריסה (פריסת עדכונים לקובץ הנוכחי). לחץ על "קובץ" ולאחר מכן לחץ על "פריסת הדפסה".
- כדי להציג את הקובץ הבא, פשוט לחץ על "פתח קובץ נתונים הגולמיים לפריסה." לחץ על קובץ נתונים הגולמי הבא שברצונך להציג ולחץ על "אישור". לחץ על חלון הפריסה לעדכן את החלון עם קובץ נתונים החדש.
- ההגדרות ניתן לשמור בקובץ ניסוי לשימוש מאוחר יותר.
8. יצוא נתונים מתוכנת ניתוח נתונים לתכנית גיליון אלקטרוני
- כדי לייצא את מהירות ונתונים השהיה עבור כל קובץ, לחץ על "Open גלם קובץ נתונים לקובץ נתונים." בחר קובץ נתוני ניסוי ולחץ על "פתח". חלון דפדפן חדש יופיע.
- בחלון החדש של הדפדפן, לחץ לחיצה ימנית על "חדש" ולאחר מכן לחץ על "מסמך טקסט". שם מסמך הטקסט החדש. בחר את קובץ טקסט בשם החדש ולחץ על "פתח". חנויות מידע זה מקובץ נתונים הגולמי לקובץ הטקסט.
- כדי לייצא את הנתונים מקובץ אחר, לחץ על "פתח קובץ נתונים הגולמיים לקובץ נתונים." לחץ על קובץ אחר ולחץ על "פתח". בחר את קובץ טקסט מצעד 8.2). המשך בתהליך זה לקבצי הנתונים שנותרו שברצונך לייצא.
- ברגע שכל קבצי הנתונים הרצויים נוספו לקובץ הטקסט, לחץ על "קובץ נתונים עיצוב." בחר את מסמך הטקסט המשמש לאחסון נתונים מהשלבים הקודמים, ולחץ על "Open" (Windo חדשw באופן אוטומטי ייפתח).
- צור מסמך טקסט חדש בחלון, להקצות לקובץ שם, ולחץ על "שמור". זה יוצר קובץ טקסט המכיל את שם קובץ, מהירות ממוצעת, והשהיה עבור כל לטוס ויכול להיות מיובא לתוך תכנית גיליון אלקטרוני.
- חלקות מצטברות בנויות מנתונים על המספר הכולל של זבובים שהגיעו למטרת ריח מזון כפונקציה של זמן (איור 3).
- ערכות נתונים ניסיוניות מנותחות למובהקות סטטיסטיות באמצעות מבחן z לפרופורציות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תוכנה לניתוח נתונים והפריסה, דוגמא שניתן לראות בתרשים 1, המשמשים להערכת ביצועים של כל זבוב במהלך משפט 10 דקות שלו על פי סדרה של קריטריוני ניתוח. הקריטריונים הבאים משמשים כדי לקבוע אם הנתונים מכל זבוב ישמשו לניתוח נתונים ונועדו לחסל אותם הזבובים שאינם מסוגלים לבצע את משימת חיפוש מזון עקב פציעה, מחלה, מתח, או חוסר המוטיבציה.
זבובים שאינם פעילים במשך יותר מ -300 שניות נחשבים 'לא פעיל', והם דחו מערכת נתונים, אלא אם כן הם) כבר הצליחו לאתר את מקור מזון או ב) להפגין מהירות ממוצעת> 10 מ"מ / שנייה לפחות 100 שניות לאחר התקופה פעילה (2a דמויות, 2b, 2 ג).
