Summary
I denne videoen artikkelen beskriver vi en automatisert analyse for å måle effekten av sult eller metthetsfølelse på olfactory avhengige mat søkeatferd i den voksne bananflue Drosophila melanogaster.
Abstract
For mange dyr, fremmer sult endringer i luktesystemet på en måte som letter søket etter passende mat kilder. I denne videoen artikkelen beskriver vi en automatisert analyse for å måle effekten av sult eller metthetsfølelse på olfactory avhengige mat søkeatferd i den voksne bananflue Drosophila melanogaster. I en lystett boks opplyst av rødt lys som er usynlig for fruktfluer, et kamera koblet til tilpasset datainnsamling programvaren overvåker posisjonen til seks fluer samtidig. Hvert fly er begrenset til å gå i enkelte arenaer som inneholder en mat lukt i sentrum. Testingen arenaer hvile på en porøs etasje som fungerer for å hindre lukt opphopning. Ventetid for å lokalisere luktkilden, en beregning som gjenspeiler lukte følsomhet under ulike fysiologiske tilstander, bestemmes av programvare analyse. Her diskuterer vi de kritiske mekanikk ved å drive denne atferds paradigmet og dekke spesifikke spørsmål angående fly loading, luktforurensning, assay temperatur, datakvalitet og statistiske analyser.
Introduction
Tilstander av sult fremme to typer appetitive atferd: mat søke og matforbruket en. Denne enkle atferdsanalyse er nyttig for studier av kjemotaktiske atferd assosiert med beite 2,3. Nærmere bestemt, låter det flue posisjon, ganghastighet og ventetid for å finne en mat lukt mål. Latency av mat funn tjener som metrisk for å måle forandringer i følsomheten til fluens lukt deteksjonssystem nedstrøms for forandringer i dens indre appetitive tilstand. En manuell versjon av denne analysen ble tidligere brukt til å vise GABA-B reseptor signalisering er viktig for lukt lokalisering atferd i voksen flyr tre. Den nåværende automatiserte versjonen av analysen var instrumental i studiet av hvor kort neuropeptide-F (sNPF) signale fornyer lukte kartet i Drosophila og påvirkninger appetitive atferd to.
Testing er gjort i et mørkt, temperatur-og fuktighetskontrollerte rom. Digitaltvideokameraer satt ovenfor de klare akryl testplater spore fluer bakbelysning av 660-nm LED-belysning. Informasjon fra kameraet blir behandlet i sann tid av en datamaskin stasjonert ved siden av testområdet. Vi bruker datainnsamling programvare for å ta opp og lagre koordinatene for flue posisjoner i løpet av testperioden.
I dette paradigmet, er gjenstand slippes ut en arena som inneholder en mat lukt i sentrum, lukt objekt skaper en mat lukt gradient innenfor arenaen som induserer mat søkeatferd i smekken. En lignende lukt søk protokollen har blitt brukt mot studiet av chemosensation i single Drosophila larver 7. Mens andre atferds analyser som fire-feltet olfactometer 4,5 eller t-labyrint 6 evaluere lukt aversjon eller tiltrekning atferd, er dette paradigmet best egnet til å vurdere olfactory følsomhet og kjemotaksis atferd.
Flere viktige fordeler følge dette assay. Først tillater det raske oppkjøp av store datasett, fordi datainnsamling og analyse er det meste automatisert. For det andre, isolerer denne analysen og måler oppførselen til enkelt fluer, og dermed eliminere sosiale olfactory signaler som kan påvirke deres atferd. Tredje, enkelhet av protokollen og enkel eksperimentell design gjør analysen effektiv og lett å lære andre.
I tillegg kan denne analysen anvendes for ytterligere å undersøke nevrale kretser underliggende mat søke oppførsel ved å kombinere den med den omfattende genetiske verktøysettet er tilgjengelig for Drosophila melanogaster 8.. Målrettet uttrykk for transgener som stillhet eller opphisse nevroner kan oppnås med verktøy som Gal4-UAS systemet samt UAS-shibire TS1, UAS-tetanus-toksinet, og UAS-TrpA1 (B) transgener 9-12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Fly Collection og sult
- Bak de eksperimentelle fluer under kontrollerte temperatur-og fuktighetsforhold (f.eks 21 ° C, 50-60% relativ luftfuktighet) på en 12-timers lys / mørke-syklusen.
