Summary
भ्रूण संस्कृतियों में उपयोग सीरम विशेष रूप से संकेत बातचीत शामिल अध्ययन में प्रयोगों के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं कि अज्ञात घटक शामिल हैं. यहाँ हम एक सीरम मुक्त ऑक्सीजन संस्कृति प्रणाली का उपयोग किया और 16-40 घंटे के लिए सुसंस्कृत मध्य हमल माउस भ्रूण गर्भ में भ्रूण के विकास के लिए तुलनीय रूपात्मक विकास दिखा रहे हैं दिखा.
Abstract
मध्य हमल चरण माउस भ्रूण एक oxygenated रोलिंग बोतल संस्कृति प्रणाली में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्टेम सेल मीडिया की खुराक से तैयार एक सीरम मुक्त मध्यम संस्कृति के उपयोग सुसंस्कृत थे. E10.5 पर माउस भ्रूण ध्यान से बरकरार जर्दी थैली के साथ गर्भाशय से अलग थे और जर्दी थैली के साथ भ्रूण की नाड़ी निरंतरता बनाए रखते हुए सटीक शल्य पैंतरेबाज़ी शामिल प्रक्रिया में भ्रूण धीरे जर्दी थैली से exteriorized गया. बरकरार जर्दी थैली के साथ या हटाया जर्दी थैली के साथ तैयार भ्रूण की तुलना में, इन भ्रूण बेहतर जीवित रहने की दर और इसी तरह की परिस्थितियों में सुसंस्कृत जब विकास की प्रगति का प्रदर्शन किया. हम इन माउस भ्रूण, जब 16-40 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 95% हे एक रोलिंग बोतल संस्कृति तंत्र में 2/5% सीओ 2 के माहौल में एक परिभाषित मध्यम में संवर्धित करने के लिए तुलनीय रूपात्मक वृद्धि और विकास का प्रदर्शन चलता है कि भ्रूण गर्भ में विकसित करने. हम वें विश्वासविधि भ्रूण जीवोत्पत्ति में महत्वपूर्ण संकेत बातचीत का अध्ययन करने के लिए पूरे भ्रूण संस्कृति का उपयोग करने की आवश्यकता होगी, जांचकर्ताओं के लिए उपयोगी हो जाएगा है.
Introduction
इन विट्रो में पूरे भ्रूण का उपयोग संस्कृति तरीकों utero में उपयोग करने के लिए नहीं तो मुश्किल हो जाता है कि भ्रूण जीवोत्पत्ति में शामिल तंत्र संकेत अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं. पूरे भ्रूण ऊतक अखंडता प्रदान करने और आवश्यक तंत्र संकेत के समय पर घटना के लिए महत्वपूर्ण हैं कि ऊतक बातचीत के लिए उचित समर्थन जीवोत्पत्ति के दौरान अलग सेलुलर प्रक्रियाओं के लिए. पूरे भ्रूण संस्कृतियों आदि प्रत्यारोपण के अध्ययन, आनुवंशिक और ऊतक जोड़तोड़, मनका आरोपण पढ़ाई, विषाक्तता अध्ययन, के रूप में आवेदन के ढेर के लिए एक मंच प्रदान करता है., वर्तमान में उपयोग भ्रूण संस्कृति प्रणालियों भ्रूण के समुचित विकास और रखरखाव के लिए सीरम पर मुख्य रूप से निर्भर हैं संस्कृति 1-9 में.
सीरम संस्कृति मीडिया में 6-8, 10, 11 के 10-100% से लेकर प्रमुख घटकों में से एक के रूप में उपयोग किया गया है.हालांकि, सीरम की रचना अच्छी तरह से परिभाषित नहीं है और पशुओं को पशु से अलग कर सकते हैं और हर बार सीरम एकत्र किया जाता है. सीरम की प्रयोगशाला तैयारी समय लगता है और कड़े प्रक्रियाओं शामिल है, की खरीद सीरम व्यावसायिक रूप से अलग बहुत सारे के बीच काफी परिवर्तनशीलता दर्शाती है और प्रयोगात्मक लागत को जन्म देती है. इन करने के लिए जोड़ा गया, सीरम इस तरह के संभावित कुछ प्रयोगों के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं जो वृद्धि कारकों, हार्मोन, या अन्य प्रोटीन, ऊतक बातचीत में महत्वपूर्ण संकेतन अणुओं का अध्ययन शामिल है कि विशेष रूप से उन लोगों के रूप में अज्ञात कारणों हो सकते हैं. अध्ययन संस्कृति के लिए सीरम के अलावा संभवतः ऐसे चक्रीय adenosine monophosphate (शिविर) और mitogenic संकेतन और phosphoinositide 3 में शामिल प्रोटीन (पीआई) 3-kinase रास्ते 12-14 संकेत के रूप में कुछ संकेतन अणुओं के intracellular स्तर को बदल सकते हैं कि पता चला है. इन के विपरीत, एक सीरम मुक्त संस्कृति प्रणाली, प्रतिजन मुक्त वातावरण का लाभ प्रदान करता हैसेलुलर प्रक्रियाओं को बदलने और कर सकते हैं कि जैविक रूप से सक्रिय एंजाइमों से संयम प्रयोगों के बीच स्थिरता सक्षम बनाता है.
