Summary
Neste artigo de vídeo, descrevemos um método automatizado para medir o efeito de fome ou saciedade em olfativo comportamento de busca de alimentos dependente na fruta Drosophila melanogaster mosca adulta.
Abstract
Para muitos animais, a fome promove mudanças no sistema olfativo de uma forma que facilita a busca de fontes de alimentos apropriados. Neste artigo de vídeo, descrevemos um método automatizado para medir o efeito de fome ou saciedade em olfativo comportamento de busca de alimentos dependente na fruta Drosophila melanogaster mosca adulta. Em uma caixa à prova de luz iluminado por uma luz vermelha que é invisível para as moscas de fruta, uma câmera ligada ao software de aquisição de dados personalizado monitora a posição de seis moscas simultaneamente. Cada mosca se limita a caminhar em arenas individuais contendo um odor de alimentos no centro. As arenas de ensaio repousar sobre um piso poroso que funciona para prevenir a acumulação de odor. A latência para localizar a fonte de odor, uma métrica que reflecte a sensibilidade olfactiva em diferentes estados fisiológicos, é determinada por análise de software. Aqui, discutimos os mecanismos críticos de executar este paradigma comportamental e abranger questões específicas sobre mosca loading, a contaminação odor, temperatura do ensaio, a qualidade dos dados e análise estatística.
Introduction
Unidos da fome promover dois tipos de comportamentos apetitivas: busca de alimentos e consumo de alimentos 1. Este ensaio comportamental simples é útil para o estudo de comportamentos quimiotáticos associados forrageamento 2,3. Especificamente, ele rastreia a posição da mosca, velocidade de caminhada e latência para localizar um alvo odor de alimentos. Latência de encontrar comida serve como métrica para medir as mudanças na sensibilidade do sistema de detecção de odor da mosca a jusante das alterações no seu estado appetitive interno. Uma versão manual deste ensaio foi utilizado anteriormente para mostrar a sinalização do receptor de GABA-B é importante para o comportamento odor localização em moscas adultas 3. A versão automatizada atual do ensaio foi fundamental para o estudo de como curto-neuropeptídeo F (SNPF) sinalização remodela o mapa olfativo em Drosophila e influências apetitivo comportamentos 2.
O teste é realizado a uma temperatura e humidade ambiente escuro, controlado. Digitalcâmeras de vídeo definidas acima das placas de teste de acrílico transparente controlar moscas backlit pelo 660-nm iluminação LED. Informações da câmara é processada em tempo real por um computador estacionado próximo à área de testes. Nós usamos o software de aquisição de dados para gravar e salvar as coordenadas de posições voar durante o período de testes.
Neste paradigma, o sujeito é liberado em uma arena que contém um odor de alimentos no centro, o objeto odor cria um gradiente de odor de alimentos dentro da arena, que induz o comportamento de busca de alimentos em tempo real. Um protocolo semelhante busca odor tem sido aplicado para o estudo de chemosensation em larvas Drosophila único 7. Enquanto outros ensaios comportamentais, tais como o de quatro campos olfatômetro 4,5 ou o t-labirinto 6 avaliar odor aversão ou atração comportamentos, este paradigma é o mais adequado para avaliar a sensibilidade e de quimiotaxia comportamentos olfativos.
Vários principais vantagens acompanhar esta assay. Primeiro, ele permite a aquisição rápida de grandes conjuntos de dados, porque a coleta de dados e análise são principalmente automatizado. Em segundo lugar, este ensaio isola e mede o comportamento das moscas individuais, eliminando, assim, os sinais sociais olfativos que podem influenciar seus comportamentos. Em terceiro lugar, a simplicidade do protocolo e design experimental simples fazer o teste eficiente e fácil de ensinar aos outros.
Além disso, este ensaio pode ser usado para investigar mais circuitos neurais subjacentes ao comportamento de busca de alimentos combinando-a com o grande conjunto de ferramentas genéticas disponíveis para Drosophila melanogaster 8. Expressão Targeted de transgenes que o silêncio ou excitar neurônios pode ser conseguido com ferramentas como o sistema GAL4-UAS, bem como o TS1 UAS-Shibire, UAS-tétano-toxina, e UAS-TRPA1 (B) transgenes 9-12.