- Samle kvinnelige flyr på dagen for eklosjonshormon og plassere dem, sammen med 4-5 menn, inn i nye matvarer hetteglass (maks 30 per hetteglass). Alder flyr 2-5 dager.
- Forbered kamrene for fly sult.
- Press et enkelt vev (4.8 x 8.4 tommer) ned til bunnen av en tom plast ampulle. Fullstendig suge vevet med destillert vann. Bruk et objekt for å presse ned på vev og forsiktig klem ut overflødig vann.
- Snu hetteglasset for å forkaste den ekstra vann. Det bør være nok vann til å holde fluene hydrert og sult kammeret fuktig, men ikke nok til å drukne fluene.
- Overfør fluene fra maten hetteglasset inn i en sult kammer og plugg flasken om 18-24 timer før forsøket begynner. Oppbevarampuller under kontrollerte temperatur-og fuktighetsforhold over natten før forsøket begynner neste dag.
2. Tilberedning av maten Lukt
- Tilbered en 1% agarose-løsning ved å tilsette 0,1 g av lavtsmeltende agarose temperatur til 10 ml destillert vann i en glasskolbe. Varm opp agarose-løsning i en mikrobølgeovn like før det begynner å koke, men godt før det koker over.
- Stopp mikrobølgeovn og virvle kolben gang. Gjenta dette trinnet to ganger mer til agarose er helt oppløst. Hold agarose-løsning i flytende tilstand ved å holde kolben varme på en varmeplate ved 50 ° C.
- Legg 990 mL av 1% agarose løsning og 10 mL av eple cider eddik til en 1,5 ml Eppendorf tube å lage en 1% eple cider eddik løsning. Vortex løsningen inntil blandet, og plasser i en tørr bade inkubator innstilt på 50 ° C.
Tre. Testing rommet og Behavior Chamber Setup
- Slå på LED-panel (660 nm).
- Skyll såldene og testplater med varmt vann og varme dem i en tørkeovn inntil all fuktighet er fordampet. Kule de sikter og plater ned til testing romtemperatur før du begynner eksperimenter.
- Sett på et grunt fat på toppen av sprederplaten og fylle det med vann for å øke den lokale fuktighet og for å maskere vannet i agarose dråpene.
- Plasser sikter over vannet fatet.
4. Fly Laster inn i testingen Plates
Diagrammer med spesifikasjoner for testing plater kan bli funnet i Supplemental filer delen. Testplaten er fremstilt av klar akryl og består av seks testarenaer. En enkel skyveknapp inneholder holder kammer som tillater fly lasting, midlertidig oppdemming, og samtidige lanseringen av seks fluer i sine respektive kamre påstarten av forsøket. Trådkors som er etset i midten av hver arena i platen indikere hvor odorants bør pipettert.
- Sett gliderne inn i akryl testing plate.
- Skyv vifte inn i hetteglasset forbi bomull pluggen og la ca 6 fluer å gå inn i aspirator.it er avgjørende for å være så skånsom som mulig i å håndtere dem. Man kan dra nytte av phototactic fly atferd å indusere fluer å krype mot vifte ved å peke i ampulleåpningen mot et svakt lys kilde. Hvis det er nødvendig, kan man også bruke milde sug til å suge ca seks kvinnelige fluer.
- Sett spissen av aspirator inn i det første hull i testplaten. Tillate en enkelt fly å passere inn i varetekt og forsiktig videre glidebryteren frem til å laste et fly inn i det neste hullet. Fortsett til fluer okkupere alle seks holder celler av platen.
- Pipetter 5 pl av 1% eplecider eddik agarose-løsning direkte på sentrum av den crOss-hår på innsiden av testplaten.
5. Plassere Testing Plate
- For å sentrere testing plate, åpne filen som heter "Posisjonering Tool.vi." "LabVIEW VI for Positioning Tool. VI kan bli funnet i Supplemental filer delen. Kjør filen ved å klikke på den hvite pilen i øvre venstre hjørne av skjermen.
- Plasser testing plate på toppen av sikten slik at anlegget åpning vender mot silen gulvet og lukt som mål på taket av platen. Juster trådkorset gravert inn bak på testing plate med trådkorset på LCD-skjermen.