अध्ययन में मौजूद है, हम 37 में 95% ओ एक रोलिंग बोतल संस्कृति तंत्र में 2/5% सीओ 2 के माहौल में संस्कृति के मध्य हमल चरण पूरे भ्रूण को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्टेम सेल मीडिया की खुराक से तैयार एक सीरम मुक्त संस्कृति के माध्यम से उपयोग सी 15,16 °. इन परिभाषित परिस्थितियों में 16-40 घंटे के लिए सभ्य माउस भ्रूण सेलुलर प्रसार, प्रवास, भेदभाव और ऊतक बातचीत के उचित स्तर का संकेत ऐसे दिल, अंग, मस्तिष्क और आंखों के रूप में समग्र भ्रूण शरीर और विभिन्न योजनाओं के रूपात्मक विकास में प्रगति का प्रदर्शन किया. ऐसी आंख के रूप में जटिल अंग प्रणालियों में से एक के लिए संस्कृति में भ्रूण के विकास के आण्विक विश्लेषण embr में नेत्र ऊतक में मनाया उस के साथ लगातार हो आंख का विकास का पता चलाYos (तैयारी में, Kalaskar और लॉडरडेल) utero में विकास. इस प्रकार हम मध्य हमल चरण में सभ्य माउस भ्रूण गर्भ में भ्रूण के विकास में मनाया बराबर प्रगतिशील विकास और रूपात्मक विकास दिखा रहे हैं दिखा.
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Protocol
माउस भ्रूण संस्कृति:
सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं की समीक्षा की और जारी रखा विनियामक निरीक्षण रखता है जो जॉर्जिया संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति, विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था, जो प्रोटोकॉल # A2010 07-119, निम्न स्वास्थ्य के दिशा निर्देशों के राष्ट्रीय संस्थानों के साथ सख्त अनुसार आयोजित की गई.
1. संस्कृति मीडिया की तैयारी
- पीटा DMEM, पीटा सीरम रिप्लेसमेंट (एस आर) (10%), एन 2 अनुपूरक (1x), albumin, गोजातीय सीरम से (2%), पेनिसिलीन (: निम्न मात्रा में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्टेम सेल मीडिया और खुराक का उपयोग संस्कृति के माध्यम तैयार 50 आइयू / एमएल), स्ट्रेप्टोमाइसिन (50 माइक्रोग्राम / एमएल) और Amphotericin बी (1.25 माइक्रोग्राम / एमएल). तैयार संस्कृति के माध्यम कि पहले से निम्न बदलावों के साथ 15 में वर्णित के समान है: विरोधी mycotics के अलावा और विशिष्ट अभिकर्मकों और उपकरणों की जानकारी के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के दो बार एकाग्रता (ली देखने का उपयोगमाल की अनुसूचित जनजाति).
नोट: पहले से इस्तेमाल किया (. मूर स्कॉट, एट अल 15) के रूप में एंटीबायोटिक एकाग्रता भ्रूण संस्कृतियों 24 घंटा समय अवधि के लिए किया जाता है के लिए पर्याप्त था. संस्कृति 24 घंटे से परे जारी किया गया था हालांकि, जब हम संस्कृति के प्रदूषण का अनुभव है और इस सफलतापूर्वक एंटीबायोटिक एकाग्रता दोहरीकरण से नियंत्रित किया गया. - 4 डिग्री सेल्सियस या निर्माता की सिफारिशों के अनुसार -20 डिग्री सेल्सियस पर मीडिया घटकों स्टोर. एस आर और एन 2 अनुपूरक दोहराया ठंड और विगलन से बचने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots में संग्रहित किया जाना चाहिए. एक बार खोला पीटा DMEM निर्माता की सिफारिश के अनुसार 30 दिनों के भीतर उपयोग किया जाना चाहिए. उपयोग करने से पहले, 37 डिग्री सेल्सियस के लिए एक पानी के स्नान में घटकों गर्म
- बाँझ शर्तों के तहत मीडिया को तैयार है. सभी उपकरण और संस्कृति हुड में उन्हें रखने से पहले 70% शराब स्प्रे के साथ मीडिया घटकों से युक्त बोतलों की सतह कीटाणुरहित.