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Protocol
1. Fly Recolha e fome
- Rear as moscas experimentais sob condições de temperatura e umidade controladas (por exemplo, 21 ° C, 50-60% de umidade relativa) em um ciclo claro / escuro de 12 horas.
- Colete feminino voa no dia da eclosão e colocá-los, juntamente com 4-5 machos, em novos frascos de alimentos (máximo de 30 por frasco). Idade voa de 2-5 dias.
- Prepare as câmaras, fly fome.
- Empurrar um único tecido (4,8 x 8,4 polegadas) para a parte inferior de um frasco de plástico vazio. Molhar o tecido com água destilada. Use um objeto para empurrar para baixo sobre o tecido e esprema delicadamente o excesso de água.
- Inverta o frasco para descartar a água extra. Deve haver água suficiente para manter as moscas hidratado e da câmara de fome úmido, mas não o suficiente para afogar as moscas.
- Transfira as moscas do frasco de comida em uma câmara de fome e ligar o frasco cerca de 18-24 horas antes do experimento começa. Armazenar ofrascos sob condições de temperatura e humidade controladas durante a noite até que o experimento começa no dia seguinte.
2. Preparação do Odor Alimentação
- Prepara-se uma solução de agarose a 1% através da adição de 0,1 g de agarose de baixa temperatura de fusão de 10 ml de água destilada em um balão de vidro. Aquecer a solução de agarose em um forno de microondas apenas até que comece a ferver, mas bem antes que ferve.
- Pare o microondas e agite o frasco uma vez. Repita este passo mais duas vezes até que a agarose foi completamente dissolvido. Manter a solução de agarose, num estado líquido, mantendo o frasco quente numa placa de aquecimento fixada em 50 ° C.
- Adicionar 990 mL da solução de agarose a 1% e 10 ml de vinagre de maçã para um tubo de 1,5 ml Eppendorf para fazer uma solução de 1% de vinagre de maçã. Vortex a solução até mista e coloque em uma incubadora de banho seco definido como 50 ° C.
3. Quarto Testing and Behavior Setup Câmara
- Ligue o painel de LED (660 nm).
- Lavar as peneiras e placas de teste com água quente e aquecê-los em um forno de secagem até que toda a umidade evapore. Arrefecer as peneiras e placas para baixo para a temperatura ambiente de testes antes dos experimentos iniciais.
- Posicionar um prato raso na parte superior da placa difusora e enchê-lo com água para aumentar a humidade local e para mascarar a água na gota de agarose.
- Posicione as peneiras sobre o prato de água.
4. Voar Carregando nas placas de teste
Diagramas com especificações para placas de teste pode ser encontrada na seção de arquivos complementares. A placa de teste é feita de acrílico transparente e é composto por 6 arenas de teste. Um controle deslizante simples contém câmaras de exploração que permitem o carregamento mosca, a contenção temporária e lançamento simultâneo de 6 moscas em suas respectivas câmaras emo início da experiência. -Mira gravadas no centro de cada área na placa indicar onde odorantes deve ser pipetada.
- Insira os controles deslizantes para a placa de testes de acrílico.
- Deslize suavemente o aspirador para o frasco após o tampão de algodão e permitir que cerca de 6 moscas para entrar no aspirator.it é fundamental para ser o mais suave possível em manuseá-los. Pode-se tirar proveito do comportamento da mosca fototáxico para induzir moscas a rastejar em direção ao aspirador, apontando a abertura do frasco para uma fonte de luz fraca. Se necessário, pode-se também aplicar sucção suave para aspirar aproximadamente 6 moscas do sexo feminino.
- Inserir a extremidade do aspirador no primeiro orifício da placa de teste. Permitir uma única mosca passar para a cela e gentilmente avançar o controle deslizante para a frente para carregar uma mosca para o próximo buraco. Continue até que todos os 6 moscas ocupam celas da placa.
- Pipetar 5 ul de solução de agarose de vinagre de cidra de maçã 1% directamente sobre o centro da crOSS-pêlos na face interior da placa de teste.