- Når justeringen er fullført, abortere henrettelse ved å klikke på den røde prikken som ligger nær den øvre venstre hjørne av skjermen.
6. Noter Fly posisjon under Experiment
- For å spore og registrere koordinatene på flua under hver mat søke rettssaken, åpner oppkjøpet programvarefil "Fly Tracking -. Seks Zones.vi "LabVIEW VIs for" Fly Tracking - Seks Zones.vi "kan bli funnet i Supplemental Files seksjonen Kjør filen ved å klikke på den hvite pilen i øvre venstre hjørne av skjermen. .
- Tildele filen et navn, og klikk på "OK".
- Advance gliderne i testkamre for å slippe fluene inn i testingen arenaer. Vær forsiktig så du ikke å flytte testkamre, da dette vil føre til feil justering med analyse programvare koordinater.
- Klikk på "Start" (opptak starter) og sørge for at den eneste kilden til lys i testkammeret er det 660 nm LED-panel.
- Når rettssaken er ferdig, fjerner du sil og atferd kammeret. Løft testing plate fra sil og fjerne fluene ved å senke plate i isen. Forsiktig rense plate med varmt vann og fjern agarose rusk. Plasser måleplatene i en tørkeovn for å fjerne fuktighet.
- Ventiler testing området ved å slå på en small fan i omtrent 2 min. Slå av viften og legg den neste gruppen av fluer til neste testing plate.
7. Data Analysis Bruke Custom Software
"Data Analysis for Fly Tracking-Seks soner" kan bli funnet i Supplemental filer delen. Under datainnsamling, koordinerer oppkjøpet registrerer enkelte fly posisjon for hvert tidspunkt i en tekstfil. En enkelt digitalt kamera plassert over testplater kan samle inn bilder til en bildefrekvens på 0,5 Hz. Analysen program "Data Analysis for Fly Tracking-Seks soner" trekker ut informasjon fra denne tekstfilen til a) beregne gjennomsnittshastighet, b) bestemme tidspunktet punktet hvor en flue med hell plassert lukt kilde, og c) bygge grafiske vinduer som tillater brukeren å vise: fly plassering, avstand på direkten fra luktkilden over tid og gjennomsnittlig fly hastighet over tid. Det formaterer også dataene for enkel eksport til en rangeladsheet program. I denne makro, mat søkeforsinkelsen er definert som tidspunktet ved hvilken fluer bruke minst 5 sekunder under 5 mm radius fra sentrum av arenaen.
- Åpne analyse programvare filen "Data Analysis for Fly Tracking - Seks soner". Under "Windows"-kategorien, klikk på "Opprett ny tabell." Gjenta dette trinnet til seks bord har blitt opprettet.
- Under "Makroer"-kategorien, klikk på "Foodfinding." En hovedfeltet skal vises med følgende valg: Åpne Raw datafil for Layout, åpen Raw datafil for datafil, Fly Location; Avstand; Speed; Layout; FormatDataFile.
- Slik viser rådata uten å legge verdier til en tekstfil, klikk på "Åpne Raw datafil for Layout." Finn og velg den eksperimentelle data filen i nettleservinduet som vises. Klikk på "Open".
- Klikk på "Fly plassering" for å vise hvert fly plassering i hver av de seks arenaer (seks xy-plott som viser hver flue 's posisjon over tid skal vises på skjermen).
- Klikk på "Distance" å se hver flue avstand fra luktkilden (seks tomter som viser flua avstand fra luktkilden over tid skal vises på skjermen). Den horisontale linjen ved y = 5 mm angir terskelen for når fly er vurdert til å ligge på matkilde.
- Klikk på "Speed" for å vise hvert fly gjennomsnittsfart under rettssaken (seks tomter som viser fluens hastighet over tid skal vises på skjermen).