- मीडिया घटकों एक बाँझ बीकर में या सीधे फिल्टर प्रणाली (Corning) में या तो मिलाया जा सकता है. पहले पीटा DMEM को एल्बुमिन पाउडर डालें. एल्बुमिन पूरी तरह घुल तक धीरे झटकों से अच्छी तरह मिक्स. तब N-2 अनुपूरक, एस आर और एंटीबायोटिक दवाओं को जोड़ने और एक pipettor का उपयोग अच्छी तरह मिक्स. तो वैक्यूम सक्शन साथ 0.22 सुक्ष्ममापी ताकना आकार फिल्टर का उपयोग कर मीडिया बाँझ फिल्टर. इस्तेमाल किया जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और दुकान में मीडिया बांटना. एक बार तैयार मीडिया संस्कृति के लिए 4-5 दिनों के भीतर किया जाना चाहिए.
2. संस्कृति यंत्र की तैयारी
- कांच संस्कृति की बोतलें और रबर corks जीवाणुरहित. एक एल्यूमीनियम पन्नी में संस्कृति की बोतलें लपेटें और एक पानी बीकर में रबर बोतल corks जगह और autoclaving द्वारा बाँझ.
- संस्कृति शुरू करने से पहले 70% शराब स्प्रे और गर्म 37 डिग्री सेल्सियस के साथ संस्कृति कक्ष (प्रेसिजन मशीन यूनिट) जीवाणुरहित. संस्कृति कक्ष ई हैसंस्कृति की बोतलें रखती है जो केंद्र में एक रोलिंग डिस्क के साथ चुटकी ली. चेंबर में गैस प्रवाह एक दबाव नापने का यंत्र द्वारा नियंत्रित किया जाता है और प्रवाह की दर अंत में एक ग्लास ट्यूब में पानी के माध्यम से हवा के बुलबुले की बहिर्वाह देख द्वारा समायोजित किया जा सकता. इस रोलिंग बोतल संस्कृति तंत्र नई और Cockroft 17 द्वारा शुरू की मूल उपकरण का एक संशोधित संस्करण है.
- संस्कृति चैम्बर के लिए 95% 2 हे / 5% सीओ 2 के एक गैस मिश्रण युक्त गैस सिलेंडर कनेक्ट और 50 सीसी / मिनट की एक प्रवाह दर देता है और पर्याप्त ऑक्सीजन की आपूर्ति सुनिश्चित करता है जो "प्रति सेकंड एक हवाई बुलबुले" के लिए गैस के प्रवाह को समायोजित संस्कृति भ्रूण को.
3. माउस भ्रूण संग्रह और संस्कृति के लिए तैयार
- जंगली प्रकार माउस भ्रूण प्राप्त करने के लिए, हम C57BL/6J और CD-1 (चार्ल्स नदी प्रयोगशालाओं) आनुवंशिक पृष्ठभूमि उपभेदों के चूहों का उपयोग किया.
- हर दिन सुबह योनि प्लग के लिए मादा चूहों की जाँच करें. वें ढूँढने के दिन दोपहरई योनि प्लग E0.5 डीपीसी (दिनों सहवास पोस्ट) के रूप में माना जाना चाहिए.
- मानक प्रोटोकॉल का पालन गर्भवती चूहों euthanizing से E10.5 डीपीसी पर माउस भ्रूण लीजिए. चूहे पशु चिकित्सा अमेरिकन मेडिकल एसोसिएशन (AVMA) पशु की इच्छामृत्यु (2013) के लिए दिशानिर्देश द्वारा निर्दिष्ट के रूप में सीओ 2 साँस लेना डिवाइस का उपयोग euthanized थे. मौत का बीमा करने के लिए, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था सीओ 2 के लिए जोखिम के बाद प्रदर्शन किया गया था.
- उपकरणों को पेट में बालों का चिपके से बचने के लिए उदर पेट की सतह पर 70% इथेनॉल स्प्रे. फिर एक तेज कुंद ऑपरेटिंग कैंची और गर्भाशय का पता लगाने के लिए संदंश microdissecting में 4-3/4 की एक जोड़ी का उपयोग औदरीयता उदर गुहा खुला. Microdissecting संदंश में एक 4 का उपयोग पूरे गर्भाशय उठा और गर्भाशय शरीर पर और गर्भाशय सींग के सुझावों पर एक प्रकाश ऑपरेटिंग कैंची से काटने के द्वारा शरीर से अलग.
- जल्दी से कुल्ला 1x पीबीएस में पूरे गर्भाशय 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्मगर्भाशय के लिए किसी भी रक्त चिपके निकालें और तुरंत DMEM में जगह के लिए एक पेट्री डिश में 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म. आगे उपयोग से पहले 70% इथेनॉल स्प्रे द्वारा उपकरणों जीवाणुरहित.