5. Posicionando a placa de teste
- Para centralizar a placa de teste, abra o arquivo chamado "Posicionamento Tool.vi." "LabVIEW VI para o posicionamento da ferramenta. vi podem ser encontrados na seção Arquivos Suplementar. Execute o arquivo, clicando na seta branca no canto superior esquerdo da tela.
- Colocar a placa de teste no topo do crivo de modo a que a área de abertura voltada para o chão peneira e o alvo é o odor no tecto da placa. Alinhe a mira gravado em volta da placa de teste com a mira na tela do monitor.
- Quando o alinhamento tenha sido concluída, abortar a execução clicando no ponto vermelho localizado perto do canto superior esquerdo do monitor.
6. Registre o Fly Posição durante o experimento
- Para acompanhar e registrar as coordenadas da mosca durante cada tentativa de busca de alimentos, abra o arquivo de software de aquisição de "Fly Tracking - Seis Zones.vi "LabVIEW VIs para" Fly Tracking -. Seis Zones.vi "pode ser encontrado na seção Arquivos Suplementar Execute o arquivo, clicando na seta branca no canto superior esquerdo do monitor. .
- Atribua um nome ao arquivo e clique em "OK".
- Avance os controles deslizantes nas câmaras de teste para liberar as moscas nas arenas de teste. Tenha cuidado para não mover as câmaras de teste, pois isso levará a alinhamento impróprio com coordenadas de software de análise.
- Clique em "Start" (gravação começa) e garantir que a única fonte de luz na câmara de teste é o painel de LED a 660 nm.
- Quando o julgamento for concluído, retire a peneira e câmara de comportamento. Levante a placa de testes da peneira e remover as moscas, submergindo a placa de gelo. Limpe suavemente a placa com água quente e remover todos os detritos de agarose. Colocar as placas de ensaio em uma estufa de secagem para remover a humidade.
- Ventile a área de teste, rodando em um small fã durante cerca de 2 min. Gire o ventilador desligado e carregar o próximo grupo de moscas na próxima placa de teste.
7. Análise de Dados Utilizando Software
"Análise de Dados para Fly rastreamento em seis zonas" podem ser encontrados na seção Arquivos Suplementar. Durante a aquisição de dados, coordena o programa de aquisição de registros de posição mosca individual para cada ponto de tempo em um arquivo de texto. A única câmera digital posicionada acima das placas de teste adquire imagens com uma taxa de quadros de 0,5 Hz. O programa de software de análise de "Análise de Dados para a mosca-Tracking seis zonas" extrai informações a partir desse arquivo de texto para a) calcular a velocidade média, b) determinar o ponto de tempo em que uma mosca localizado com sucesso a fonte odor, e c) construir janelas gráficas que permitem que o usuário vista: localização, distância da mosca voar a partir da fonte odor ao longo do tempo e velocidade média mosca ao longo do tempo. Ele também formata os dados para facilitar a exportação em um spreprograma adsheet. Nesta macro, a latência de pesquisa alimento é definida como o ponto temporal em que voa passar, pelo menos, 5 segundos dentro de um raio de 5 mm acima do centro da arena.
- Abra o arquivo de software de análise de "Análise de Dados para Fly Tracking - seis zonas". Na aba "Windows", clique em "Create New Table". Repita este passo até seis mesas foram criadas.
- Na guia "macros", clique em "Foodfinding". Um painel principal deve aparecer com as seguintes opções: Open Data Arquivo primas para layout; Open Data Arquivo primas para arquivo de dados; Fly Localização; Distância; velocidade; layout; FormatDataFile.
- Para visualizar os dados brutos, sem acréscimo de valores em um arquivo de texto, clique em "Abrir arquivo de dados brutos para o Layout." Localize e selecione o arquivo de dados experimental na janela do navegador que aparece. Clique em "Abrir".
- Clique em "Fly Location" para ver a localização de cada mosca em cada uma das seis arenas (seis parcelas XY retratando cada mosca 's posição ao longo do tempo deve aparecer na tela).
- Clique em "Distância" para ver a distância de cada mosca da fonte de odor (seis parcelas retratando distância da mosca da fonte de odor ao longo do tempo deve aparecer na tela). A linha horizontal em y 5 mm indica o limiar para o qual a mosca é considerado para ser localizado na fonte de alimento.