- Klikk på "Oppsett" for å vise en layout med alle fly beliggenhet, avstand og hastighet grafer i tillegg til gjennomsnittshastigheten (i løpet av første 50 sek) og ventetid for å finne lukt kilde for hver flue (Figur 1). Til riktig vise oppsettet, kan det være nødvendig å justere margene. For å gjøre dette, klikker du først på layoutvinduet. Under "File"-kategorien, klikk på "Sideoppsett for oppsett." Tilbakestill margene til0,2 inches og klikk på "OK". Umiddelbart til venstre for hvert sted tomten er et lite bord med overskriftene "Speed" og "Ventetid". Verdiene som legges inn under hver overskrift viser gjennomsnittshastighet i mm / sek og mat søk ventetid i løpet av sekunder. Blanke oppføringer under ventetid tyder fly ikke klarte å lokalisere luktkilden. Food søkeforsinkelsen er definert som det tidspunkt der fluene brukte minst 5 sekunder under 5 mm radius fra midten av kammeret.
- For å skrive ut et oppsett, klikker du på layout-området (oppdateringer layout til gjeldende fil). Klikk på "File" og klikk deretter på "Print Layout."
- For å vise neste fil, klikker du bare på "Open RAW-datafil for Layout." Klikk på neste rå datafilen du ønsker å se, og klikk på "OK". Klikk på Layout-vinduet for å oppdatere vinduet med den nye datafilen.
- Innstillingene kan lagres i et eksperiment fil for senere bruk.
8. Eksportere data fraData Analysis Software til et regnearkprogram
- Slik eksporterer hastighet og latency data for hver fil, klikk på "Åpne Raw datafil for datafil." Velg en eksperimentell datafil og klikk på "Åpne". Et nytt nettleservindu vil vises.
- I det nye nettleservinduet, høyreklikker du på "New" og klikk deretter på "Tekstdokument". Navn på den nye tekstdokument. Velg den nylig kåret til tekstfilen og klikk på "Åpne". Denne lagrer data fra rå datafilen i tekstfilen.
- Hvis du vil eksportere data fra en annen fil, klikker du på "Åpne Raw datafil for datafil." Klikk på en annen fil og klikk på "Åpne". Velg tekstfilen fra trinn 8.2). Fortsett denne prosessen for de resterende datafilene du ønsker å eksportere.
- Når alle de ønskede datafiler har blitt lagt til tekstfilen, klikk på "Format datafil." Velg Tekstdokument brukes til å lagre data fra de foregående trinnene, og klikk på "Open" (en ny utstillingsviw vil automatisk åpne).
- Lag et nytt tekstdokument i vinduet, filen et navn tildele, og klikk på "Lagre". Dette skaper en tekstfil som inneholder filnavnet, gjennomsnittshastighet, og ventetid for hvert fly, og kan importeres til et regnearkprogram.
- Kumulative plott er konstruert fra data på det totale antall fluer som når maten lukt målet som funksjon av tid (figur 3).
- Eksperimentelle datasett blir analysert for statistisk signifikans ved hjelp av en z-test for proporsjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den dataanalyse-programvare og oppsettet, et eksempel på en som kan sees i figur 1, blir brukt for å evaluere hvert fly ytelse i løpet av dens 10 min prøving i henhold til et sett av analysekriteriene. Følgende kriterier er brukt for å avgjøre om data fra hvert fly vil bli brukt for dataanalyse og er designet for å eliminere de fluer som er ute av stand til å utføre maten søke oppgave på grunn av skade, sykdom, stress, eller mangel på motivasjon.
Fluer som er inaktive i mer enn 300 sek regnes som "inaktive" og blir avvist fra datasettet med mindre de a) allerede har lykkes i å finne den matkilde eller b) viser en gjennomsnittshastighet> 10 mm / sek for minst 100 sek etter den inaktive periode (figur 2a, 2b, 2c).
Sunn fluer vise robust søkeatferd umiddelbart ved løslatelse fra sine holding kamre. Derfor, for å velge bare de fluene somutvise sunn hastigheter i de tidlige stadier av aktiv lukt søk, flyr bare at flytte innen en viss rekkevidde av hastigheter for den første 50 sek av rettssaken er akseptert for dataanalyse. Denne kriteriene er basert på våre observasjoner at a) som flyr nær luktkilden, deres hastigheter minsker, og b) noen fluer nå lukt målet innen de første 50 sekunder til analysen. Hastigheten kriterier bestemmes ved å evaluere de gjennomsnittlige hastigheter på minst 100 kontroll flyr på en gitt forsøkstemperatur. Den øvre / nedre fartsgrenser er satt av gjennomsnittshastighet + / - standardavvik, henholdsvis. For eksempel, ved 21 ° C, flyr bare at flyttingen mellom 03.05 til 10.05 mm / sek i første 50 sek av rettssaken blir brukt for dataanalyse. Unntak fra denne regelen er laget for fluer som vellykket lokalisert lukt kilde innenfor første 50 sek og er dermed lavere enn fartsgrensen lavere.