नोट: पीबीएस, DMEM और संस्कृति के माध्यम सहित और पूरी प्रक्रिया के दौरान 37 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें बनाए रखने के समाधान Preheating की सिफारिश की है. - एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, गर्भाशय अंश के रूप में एक प्रकाश ऑपरेटिंग कैंची से विच्छेदित किया जाना चाहिए. यह (पा समाप्त होता है) संशोधित microdissecting चिमटी की एक जोड़ी धीरे खोलने को चौड़ा करने के लिए डाला जा सकता है, जिसके माध्यम से खंडों गर्भाशय के दोनों ओर छोटे खुलने में यह परिणाम है. यह तो धीरे रीचर्ट झिल्ली के साथ पार्श्विका जर्दी थैली (PYS) का पर्दाफाश करने microdissecting चिमटी की एक जोड़ी के साथ फाड़ द्वारा हटाया जा सकता है जो अपरा पतनिका, का जोखिम परमिट. चिमटी की एक धार का प्रयोग धीरे PYS के साथ रीचर्ट झिल्ली पियर्स और वें से अलगई आंत की जर्दी थैली (VYS) अंतर्निहित बरकरार VYS साथ भ्रूण को बेनकाब करने के लिए परत. अपरा के बाहर अथवा उसके चारों ओर कोन और trophoectoderm डेरिवेटिव अपरा पतनिका साथ या रीचर्ट झिल्ली के साथ या तो हटाया जा सकता है. केयर भ्रूण तुरंत बाहर पॉप VYS का टूटना से बचने के लिए लिया जाना चाहिए.
- बरकरार VYS साथ भ्रूण फिर संस्कृति के माध्यम से एक प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक का उपयोग कर 37 डिग्री सेल्सियस पर गरम युक्त एक पेट्री डिश में स्थानांतरित किया जाना चाहिए.
नोट: तुरंत गर्भाशय से अलग होने के बाद संस्कृति के माध्यम से स्थानांतरण संस्कृति में भ्रूण के बेहतर विकास के लिए मदद करता है. - एक छोटे से खोलने प्रमुख रक्त वाहिकाओं से परहेज microdissecting चिमटी की एक जोड़ी के साथ जर्दी थैली में किया जाना चाहिए. चिमटी की एक तेज जोड़ी धीरे सिर क्षेत्र से सटे एक क्षेत्र में भेदी द्वारा उद्घाटन बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से कुंद चिमटी के दो जोड़े जर्दी थैली पकड़ और धीरे से एक छोटी सी शुरुआत करने के लिए आंसू के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.फिर धीरे भ्रूण सिर फिट करने के लिए अभी पर्याप्त एक आकार को चिमटी के साथ विस्तार से खोलने को चौड़ा. बारीकी से भ्रूण लपेटकर है जो एमनियोटिक झिल्ली धीरे शरीर से दूर आयोजित की और चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग फाड़ा जाना चाहिए. 15 थैली जर्दी के साथ कि भ्रूण vasculature की अखंडता को बनाए रखते हुए भ्रूण सिर और बाद में पूरे भ्रूण धीरे जर्दी थैली से exteriorized किया जाना चाहिए.
नोट: जर्दी थैली vasculature को कोई क्षति संभावित संस्कृति में भ्रूण के विकास को प्रभावित कर सकते हैं. क्षतिग्रस्त वाहिका संरचना के साथ इस तरह के भ्रूण संस्कृति के लिए नहीं किया जाना चाहिए और बाद में खारिज किया जा सकता है, जो भ्रूण के मंचन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. - भ्रूण मचान मापदंड: शरीर और सिर के आकार, अंग और प्रत्येक समूह से कम से कम दो भ्रूण के लिए विखंड की संख्या (ओं) की गणना के द्वारा आंख आकृति विज्ञान और मंच सहित रूपात्मक मापदंड से विदारक माइक्रोस्कोप और समूह के तहत भ्रूण जांच करते हैं.
<मजबूत> नोट: आमतौर पर utero में विकास में एक ही कूड़े शो मतभेद से प्राप्त की है और शरीर के आकार, रूपात्मक सुविधाओं और somites की संख्या में अलग भ्रूण. हालांकि, हम अपने रूपात्मक मापदंड के आधार पर समूहीकृत भ्रूण आम तौर पर इसी तरह की विखंड संख्या (± 1) का प्रदर्शन मिला. इस कारण से, यह इस संस्कृति शुरू करने के लिए समय में देरी होगी के रूप में प्रत्येक भ्रूण के लिए somites गिनती करने की आवश्यकता नहीं है.
नोट: संस्कृति के लिए somites गिनती करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि भ्रूण का उपयोग न करें. संस्कृति शुरू करने में समय की देरी से बचने के लिए अन्य भ्रूण के लिए संस्कृति शुरू करने के बाद somites गणना. गर्भाशय से अलग होने के बाद संस्कृति के कारण देरी हो गया है कि भ्रूण आमतौर पर गरीब विकास दिखा रहे हैं. - मध्यम 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म ताजा संस्कृति के साथ एक पेट्री डिश को तुरंत भ्रूण स्थानांतरण और भ्रूण फिर बाँझ संस्कृतियों के साथ एक पेट्री डिश में स्थानांतरित किया जाना चाहिए जहां संस्कृति हुड के पास लेई मीडिया के माध्यम से संस्कृति बोतलों में डालने से पहले संस्कृति शुरू करने के लिए.