- Clique em "Speed" para ver a velocidade média de cada mosca durante o julgamento (seis parcelas retratando a velocidade da mosca ao longo do tempo deve aparecer na tela).
- Clique em "Layout" para exibir um layout com todos os localização mosca, distância, velocidade e gráficos, além de a velocidade média (durante os primeiros 50 seg) e latência de encontrar a fonte de odor para cada mosca (Figura 1). Para visualizar adequadamente a disposição, pode ser necessário ajustar as margens. Para fazer isso, primeiro clique na janela de layout. Sob a guia "Arquivo", clique em "Configurar Página para Layout." Repor as margens para0,2 polegadas e clique em "OK". Imediatamente deixou de cada parcela localização é uma pequena mesa com os títulos de "Speed" e "Latência". Os valores inseridos em cada ponto indicam a velocidade média em mm / seg e pesquisa de alimentos latência em segundos. Entradas em branco sob Latência indicam a mosca não conseguiu localizar a fonte de odor. Alimentação latência de pesquisa é definido como o ponto no tempo em que as moscas passou pelo menos 5 segundos dentro de um raio de 5 mm a partir do centro da câmara.
- Para imprimir um layout, clique na área de layout (atualizações de layout para o arquivo atual). Clique em "Arquivo" e depois clique em "Layout de impressão."
- Para visualizar o próximo arquivo, basta clicar em "Abrir Arquivo de Dados-prima para Layout." Clique no seguinte arquivo de dados brutos que você deseja ver e clique em "OK". Clique na janela de Layout para atualizar a janela com o novo arquivo de dados.
- As configurações podem ser salvos em um arquivo de experimento para uso posterior.
8. Exportar dados deo software de análise de dados para um programa de planilha
- Para exportar dados de velocidade e latência para cada arquivo, clique em "Open Data Arquivo primas para arquivo de dados." Selecione um arquivo de dados experimentais e clique em "Abrir". Uma nova janela do navegador aparecerá.
- Na nova janela do navegador, clique com o botão direito em "Novo" e depois clique em "Documento de texto." Nome do novo documento de texto. Selecione o arquivo de texto recém-nomeado e clique em "Abrir". Ele armazena os dados do arquivo de dados brutos para o arquivo de texto.
- Para exportar dados de outro arquivo, clique em "Abrir Arquivo de Dados-prima para arquivo de dados." Clique em outro arquivo e clique em "Abrir". Selecione o arquivo de texto a partir do passo 8.2). Continue esse processo para os arquivos de dados restantes que deseja exportar.
- Uma vez que todos os arquivos de dados desejadas tenham sido adicionadas ao arquivo de texto, clique em "Formato de Arquivo de Dados." Selecione o documento de texto usado para armazenar os dados dos passos anteriores e clique em "Abrir" (um novo window irá abrir automaticamente).
- Crie um novo documento de texto na janela, atribuir um nome ao arquivo e clique em "Salvar". Isso cria um arquivo de texto que contém o nome do arquivo, velocidade média, e latência para cada voar e pode ser importado para um programa de planilha.
- Parcelas cumulativas são construídos a partir de dados sobre o número total de moscas que atingem o alvo odor de alimentos como uma função do tempo (Figura 3).
- Conjuntos de dados experimentais são analisados para significância estatística usando um teste z para proporções.
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Representative Results
O software de análise de dados e a disposição, um exemplo dos quais pode ser visto na Figura 1, são utilizados para avaliar o desempenho de cada mosca durante a sua 10 min ensaio de acordo com um conjunto de critérios de análise. Os seguintes critérios são utilizados para determinar se os dados de cada mosca serão utilizados para análise de dados e são projetados para eliminar as moscas que não são capazes de realizar a tarefa de busca de alimentos, devido a lesão, doença, estresse ou falta de motivação.
As moscas que estão inativas por mais de 300 segundos são considerados 'inativo' e são rejeitadas a partir do conjunto de dados, a menos que a) já conseguiram localizar a fonte de alimento ou b) exibem uma velocidade média> 10 mm / s, pelo menos, 100 sec após o período inactivo (Figuras 2a, 2b, 2c).