Fluer som ikke beveger seg gjennom alle fire kvadranter i arenaen og hodet rettfor maten kilde etter at rettssaken begynner blir avvist (figur 2d).
Fluer som veve mot og vekk fra maten kilde innenfor en 10 mm radius i minimum 50 sek anses å ha hell fant matkilde. Plottet viser avstanden av flue fra luktkilden over tid kan anvendes for å evaluere denne sjeldne tilfelle. Dette er det eneste eksempel på et vellykket søk som ikke registreres automatisk av den gjeldende dataanalyse makro og må manuelt bli detektert (fig. 2e)
Arenaer med synlige gjenstander i fly stilling spor blir avvist. Gjenstander kan skapes ved enhver hendelse der datainnsamling programvaren oppdager et objekt annet enn fly. De vises ofte som lange, rette linjer som spenner over arenaen eller stråler ut fra midten (Figur 2f).
I figur 3, voksne fluer sultet 18-24 hr utstillings en høyere olfactory følsomhet for mat relaterte lukt enn sine matet kolleger en. Et grafisk plott av den kumulative andelen av fluer som med hell finne en mat lukt kilde viser 30% av alle sultet fluer lykkes innenfor et 10 min vindu, i kontrast, bare 7% av alle matet fluer gjøre det (figur 3). Dette forsterket lukteatferdsresponsen er tidligere vist seg å kreve intakt antenner en. Unnlatelse av å observere en klar forskjell mellom fôret og sultet kontroll fluer i denne analysen kan løses ved å undersøke miljø oppdrett og teste forholdene.
En nyttig strategi for feilsøking testforhold er å undersøke om fluer er tiltrukket av flere andre enn lukt målet ved å måle fly tiltrekning til lukt kjøretøy, agarose signaler. Sultet fluene skal fremvise en vesentlig større tiltrekning til eddik enn til agarose kjøretøyet alene (figur 4b). Figur 4astiller resultater fra en mat-søk eksperiment som ble utført ved 32 ° C med en miljø-fuktighet på 35% ved hjelp av villtype fluer. I dette datasettet, ble ingen signifikant forskjell mellom fly tiltrekning til eddik og agarose kontroll oppdaget. Dette er sannsynligvis på grunn av en økende tiltrekning til vannet som finnes i agarose dråpe henhold varmere testtemperaturer. Ved å øke testing fuktighet til 50-60%, var vi i stand til å korrigere for dette atferds skift og gjenopprette den betydelige forskjellen mellom tiltrekning til eddik og agarose kjøretøy (Figur 4b, * betegner p-verdi <0,05).
Figur 1. En typisk analyseprogramvare dataoppsett illustrerer fly stilling over tid, fly avstand fra luktkilden over tid, og fly hastighet over tid. Tabellen 2 kolonne i øvre venstrehjørne av hver arena viser gjennomsnittlig hastighet (mm / sek) i løpet av første 50 sek (kolonne 1) og ventetiden for mat funn i sek (kolonne 2). I tillegg er navnet på den åpnet tekstfil lagt til nedre venstre hjørne (illustrert som "OZ120807_ORCODTKRi_1% _S4"). Klikk her for å se større figur .
Figur 2. Eksempler på ulike typer spor adressert i analysekriteriene A..) Fly som har vært inaktiv i 300 + sek er avvist. B.) Fly som har vært inaktive etter vellykket å finne mat er akseptert. C.) Fly som har vært inaktiv i 300 + sek, men viser høy aktivitet i minst 100 sek etter inaktiv periode er akseptert. D.) Fly th på hodet rett for matkilde etter løslatelsen blir avvist. E.) Fluer at veve mot og vekk fra maten kilde innenfor en 10 mm radius i minimum 50 sek anses å ha hell fant matkilde og er akseptert. F .) Arenas med synlige artefakter i oppsettet blir avvist. Klikk her for å se større figur .