זבובים בריאים להפגין התנהגות חיפוש חזקה מייד עם שחרורו מתאי האחזקה שלהם. לכן, כדי לבחור רק זבובים אלהתערוכת מהירויות בריאה במהלך המוקדמים של חיפוש ריח פעיל השלבים, רק זבובי מהלך שבטווח מסוים של מהירויות ל50 שניות הראשונות של המשפט מקובלים לניתוח נתונים. קריטריונים זה מבוסס על התצפיות שלנו ש) כזבובים ליד מקור הריח, במהירויות שלהם יקטנו וב) כמה זבובים להגיע ליעד הריח בתוך 50 שניות הראשונות של assay. קריטריוני המהירות נקבעים על ידי הערכה למהירות של לפחות 100 זבובי שליטה הממוצעת בטמפרטורת ניסוי נתון. הגבולות / מהירות נמוכה יותר העליונים נקבעים על ידי המהירות הממוצעת + / - סטיית תקן, בהתאמה. לדוגמא, ב21 מעלות צלזיוס, רק זבובי מהלך שבין 3.5-10.5 מ"מ / השני ב50 שניות הראשונות של הניסוי נמצא בשימוש לניתוח נתונים. חריגים לכלל זה הם עשו עבור זבובים שממוקמים בהצלחה את מקור הריח בתוך 50 שניות הראשונות ולכן הם איטיים יותר ממהירות המותרת נמוכה יותר.
זבובים שאינם עוברים דרך כל ארבעת הרביעים בזירה ואת הראש ישרלמקור מזון לאחר תחילת המשפט נדחתה (איור 2).
זבובים שאורגים לכיוון ומרחק ממקור המזון ברדיוס 10 מ"מ עבור מינימום של 50 שניות נחשבים לבעלים מצאו את מקור מזון בהצלחה. המרחק המתאר את העלילה של הזבוב ממקור הריח לאורך זמן יכול לשמש כדי להעריך את המקרה הנדיר הזה. זהו המקרה היחיד של חיפוש מוצלח, שאינו מזוהה באופן אוטומטי על ידי מאקרו ניתוח הנתונים הנוכחי וחייבים להיות מזוהה באופן ידני (2E איור)
ארינס עם חפצים גלויים בעמדת עקבות זבוב נדחים. ניתן ליצור חפצים בכל מקרה שבו רכישת נתונים התוכנה מזהה אובייקט אחר מאשר הזבוב. לעתים קרובות הם מופיעים כקווים ארוכים וישרים המשתרעים על פני על פני הזירה או להקרין ממרכזו (איור 2F).
באיור 3, זבובים בוגרים מורעבים 18-24 תערוכה hr o גבוהה יותררגישות lfactory לריחות מזון הקשורים מאשר עמיתיהם הפד 1. עלילה גרפית של האחוז המצטבר של זבובים שאיתור מקור ריח אוכל בהצלחה תערוכות 30% מכל הזבובים המורעבים להצליח בתוך חלון 10 דקות, לעומת זאת, רק 7% מכלל זבובי הפד לעשות כן (איור 3). תגובה התנהגותית חוש הריח מוגבר זה הוכח בעבר לדרוש אנטנות שלמות 1. חוסר ציות להבדל ברור בין זבובי שליטת הפד והמורעבים בassay זה ניתן לפתור על ידי בחינת גידול סביבתי ובדיקת תנאים.
אסטרטגיה שימושית אחת עבור תנאי בדיקת פתרון בעיות היא לבחון האם זבובים נמשכים לרמזים נוספים מלבד יעד הריח על ידי מדידת משיכה לטוס לרכב הריח, agarose. זבובים מורעבים צריכים להפגין משיכה גדולה יותר באופן משמעותי לחומץ מאשר לרכב agarose לבד (איור 4). איור 4 אתוצאות תערוכות מניסוי חיפוש מזון שבוצע ב32 מעלות צלזיוס עם לחות סביבתית של 35% באמצעות זבובי סוג בר. במערך נתונים זה, אין הבדל משמעותי בין משיכה לטוס לחומץ ושליטת agarose זוהה. זוהי ככל הנראה בשל משיכה גוברת למים שנמצאה בטיפת agarose בטמפרטורות בדיקות חמה יותר. על ידי הגדלת לחות בדיקות כדי 50-60%, היינו יכול לתקן לשינוי ההתנהגות הזה ולשחזר את ההבדל המשמעותי בין המשיכה לחומץ ורכב agarose (איור 4 ב, * מציין p-value <0.05).