नोट: भ्रूण के लिए कई मीडिया स्थानान्तरण संस्कृति भ्रूण संग्रह और विच्छेदन के विभिन्न चरणों संस्कृति हुड में स्थापित नहीं किया गया था जो एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत किया गया ही प्रदूषण को रोकने में मदद करता है पहले.
नोट: कूड़े आकार (> 12 भ्रूण), प्रक्रिया आधा भ्रूण बड़ी है और संस्कृति शुरू करने या संस्कृति के माध्यम से एक डिश में डाल दिया और 37 डिग्री सेल्सियस सीओ 2 इनक्यूबेटर में जगह जब भ्रूण लंबी अवधि (> 35-40 मिनट) के लिए बाहर छोड़ दिया गया जब हम धीमा करने के लिए और इस संस्कृति में बाद में विकास को प्रभावित करेगा दिल की धड़कन मनाया.
4. माउस भ्रूण संवर्धन
- संस्कृति हुड में autoclaved संस्कृति बोतल खोलने और उन्हें ठीक से लेबल. संस्कृति के माध्यम से ट्रांसफर 3 मिलीलीटर टी में से प्रत्येक को 37 डिग्री सेल्सियस पर गरमवह बोतलों और तब माउस भ्रूण बाँझ प्लास्टिक हस्तांतरण pipettes का उपयोग संस्कृति बोतलों में धीरे स्थानांतरित किया जाना चाहिए. संस्कृति की बोतलें तो संस्कृति तंत्र में रोलिंग डिस्क को संस्कृति की बोतलें पकड़ करने के लिए मदद जो रबर बोतल corks के साथ छाया हुआ होना चाहिए.
नोट: मीडिया के साथ संस्कृति की बोतलें चूहों euthanizing से पहले तैयार और संस्कृति तंत्र के रोलिंग डिस्क पर रखा जा सकता है. इस संस्कृति बोतलों में भ्रूण के हस्तांतरण के लिए समय shortens.
नोट: माउस भ्रूण व्यक्तिगत रूप से या एक ही संस्कृति की बोतल में दो या तीन भ्रूण के साथ cocultures के रूप में संवर्धित किया जा सकता है. - संस्कृति की बोतलें aseptically 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति तंत्र को ले गए और कस रबर corks के साथ रोलिंग डिस्क पर छेद करने के लिए उन्हें हुक किया जाना चाहिए. Embr की नि: शुल्क प्रवर्तन सक्षम बनाता है जो मिनट (आरपीएम) प्रति 35 घुमाव की एक स्थिर गति से, बारी बारी से करने के लिए रोलिंग डिस्क को चालू करेंभी मीडिया और में Yos भ्रूण ऊतक से मुक्त गैस विनिमय में मदद करता है. संस्कृति कक्ष से जुड़ा सिलेंडर से गैस संस्कृति बोतलों में रोलिंग डिस्क और रबर कॉर्क के माध्यम से बहती है.
- नियमित रूप से संस्कृति 16-40 घंटे के लिए भ्रूण और गैस बहिर्वाह और संस्कृति कक्ष तापमान के लिए जाँच करें.
नोट: माउस भ्रूण हेरफेर संस्कृति में: भ्रूण कम से कम 30 मिनट के लिए संस्कृति स्थितियों के अनुकूल हो. फिर खराब प्रदर्शन और कमजोर दिल की धड़कन दिखा कि भ्रूण खारिज किया जा सकता है और शेष भ्रूण आगे हेरफेर के अध्ययन के लिए उपयोग किया जा सकता है. ऐसे electroporation 5,9,16, microinjections 18, मनका आरोपण 16, नशीली दवाओं के उपचार और अन्य प्रक्रियाओं के रूप में भ्रूण जोड़तोड़ इस समय में किया जा सकता है. हम सफलतापूर्वक जल्दी आंख विकास में उनकी भूमिका का अध्ययन करने के लिए कुछ संकेत अणु के साथ इलाज Affi जेल agarose मोती का आरोपण प्रदर्शन किया. भ्रूण के बादजोड़तोड़ एक ताजा मध्यम में वापस लौटे और संस्कृति में जारी रखा जा सकता है. - 9-10 घंटे और संस्कृति की 18-19 घंटा संस्कृति 40 घंटे के लिए जारी रखा गया था के बाद विशिष्ट अंतराल पर पूरी तरह से ताजा मीडिया के साथ संस्कृति मीडिया की जगह.
नोट: संस्कृति 16-18 घंटे से बंद कर दिया गया है तो संस्कृति मीडिया बदलने की आवश्यकता नहीं किया जा सकता है. - संस्कृति में सफलता का उपाय: संस्कृति में भ्रूण विकास शरीर के आकार में वृद्धि, विखंड संख्या और सिर, हाथ पैर, दिल और आंखों की रूपात्मक विकास द्वारा मूल्यांकन किया जाना चाहिए, जबकि संस्कृति में भ्रूण अस्तित्व शरीर में दिखाई दिल की धड़कन और रक्त परिसंचरण द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए.