Figur 3. Grafisk plott som viser en kumulativ andel av fôret og sultet fluer som finner lukt kilde over tid ved hjelp ventetid for mat å finne. (n = 88-96 fluer; * betegner p-verdi <0,05, ** betegner p-verdi <0,01).
ad/50801/50801fig4.jpg "/>
Figur 4. Feilsøking testforhold A) Grafisk plott som viser kumulativ andel av fluer som finner en% eddik eller agarose kjøretøy over tid. Ingen signifikant forskjell ble påvist i fly tiltrekning til enten lukt målet når testing forholdene var ved 32 ° C og 35% luftfuktighet (n = 62-94 fluer). B) Grafisk plott som viser kumulativ andel av fluer som finner en% eddik eller agarose kjøretøy over tid. Testforholdene var ved 32 ° C og 50-60% fuktighet. Under disse forholdene, fluer er betydelig mer tiltrukket av en% eddik enn til agarose kjøretøy (n = 55-71 fluer; * betegner p-verdi <0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen, beskriver vi en trinn-for-trinn prosedyre for maten søkeatferd analysen. I tillegg til matvarerelaterte lukt, kan den også tilpasses for studiet av flue evne til å lokalisere andre lukt gjenstander. For eksempel kan det brukes mot studiet av kompis lokalisering atferd hos hannfluer 3 Det er flere andre hensyn for denne protokollen som vi vil nevne her om denne prosedyren.:
Først bestemmer oppfostringen temperaturen hvor lenge eksperimentelle fluer bør være i alderen før testing. Det anbefales at en rekke aldre bli undersøkt for å bestemme den mest passende alder for forsøket. For eksempel, i vår erfaring, da steilet ved 21 ° C, forskjeller mellom fôret og sultet flue svarene er mest robust etter at de har vært i alderen 4-5 dager.
For det andre, lysdiodene lyser en glasskjerm plate som tjener til å opprette konstant, jevn belysning under the akryl kamre. Tilstrekkelig selv, er konstant, og lyse belysning kritisk for automatisert sporing av fly bevegelse. Flimrende lyskilder ujevn belysning eller kan føre til feil i automatisert sporing av flua som enten resultere i forbigående manglende evne til å oppdage fly posisjon eller føre til at programvare for å forveksle de lette gjenstander som fly. Vi har funnet både en kommersielt tilgjengelig LED baklys eller en tilpasset bygget LED array fungerer like godt i møte belysning behov for denne analysen.
Tredje, hvis programvaren oppdager feilaktig små endringer i belysning eller agarose som ekstra objekter, innstillingene objekt gjenkjenning i "Fly Tracking-Seks soner" oppkjøpet programvaren kan justeres for terskel samt objekt størrelse. Justere innstillingene deteksjons sikrer at det oppdages bare ett objekt i hver arena. Hvis du vil vise antall objekter som spores i hver arena, klikk på "terskel" kategorien i "Fly Tracking-Six Zones "oppkjøpet programvare. Hvis mer enn ett objekt spores, kan man justere Min Størrelse, Maks størrelse, Min Threshold, eller Max Terskel inntil oppdaget gjenstanden forsvinner.
Fjerde, fly aksjer som brukes i disse forsøkene bør isogenized. Behavioral forestillinger i dette paradigmet er svært følsomme for forskjeller i genetiske bakgrunn. Parret kvinner er vant til å redusere potensielle atferds variasjoner knyttet til parring status eller kjønn. Det er ingen grunn til å tro denne analysen vil ikke være like effektive i å studere atferden til menn eller jomfruelige kvinner.
For det femte bør silen være opphengt like over lyset diffusor-plate for å hindre lukt metning av lukt gradient (suspensjonen er ca 2 cm med vår kommersielt innkjøpt modell). Vi bruker kommersielt tilgjengelige sikter for å skape et porøst gulv under testplatene.