איור 1. פריסת נתונים תוכנת ניתוח טיפוסית ממחישה לטוס עמדה לאורך זמן, לטוס מרחק ממקור ריח לאורך זמן, ולעוף במהירות לאורך זמן. טבלת 2 עמודה בפינה השמאלית העליונהפינה של כל זירה מציגה את מהירות ממוצעת (מ"מ / השני) במהלך 50 שניות הראשונות (עמודת 1) וההשהיה של מציאת מזון בשניות (עמודה 2). בנוסף, שמו של קובץ הטקסט פתח מצורף לפינה השמאלית התחתונה (מאוירת כמו, "OZ120807_ORCODTKRi_1% _S4"). לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
איור 2. דוגמאות לסוגים שונים של עקבות התייחסו בקריטריוני ניתוח..) טוס שכבר לא פעיל ל300 + שניות נדחה. ב '.) טוס שכבר לא פעיל לאחר איתור מזון בהצלחה מקובל. C). טוס כי כבר פעיל במשך 300 + שניות אבל מראה פעילות חזקה לפחות 100 שניות לאחר תקופה לא פעילה מקובלת. ד.) טוסו ה בראש ישר למקור מזון לאחר שחרורו נדחה. E). זבובים שמארג כיוון ומרחק ממקור המזון ברדיוס 10 מ"מ עבור מינימום של 50 שניות נחשבים למצא מקור מזון בהצלחה ומתקבל F. ארינס.) עם חפצים גלויים בפריסה נדחים. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
איור 3. עלילה גרפית המציגה אחוז מצטבר של זבובים נמאס ומורעבים שימצאו מקור ריח לאורך זמן באמצעות השהיה של ממצא מזון. (N = 88-96 זבובים; * מציין p-value <0.05, ** מציין p-value <0.01).
"/> Ad/50801/50801fig4.jpg
איור 4. תנאי בדיקת פתרון בעיות) עלילה גרפית המציגה אחוז המצטבר של זבובים שימצאו חומץ 1% או רכב agarose לאורך זמן. לא נמצא הבדל משמעותי התגלה באטרקציה לטוס ליעד או ריח כאשר תנאי בדיקה היו ב32 ° C ו) עלילה גרפית לחות 35% (n = 62-94 זבובים). B מראה אחוז המצטבר של זבובים שימצאו חומץ 1% או רכב agarose לאורך זמן. תנאי בדיקה היו ב32 מעלות צלזיוס, לחות 50-60%. בתנאים אלה, זבובים באופן משמעותי יותר נמשכים לחומץ 1% יותר מאשר לרכב agarose (n = 55-71 זבובים; * מציין p-value <0.05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בפרוטוקול זה, אנו מתארים הליך צעד אחר צעד עבור assay חיפוש מזון ההתנהגות. בנוסף לריחות מזון קשור, היא עשויה גם להיות מותאמת ללימוד היכולת של הזבוב כדי לאתר אובייקטי ריח אחרים. לדוגמא, זה יכול להיות מיושם כלפי המחקר של בן זוג לוקליזציה התנהגות בזבובי זכרי 3 ישנם כמה שיקולים נוספים לפרוטוקול זה שיזכירו כאן לגבי הליך זה.:
ראשית, טמפרטורת הגידול קובעת כמה זמן צריכים להיות בגילי זבובים ניסיוניים לפני הבדיקה. מומלץ כי טווח גילים להיבחן על מנת לקבוע את הגיל המתאים ביותר לניסוי. לדוגמא, בניסיון שלנו, כשגדלו ב21 ° C, הבדלים בין תגובות זבוב נמאס ומורעבות הם חזקים ביותר אחרי שהם כבר בגיל 4-5 ימים.