- E11.0 डीपीसी (~ 40-41 एस) और E12.0 डीपीसी (~ 49-50 s) utero विकसित भ्रूण में क्रमश: 16-18 घंटा और 38-40 घंटे के लिए सुसंस्कृत भ्रूण की तुलना के लिए नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
- संस्कृति के दौरान और गर्भ अवस्था में के लिए अलग अलग समय बिंदुओं पर भ्रूण विकास के कैप्टन किया जा सकता हैखुर्दबीन विदारक तहत ured. स्पॉट इमेजिंग सॉफ्टवेयर छवियों पर कब्जा करने के लिए उपयोग किया और बाद में इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग संसाधित किया गया था.
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Representative Results
माउस भ्रूण का विकास पूर्व utero गर्भाशय भ्रूण सुसंस्कृत हैं समय के लिए शरीर से अलग है समय से शुरू कई कारकों पर निर्भर करता है. चित्र 1 में दर्शाया के रूप में, प्रक्रिया शरीर से गर्भवती गर्भाशय की जुदाई (चित्रा 1 ए), अक्षत जर्दी थैली (चित्रा 1 बी) के साथ भ्रूण के अलगाव, सहित कदम की एक श्रृंखला शामिल है, जर्दी थैली से भ्रूण की बाह्यीकरण ( चित्रा 1C) और 37 डिग्री सेल्सियस पर 95% हे एक रोलिंग बोतल संस्कृति तंत्र में 2/5% सीओ 2 के माहौल में एक सीरम मुक्त मीडिया में भ्रूण संवर्धन तुरंत गर्भाशय से अलग होने के बाद संस्कृति मीडिया में स्थानांतरित कर जब भ्रूण 100% अस्तित्व का प्रदर्शन किया. इन संस्कृति की स्थिति, माउस भ्रूण के तहत जब में विकासशील बराबर चरण भ्रूण में मनाया है कि 16-40 घंटे का प्रदर्शन किया विकास और रूपात्मक विकास के लिए सुसंस्कृत तुलनीयगर्भाशय (चित्रा 2).
E10.5 (~ 34-35 ओं) (2A चित्रा) 16-40 घंटे के लिए सुसंस्कृत बच गया और अच्छी तरह से 35 एस के चरण से आगे विकास में उन्नत जब भ्रूण. संस्कृति में 16-18 घंटे (आंकड़े 2 डी और 3 बी, 1 टेबल) के बाद भ्रूण के बारे में 5-6 ~ संस्कृति में हर दो और एक आधे घंटे के लिए एक विखंड की वृद्धि दर का प्रदर्शन और E11.0 (के लिए आकृति विज्ञान के बराबर थे जोड़ा गर्भाशय (आंकड़े 2 बी और 3 ए) में विकसित 40-41 ओं) भ्रूण. विकास के बारे में एक घंटे की देरी थी हालांकि, संस्कृति में इन भ्रूण अलग मस्तिष्क vesicles के साथ शरीर के आकार में एक समग्र वृद्धि और एक आनुपातिक सिर का प्रदर्शन किया. भ्रूण भी, रेटिना वर्णक उपकला में एक अच्छी तरह से संभाग दिल और रंजकता की उपस्थिति के गठन के अंग कलियों के विकास से पता चला है. हालांकि, विकास के इस प्रकार EMB के बारे में 58% में मनाया गयाभ्रूण के 28% एक मध्यवर्ती विकास (चित्रा -3 सी) का प्रदर्शन करते हुए ryos सुसंस्कृत. वे में utero विकसित भ्रूण की तुलना में एक समान विखंड गिनती की थी, हालांकि बाद में इन भ्रूण एक छोटे शरीर के आकार से पता चला है. मस्तिष्क vesicles सीमांकन किया गया, हालांकि वे एक अपेक्षाकृत छोटे सिर था. दिल कक्षों अलग नहीं थे और कुछ भ्रूण में अंग कलियों हाथ पैरों पर अंधेरे क्षेत्रों का प्रदर्शन किया. स्पेक्ट्रम के दूसरे छोर पर, भ्रूण के बारे में 14% संस्कृति (चित्रा 3 डी) में गरीब विकास का प्रदर्शन किया. इन भ्रूण कम शरीर और सिर के आकार की थी और अपक्षयी परिवर्तन का संकेत शरीर के कुछ भागों में अंधेरे क्षेत्रों दिखाया. दिल धड़क रहा था हालांकि यह बीमार विकसित किया गया था और अन्य लोगों में अंग अंधेरे और विकास में मंद दिखाई दिया, जबकि कुछ भ्रूण में कक्षों में भेदभाव का अभाव है.