Moscas saudáveis apresentam um comportamento de busca robusta imediatamente após a libertação de suas câmaras de retenção. Assim, para selecionar apenas as moscas queapresentam velocidades saudáveis durante os primeiros estágios da pesquisa odor ativo, só voa esse movimento dentro de uma determinada gama de velocidades para os primeiros 50 segundos do julgamento são aceitos para análise de dados. Este critério é baseado em nossas observações de que a) como moscas, perto da fonte de odor, a sua velocidade diminuir e b) algumas moscas alcançar a meta odor dentro dos primeiros 50 segundos do ensaio. Os critérios de velocidade são determinadas pela avaliação das velocidades médias de, pelo menos, 100 moscas de controlo a uma dada temperatura experimental. Os limites de velocidade / baixa superiores são definidos pela velocidade média + / - desvio padrão, respectivamente. Por exemplo, a 21 ° C, só voa esse movimento entre 3,5-10,5 mm / s nos primeiros 50 segundos do julgamento são utilizados para a análise de dados. Exceções a essa regra são feitos para moscas que localizados com sucesso a fonte odor dentro dos primeiros 50 segundos e são, portanto, mais lento do que o limite de velocidade mais baixo.
As moscas que não se movem através de todos os quatro quadrantes na arena e siga em frentepara a fonte de alimentação após o julgamento começa são rejeitados (Figura 2d).
As moscas que tecem na direcção e para longe da fonte de alimento dentro de um raio de 10 mm para um mínimo de 50 segundos são considerados ter encontrado com êxito a fonte de alimento. O gráfico que ilustra a distância da mosca da fonte de aroma ao longo do tempo pode ser utilizado para avaliar um caso raro. Esta é a única instância de uma busca bem-sucedida que não é detectado automaticamente pelo macro de análise de dados atual e deve ser detectado manualmente (Figura 2e)
Arenas com artefatos visíveis na posição fly traço são rejeitados. Artefatos podem ser criadas por qualquer evento em que o software de aquisição de dados detecta um objeto que não seja o real. Eles muitas vezes aparecem, linhas retas, desde que se estendem por toda a arena ou irradiam a partir do seu centro (Figura 2f).
Na Figura 3, as moscas adultas esfomeados 18-24 h exposição a o maiorsensibilidade aos odores lfactory relacionadas com a alimentação do que suas contrapartes FED 1. A representação gráfica do percentual acumulado de moscas que conseguir localizar a fonte de odor de alimentos mostra 30% de todas as moscas famintas ter sucesso dentro de uma janela de 10 minutos, em contraste, apenas 7% de todas as moscas alimentados fazê-lo (Figura 3). Esta resposta comportamental olfativo elevada tem sido mostrado previamente para exigir antenas intactas 1. A não observância uma clara diferença entre alimentado e fome moscas controle neste ensaio pode ser resolvido através da análise ambiental e criação de testar condições.
Uma estratégia útil para condições de teste solução de problemas é examinar se as moscas são atraídas por outras do que a meta odor medindo mosca atração para o veículo odor, agarose pistas adicionais. Moscas esfomeados deve apresentar uma significativamente maior do que o vinagre de atracção para o veículo sozinho de agarose (Figura 4b). Figura 4aexibe resultados de uma experiência de pesquisa de alimentos que foi realizada a 32 ° C com uma humidade ambiente de 35% utilizando as moscas de tipo selvagem. Neste conjunto de dados, não foi detectada nenhuma diferença significativa entre mosca atração para o vinagre eo controle de agarose. Isto é provavelmente devido a um aumento da atracção para a água encontrada na gotícula de agarose sob temperaturas de teste mais quentes. Ao aumentar os testes de umidade para 50-60%, fomos capazes de corrigir essa mudança comportamental e restaurar a diferença significativa entre a atração vinagre eo veículo agarose (Figura 4b, * significa p <0,05).
Figura 1. Um layout típico de dados software de análise ilustra a posição voar ao longo do tempo, distância voar a partir de fonte de odor ao longo do tempo, ea velocidade voar ao longo do tempo. A tabela 2 da coluna na parte superior esquerdacanto de cada arena exibe a velocidade média (mm / s) durante os primeiros 50 segundos (coluna 1) ea latência de encontrar alimentos em segundos (coluna 2). Além disso, o nome do arquivo de texto aberto é anexado ao canto inferior esquerdo (ilustrado como "OZ120807_ORCODTKRi_1% _S4"). Clique aqui para ver maior figura .