שנית, הנוריות להאיר צלחת מפזר זכוכית המשמשת ליצירה מתמדת, אפילו תאורה מתחת התאי אקריליק דואר. אפילו במידה מספקת, תאורה קבועה, ובהירה היא קריטית למעקב אוטומטי של תנועת זבוב. תאורה אחידה, או מהבהב מקורות אור עלולה להוביל לטעויות במעקב אוטומטי של הזבוב כי גם לגרום לחוסר יכולת לסירוגין כדי לזהות את העמדה של הזבוב או לגרום לתוכנה לטעות חפצי האור כמו הזבוב. מצאנו גם תאורה אחורית זמינה מסחרי LED או עבודת מערך LED מובנה מותאם אישית באותה מידה גם במתן מענה לצרכי התאורה לassay זה.
שלישית, אם את התוכנה בטעות מזהה שינויים קטנים בתאורה או אובייקטים agarose נוספים כמו, הגדרות זיהוי אובייקט בתוכנת הרכישה "טוס מעקב שישה אזורים" עשוי להיות מותאם לסף, כמו גם גודל אובייקט. התאמת הגדרות זיהוי מבטיחה כי רק אובייקט אחד זוהתה בכל זירה. כדי להציג את מספר האובייקטים במעקב בכל זירה, לחץ על כרטיסיית "הסף" של "טוס מעקב שש Zones "רכישת תוכנה. אם יותר מאובייקט אחד הוא במעקב, ניתן להתאים את גודל מינימלי, גודל מקסימאלי, סף מינימלי, או סף מקסימאלי עד החפץ זוהה נעלם.
הרביעית, לטוס מניות המשמשות בניסויים אלה צריכים להיות isogenized. הופעות התנהגותיים בפרדיגמה זו הן רגישות מאוד להבדלים ברקע גנטי. נקבות הזדווגו משמשות להפחתת שונות התנהגותית פוטנציאליות הקשורים למעמד הזדווגות או מין. אין שום סיבה להאמין assay זה לא יהיה יעיל באותה מידה בחקר התנהגותם של זכרים או נקבות בתולה.
חמישית, המסננת צריכה להיות מושעה מעט מעל צלחת מפזר האור כדי למנוע הרוויה ריח של שיפוע הריח (ההשעיה היא כ 2 סנטימטר עם הדגם שנרכש באופן מסחרי שלנו). אנו משתמשים במסננות זמינות מסחרי כדי ליצור רצפה נקבובית מתחת לצלחות הבדיקה.
לבסוף, על מנת לייצר נתונים מהימנים סטים, עקביות נדרש בתנאי גידול ובדיקה ניסיוניים. כל כישלון כדי לראות הבדלים משמעותיים בין תגובות נמאס ורעבות בזבובי שליטה יכול להיפתר על ידי בדיקה כדי לוודא 1 זבובים) הם גודלו בתנאי טמפרטורה ולחות יציבים, 2) זבובים ניזונים עם מזון טרי ולא גודלו בתנאים צפופים, 3) eclosed החדש לעוף חשיפה לCO 2 הוא ממוזער, 4) זבובי ניסיון באותו האורך של רעב, 5) זבובים נבדקים בתנאי טמפרטורה ולחות יציבים, ו6) סביבת הבדיקות ותאים אינן מזוהמים בריחות מניסויים קודמים או ניסויים. בנוסף לפרמטרים הנ"ל, isogenization של מניות זבוב הוא חשוב כרקע גנטי שונה יכול להשפיע על תפקוד לטוס בassay זה. יתר על כן, אם חומץ משמש כמקור ריח, יש להקפיד על מנת להבטיח שזה לא לאבד את העוצמה שלה על ידי שמירה על אותה בחוזקה אטומה ומאוחסן ב 4 ° C.