Til slutt, for å produsere pålitelige datasett, er konsistens som kreves i eksperimentelle oppdrett og testforhold. Unnlatelse av å se signifikante forskjeller mellom fôret og sultet responser i kontroll fluer kan løses ved å sjekke for å være sikker på en) fluer er alet opp under stabile temperatur-og fuktighetsforhold, er to) fluer matet med fersk mat og er ikke oppdratt i overfylte forhold, 3) nylig eclosed fly eksponering for CO 2 er minimert, 4) flyr erfaring samme lengde av sult, 5) fluer er testet under stabil temperatur og luftfuktighet, og 6) testmiljøet og kamre ikke er forurenset med lukt fra tidligere studier eller eksperimenter. I tillegg til de ovenfor nevnte parametre, er isogenization flue stocks viktig ettersom forskjellige genetiske bakgrunner kan påvirke fly ytelse i denne analysen. Videre, hvis eddik anvendes som luktkilde, forsiktighet må utvises for å sikre at det ikke mister sin styrke ved å holde den tett forseglet og lagret ved 4 ° C.
6 eller firefelt olfactometer 4,5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomisk interesse.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av forskningsmidler til JWW fra National Institute of Health (R01DK092640) og National Science Foundation (0.920.668).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Apple Cider Vinegar | Spectrum | commercially available | |
| Agarose, Type VII | Sigma-Aldrich | A0701 | low gelling temperature agarose |
| Acrylic Testing Plate | custom | Plate contains 6 arenas. Each arena is 60 mm in diameter 6 mm in height. See testing plate diagrams for specific measurements. | |
| LabVIEW V.8.5 | National Instruments | 776670-09 | platform for programs: PositioningTool.vi, FlyTracking--Six Zones.vi NOTE: "elapsed time.vi", "time into file.vi", and "two object detect.vi" are included subroutines that must be available in order for the main data acquisition program "FlyTracking--Six zones.vi" to run. |
| LabVIEW Vision 8.5 | |||
| LabVIEW Vision Acquisition Software 8.5 | |||
| LabVIEW Vision Builder AI 3.5 | |||
| Igor Pro V.6 | Wavemetric, Inc. | platform for macro: Data Analysis for Fly Tracking--Six Zones | |
| Basler scA1390-17fm | National Instruments | 779980-01 | Digital Camera NOTE: driver for camera available at Baslerweb.com |
| 8 mm lens | National Instruments | 780024-01 | Lens for Basler Digital Camera |
| Ground Glass Diffuser Plate | Edmund Optics | custom | Diffuses light, 25 cm x 30 cm |
| US Std. No. 100 | Fischer Scientific | 04-881X | Sieve with nominal opening of 150 μm |
| Lighting Option 1 | |||
| LED backlight 660 nm (20 cm x 20 cm) | Spectra West | BL47192 | a simpler but more expensive lighting option. |
| Power Supply for LED Backlight | Spectra West | ||
| Lighting Option 2 | |||
| 660 nm LEDs | Superbrightleds | RL5R1330 | Wavelength 660 nm (approximately 7 x 7 LED array for a 14.7 inch x 9.75 inch panel) |
| Linear DC Power Supply | GW Instek | GPS-1830D | Power supply for LED Panel |
| Solderless Breadboard | Digikey | 922354-ND | Breadboard for LEDs |
References
- Dethier, V. G. The hungry fly : a physiological study of the behavior associated with feeding. , Harvard University Press. (1976).
- Root, C. M., Ko, K. I., Jafari, A., Wang, J. W. Presynaptic facilitation by neuropeptide signaling mediates odor-driven food search. Cell. 145, 133-144 (2011).
- Root, C. M., et al. A presynaptic gain control mechanism fine-tunes olfactory behavior. Neuron. 59, 311-321 (2008).
- Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459, 218-223 (2009).
- Faucher, C., Forstreuter, M., Hilker, M., de Bruyne, M. Behavioral responses of Drosophila to biogenic levels of carbon dioxide depend on life-stage, sex and olfactory context. J. Exp. Biol. 209, 2739-2748 (2006).
- Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. Conditioned behavior in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 708-712 (1974).
- Fishilevich, E., Domingos, A. I., Asahina, K., Naef, F., Vosshall, L. B., Louis, M. Chemotaxis behavior mediated by single larval olfactory neurons in Drosophila. Curr. Biol. 15, 2086-2096 (2005).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454, 217-220 (2008).
- Kitamoto, T. Conditional modification of behavior in Drosophila by targeted expression of a temperature-sensitive shibire allele in defined neurons. J. Neurobiol. 47, 81-92 (2001).
- Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O'Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14, 341-351 (1995).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