श, भ्रूण 38-40 घंटा (1 टेबल चित्रा 2 ई) के लिए संस्कृति में जारी रखाके बारे में 49-50 के बकाया और E12.0 भ्रूण गर्भ में विकसित (चित्रा -2) के बराबर थे. 2-3 घंटे की देरी है, संस्कृति में इन भ्रूण शरीर के आकार में आनुपातिक वृद्धि का प्रदर्शन किया और सिर क्षेत्र में एक अच्छी तरह से सीमांकन थूथन की रेटिना वर्णक उपकला और गठन में रंजकता के विकास में मनाया के रूप में उपयुक्त जीवोत्पत्ति और ऊतक भेदभाव दिखाया. अंग कलियों और पूंछ की तरह हाथ - पांव में कुछ भागों के तहत विकसित हो दिखाई हालांकि, भ्रूण में गर्भ में भ्रूण के लिए तुलनीय विकसित हो दिखाई दिया. उनमें से बाकी मंद विकास के क्षेत्रों के साथ या के तहत विकास शरीर के कुछ भागों में या विकास संबंधी प्रगति की एक श्रृंखला का प्रदर्शन किया हालांकि, जबकि विकास के इस तरह (1 टेबल) संवर्धित भ्रूण का केवल 30-40% में मनाया गया पूरे भ्रूण.
इसके अलावा विकास में ऊपर मतभेद से, हम एक महत्वपूर्ण विभिन्न मनाया भ्रूण एक ही संस्कृति बोतल में cocultured गया जब विकास में nce. अन्य भ्रूण (आंकड़े -4 ए और 4 क ') की तुलना में coculture में, अच्छी तरह से विकसित भ्रूण (आंकड़े 4 बी और 4 बी') भ्रूण के विकास के सभी पहलुओं में बेहतर विकास का प्रदर्शन किया. मेजर मतभेद समग्र शरीर के आकार और सिर के आकार में और कभी कभी दिल और अंग विकास में मनाया गया. Coculture से अच्छी तरह से विकसित भ्रूण गर्भ में भ्रूण के विकास के लिए आकृति विज्ञान के बराबर था, वहीं coculture में अन्य भ्रूण हमेशा अच्छी तरह से विकसित भ्रूण की तुलना में कम विकसित होने के लिए प्रकट हुई है. Cocultures (एन = 33) के बाकी coculture में दोनों भ्रूण में लगभग समान विकास दिखाया है, जबकि विकास में अंतर के इस तरह, (एन = 27) cocultures के 45% में मनाया गया.
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मां माउस से अलग भ्रूण के साथ चित्रा 1. माउस भ्रूण संस्कृति प्रोटोकॉल में कदम. (ए) गर्भवती गर्भाशय. गर्भाशय की कमानी विच्छेदन के बाद पतनिका से अलग बरकरार जर्दी थैली के साथ (बी) भ्रूण. (सी) भ्रूण जर्दी थैली से exteriorized. (डी) रोलिंग बोतल संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस पर तंत्र और 95% 2 हे / 5 माउस भ्रूण संवर्धन के लिए% सीओ 2 के साथ आपूर्ति की. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
<संस्कृति में br /> चित्रा 2. भ्रूण गर्भ के विकास में दोहराने. E10.5 (ए), E11.0 (बी) और E12.0 (सी) में गर्भाशय विकास में. 18 घंटा (डी) और 40 घंटे (ई) के बाद संस्कृति में विकास. (ई) में स्केल बार सभी पैनलों पर लागू होता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
संस्कृति में चित्रा 3. भ्रूण विकास. भ्रूण E11.0 डीपीसी संस्कृति में (ए). विकास (बी, सी, डी) में गर्भ में विकसित किया है. (बीसंस्कृति में अच्छा भ्रूण के विकास के) प्रतिनिधित्व. कुल भ्रूण के बारे में 58% utero विकसित भ्रूण में करने के लिए प्रदर्शनी तुलनीय विकास सुसंस्कृत. संस्कृति में मध्यवर्ती विकास (सी) प्रतिनिधित्व. भ्रूण के बारे में 28% शो मध्यवर्ती विकास सुसंस्कृत. संस्कृति में गरीब भ्रूण के विकास की (डी) प्रतिनिधित्व. लगभग 14% भ्रूण संस्कृति में गरीब विकास दिखा. (डी) में स्केल बार सभी पैनलों पर लागू होता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 4. Coculture (ए के शुरू में माउस भ्रूण coculture प्रणाली. भ्रूण में विकासात्मक मतभेद बी). भ्रूण के विकास coculture के 16 घंटे (ए ',' बी ') के बाद. Coculture (ए ') में भ्रूण से एक coculture में (अन्य भ्रूण बी) की तुलना में नीचे आकार में प्रकट होता है'. (बी) में स्केल बार सभी पैनलों पर लागू होता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
| 16-18 घंटे के लिए सुसंस्कृत कुल भ्रूण | 16-18 घंटे के लिए संवर्धन के बाद विकास | 38-40 घंटे के लिए सुसंस्कृत कुल भ्रूण | 38-40 घंटे के लिए संवर्धन के बाद विकास | |||
| अच्छा | मध्यवर्ती | गरीब | अच्छा | गरीब | ||
| 112 | 65 | 31 | 16 | 12 | 4 | 8 |
माउस भ्रूण संस्कृति प्रणाली में भ्रूण की तालिका 1. विकास. 16-18 घंटे या 38-40 घंटे के लिए या तो सुसंस्कृत भ्रूण. 16-18 घंटा, 65 (58%) भ्रूण गर्भ में भ्रूण के विकास के लिए तुलनीय विकास का प्रदर्शन के लिए सुसंस्कृत कुल 112 भ्रूण की, 31 (28%) मध्यवर्ती दिखाया और 16 (14%) गरीब विकास दिखाया. 39-40 घंटे के लिए सुसंस्कृत कुल 12 भ्रूण में से केवल 4 (~ 35%) भ्रूण जबकि शेष दिखाया गरीब विकास अच्छा विकास दिखाया.