= "Jove_content"> בצורתו הנוכחית, assay חיפוש הריח הזה הוא מתאים ביותר ללימוד chemotaxis והבדלי הערכה ברגישויות חוש הריח על פני גנוטיפים שונים או תנאי ניסוי. Chemotaxis מטבעו דורש רגישות לריח, משיכה לריח זה, והמוטיבציה לחפש יעד הריח. אטרקציה ריח או סלידה כשלעצמה, לעומת זאת, נמדדת על ידי מיטב מבחני התנהגות שמציגים את הזבוב עם בחירות ריח כגון T-מבוך 6 או ארבעת שדה olfactometer 4,5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שום אינטרס כלכלי מתחרה.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר לJWW מהמכון הלאומי לבריאות (R01DK092640) והקרן הלאומית למדע (0,920,668).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Apple Cider Vinegar | Spectrum | commercially available | |
| Agarose, Type VII | Sigma-Aldrich | A0701 | low gelling temperature agarose |
| Acrylic Testing Plate | custom | Plate contains 6 arenas. Each arena is 60 mm in diameter 6 mm in height. See testing plate diagrams for specific measurements. | |
| LabVIEW V.8.5 | National Instruments | 776670-09 | platform for programs: PositioningTool.vi, FlyTracking--Six Zones.vi NOTE: "elapsed time.vi", "time into file.vi", and "two object detect.vi" are included subroutines that must be available in order for the main data acquisition program "FlyTracking--Six zones.vi" to run. |
| LabVIEW Vision 8.5 | |||
| LabVIEW Vision Acquisition Software 8.5 | |||
| LabVIEW Vision Builder AI 3.5 | |||
| Igor Pro V.6 | Wavemetric, Inc. | platform for macro: Data Analysis for Fly Tracking--Six Zones | |
| Basler scA1390-17fm | National Instruments | 779980-01 | Digital Camera NOTE: driver for camera available at Baslerweb.com |
| 8 mm lens | National Instruments | 780024-01 | Lens for Basler Digital Camera |
| Ground Glass Diffuser Plate | Edmund Optics | custom | Diffuses light, 25 cm x 30 cm |
| US Std. No. 100 | Fischer Scientific | 04-881X | Sieve with nominal opening of 150 μm |
| Lighting Option 1 | |||
| LED backlight 660 nm (20 cm x 20 cm) | Spectra West | BL47192 | a simpler but more expensive lighting option. |
| Power Supply for LED Backlight | Spectra West | ||
| Lighting Option 2 | |||
| 660 nm LEDs | Superbrightleds | RL5R1330 | Wavelength 660 nm (approximately 7 x 7 LED array for a 14.7 inch x 9.75 inch panel) |
| Linear DC Power Supply | GW Instek | GPS-1830D | Power supply for LED Panel |
| Solderless Breadboard | Digikey | 922354-ND | Breadboard for LEDs |
References
- Dethier, V. G. The hungry fly : a physiological study of the behavior associated with feeding. , Harvard University Press. (1976).
- Root, C. M., Ko, K. I., Jafari, A., Wang, J. W. Presynaptic facilitation by neuropeptide signaling mediates odor-driven food search. Cell. 145, 133-144 (2011).
- Root, C. M., et al. A presynaptic gain control mechanism fine-tunes olfactory behavior. Neuron. 59, 311-321 (2008).
- Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459, 218-223 (2009).
- Faucher, C., Forstreuter, M., Hilker, M., de Bruyne, M. Behavioral responses of Drosophila to biogenic levels of carbon dioxide depend on life-stage, sex and olfactory context. J. Exp. Biol. 209, 2739-2748 (2006).
- Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. Conditioned behavior in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 708-712 (1974).
- Fishilevich, E., Domingos, A. I., Asahina, K., Naef, F., Vosshall, L. B., Louis, M. Chemotaxis behavior mediated by single larval olfactory neurons in Drosophila. Curr. Biol. 15, 2086-2096 (2005).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454, 217-220 (2008).
- Kitamoto, T. Conditional modification of behavior in Drosophila by targeted expression of a temperature-sensitive shibire allele in defined neurons. J. Neurobiol. 47, 81-92 (2001).
- Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O'Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14, 341-351 (1995).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