Figura 2. Exemplos de diferentes tipos de traços abordados em critérios de análise. Uma.) Fly que ficou inativo por 300 + sec é rejeitada. B). Fly que ficou inativo depois de localizar com sucesso alimento é aceito. C). Fly que ficou inativo por 300 + sec, mas mostra a atividade robusta para pelo menos 100 segundos após o período inativo é aceito. D). Voar ª no vai direto para a fonte de alimento após o lançamento é rejeitada. E). moscas que tecer direção e longe da fonte de alimento dentro de um raio de 10 mm para um mínimo de 50 segundos são considerados ter encontrado com sucesso a fonte de alimento e são aceitos. F .) Arenas com resultados visíveis no layout são rejeitados. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 3. Representação gráfica mostrando um percentual acumulado de moscas alimentados e esfomeados que encontrar fonte de odor ao longo do tempo usando a latência de encontrar comida. (n = 88-96 moscas; * denota valor-p <0,05, ** denota valor-p <0,01).
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Figura 4. Condições de teste Troubleshooting A) representação gráfica mostrando percentual acumulado de moscas que encontrar vinagre 1% ou veículo agarose ao longo do tempo. Nenhuma diferença significativa foi detectada na mosca atração a qualquer alvo odor quando as condições de teste foram a 32 ° C e 35% de umidade (n = 62-94 moscas). B) representação gráfica mostrando percentual acumulado de moscas que encontrar vinagre 1% ou veículo agarose ao longo do tempo. Condições de ensaio eram de 32 ° C e 50-60% de humidade. Sob estas condições, as moscas são atraídas para significativamente mais 1% de vinagre para o veículo de agarose (n = 55-71 moscas, * indica p <0,05).
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Discussion
Neste protocolo, descrevemos um procedimento passo-a-passo para o ensaio de comportamento de busca de alimentos. Além de odores alimentares relacionados com, mas também pode ser adaptada para o estudo da capacidade de voar para localizar outros objectos de odor. Por exemplo, ele pode ser aplicado para o estudo do comportamento de localização mate em moscas macho 3 Há várias considerações adicionais para este protocolo que vamos mencionar aqui em relação a este procedimento.:
Em primeiro lugar, a temperatura criação determina quanto tempo as moscas experimentais deve ser envelhecido antes do teste. Recomenda-se que a gama de idades ser examinado para determinar a idade mais apropriada para o experimento. Por exemplo, na nossa experiência, quando criadas a 21 ° C, as diferenças entre as respostas de moscas alimentados e em jejum são mais robustas, depois de terem sido envelhecido 4-5 dias.
Em segundo lugar, os LEDs iluminam um prato difusor de vidro que serve para criar constante, mesmo sob iluminação ªcâmaras e acrílicos. Suficientemente mesmo, iluminação constante e brilhante é fundamental para o monitoramento automatizado de movimento da mosca. Iluminação desigual ou cintilante fontes de luz pode levar a erros de rastreamento automático da mosca que, ou resultar em incapacidade intermitente para detectar a posição da mosca ou fazer com que o software para confundir os artefatos leves como a mosca. Nós encontramos tanto uma luz de fundo LED disponível no mercado ou um costume construído trabalho conjunto LED igualmente bem em atender às necessidades de iluminação para este ensaio.
Em terceiro lugar, se o software erroneamente detecta pequenas mudanças na iluminação e objetos de agarose, como extras, as configurações de detecção de objetos no software de aquisição de "Fly Tracking de seis zonas" pode ser ajustado para o limite, assim como o tamanho do objeto. Ajustar as definições de detecção garante que apenas um objeto é detectado em cada arena. Para visualizar o número de objetos que estão sendo monitorados em cada arena, clique na guia "Threshold" do "Fly Rastreamento-Six Zones "software de aquisição. Se mais de um objeto está sendo monitorado, pode-se ajustar o tamanho Min, Max Size, Min Threshold, ou Max Threshold até que o artefato detectado desaparece.
Em quarto lugar, voar estoques utilizados nestes experimentos devem ser isogenized. Performances comportamentais neste paradigma são altamente sensíveis às diferenças nas origens genéticas. Fêmeas acasaladas são usados para reduzir o potencial de variabilidade comportamental associada com o estado de acasalamento ou sexo. Não há razão para acreditar que este ensaio não seria igualmente eficaz em estudar o comportamento de machos ou fêmeas virgens.
Em quinto lugar, o crivo devem ser suspensos ligeiramente acima da placa difusora de luz para evitar a saturação de odor do gradiente de odor (a suspensão é de aproximadamente 2 cm de altura com o nosso modelo adquirido comercialmente). Usamos peneiras disponíveis comercialmente para criar um pavimento poroso por baixo das placas de ensaio.
Finalmente, a fim de produzir dados fiáveisconjuntos, a consistência é necessário em condições de criação e testes experimentais. Qualquer falha em ver diferenças significativas entre as respostas do Fed e fome em moscas de controle pode ser resolvido através da verificação para certificar-se 1) moscas são criadas em condições de temperatura e umidade estáveis, 2) as moscas são alimentados com alimentos frescos e não são criados em condições de superlotação, 3) recém eclosed voar exposição ao CO 2 é minimizado, 4) voa experiência o mesmo período de inanição, 5) as moscas são testados sob condições de temperatura e umidade estáveis e 6), o ambiente de teste e as câmaras não estão contaminados com odores de estudos anteriores ou experiências. Além dos parâmetros acima mencionados, isogenization de estoques de moscas é importante porque diferentes origens genéticas podem influenciar o desempenho mosca neste ensaio. Além disso, se o vinagre é utilizado como a fonte de odor, deve ser tomado cuidado para assegurar que não perca a sua potência, mantendo-o hermeticamente selado e armazenado a 4 ° C.
t-6 labirinto ou a quatro campos olfactómetro 4,5.
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Disclosures
Os autores declaram que não há interesse financeiro concorrente.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por bolsas de investigação para JWW do Instituto Nacional de Saúde (R01DK092640) e National Science Foundation (0.920.668).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Apple Cider Vinegar | Spectrum | commercially available | |
| Agarose, Type VII | Sigma-Aldrich | A0701 | low gelling temperature agarose |
| Acrylic Testing Plate | custom | Plate contains 6 arenas. Each arena is 60 mm in diameter 6 mm in height. See testing plate diagrams for specific measurements. | |
| LabVIEW V.8.5 | National Instruments | 776670-09 | platform for programs: PositioningTool.vi, FlyTracking--Six Zones.vi NOTE: "elapsed time.vi", "time into file.vi", and "two object detect.vi" are included subroutines that must be available in order for the main data acquisition program "FlyTracking--Six zones.vi" to run. |
| LabVIEW Vision 8.5 | |||
| LabVIEW Vision Acquisition Software 8.5 | |||
| LabVIEW Vision Builder AI 3.5 | |||
| Igor Pro V.6 | Wavemetric, Inc. | platform for macro: Data Analysis for Fly Tracking--Six Zones | |
| Basler scA1390-17fm | National Instruments | 779980-01 | Digital Camera NOTE: driver for camera available at Baslerweb.com |
| 8 mm lens | National Instruments | 780024-01 | Lens for Basler Digital Camera |
| Ground Glass Diffuser Plate | Edmund Optics | custom | Diffuses light, 25 cm x 30 cm |
| US Std. No. 100 | Fischer Scientific | 04-881X | Sieve with nominal opening of 150 μm |
| Lighting Option 1 | |||
| LED backlight 660 nm (20 cm x 20 cm) | Spectra West | BL47192 | a simpler but more expensive lighting option. |
| Power Supply for LED Backlight | Spectra West | ||
| Lighting Option 2 | |||
| 660 nm LEDs | Superbrightleds | RL5R1330 | Wavelength 660 nm (approximately 7 x 7 LED array for a 14.7 inch x 9.75 inch panel) |
| Linear DC Power Supply | GW Instek | GPS-1830D | Power supply for LED Panel |
| Solderless Breadboard | Digikey | 922354-ND | Breadboard for LEDs |
References
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