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Discussion
मध्य हमल चरण माउस भ्रूण 37 डिग्री सेल्सियस पर 95% 2 हे / 5 एक रोलिंग बोतल संस्कृति तंत्र में% सीओ 2 के माहौल में एक सीरम मुक्त संस्कृति मीडिया में सुसंस्कृत थे भ्रूण के विकास के लिए पूर्व utero गर्भाशय संस्कृति के पूरा होने (चित्रा 1) के लिए euthanized चूहों से अलग है समय से प्रक्रिया के दौरान हर कदम पर कई कारकों पर निर्भर था. विकास को प्रभावित किया है कि सबसे महत्वपूर्ण कारक संस्कृति शुरू करने के लिए समय लिया था. सबसे देखभाल की आवश्यकता होती है कि प्रक्रिया के दौरान अन्य महत्वपूर्ण बिंदुओं ऐसे बरकरार जर्दी गर्भाशय से थैली और जर्दी थैली से भ्रूण की बाह्यीकरण साथ भ्रूण की जुदाई के रूप में कदम शामिल हैं. कृन्तकों थाली के आकार का नाल किया है, गर्भाशय की कमानी विच्छेदन अपरा पतनिका थोड़ा कोनों पर क्षतिग्रस्त है, भले ही भ्रूण को रक्त की आपूर्ति को नुकसान नहीं था. वास्तव में इस EI में एक छोटे से खोलने छोड़ाकुंद संदंश की एक जोड़ी धीरे खुला गर्भाशय और बरकरार जर्दी थैली के साथ भ्रूण की आसान अलगाव को सक्षम करने अपरा पतनिका फाड़ करने के लिए डाला जा सकता है, जिसके माध्यम से वहाँ अंत. हालांकि, जर्दी थैली से भ्रूण की बाह्यीकरण के अगले कदम की जर्दी थैली में प्रमुख रक्त वाहिकाओं के लिए किसी भी क्षति संभावित संस्कृति में भ्रूण के विकास पर असर होता है कि में महत्वपूर्ण है. भ्रूण की जर्दी थैली में vasculature की intactness बनाए रखने की जर्दी थैली से exteriorized गया जब उचित भ्रूण विकास का समर्थन किया गया था. भ्रूण चरण E10 परे माउस भ्रूण 1, 15, 18, 19 सुसंस्कृत थे जब पिछले अध्ययनों की जर्दी थैली के उद्घाटन के संकेत मिले हैं. तदनुसार, हम अपक्षयी परिवर्तन मनाया और E10.5 भ्रूण बरकरार जर्दी थैली के साथ सुसंस्कृत थे जब भ्रूण संस्कृति अवधि जीवित नहीं रह सकता. हम भ्रूण की बाह्यीकरण प्रभावी पोषक तत्व एक सुविधा होगी मानजर्दी थैली के साथ vasculature में निरंतरता बनाए रखते हुए ऊतकों के माध्यम से bsorption. संस्कृति में इन भ्रूण की जर्दी थैली के बिना सभ्य भ्रूण की तुलना में भ्रूण के शरीर के अंगों में प्रभावी दिल की धड़कन और रक्त परिसंचरण प्रदर्शन किया.
संस्कृति के माध्यम में भ्रूण को बनाए रखने का अधिकार है कि वे संस्कृति के समय को गर्भाशय से अलग कर रहे हैं समय से 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म तुरंत संस्कृति में बाद में विकास के लिए उनकी क्षमता को बनाए रखने के लिए सबसे उपयुक्त वातावरण प्रदान करेगा. इस वजह से भी माध्यम में एंटीबायोटिक दवाओं की उपस्थिति के संक्रमण से बचाता है और संस्कृति में पीबीएस / DMEM के भी मात्रा मिनट के समावेश से बचा जाता है. हम का उपयोग किया है परिभाषित मध्यम पहले Wawersik एट अल. 20 में वर्णित अन्य स्थापित परिभाषित मीडिया, 21 (नहीं दिखाया डेटा) की तुलना में बेहतर भ्रूण विकास झुकेंगे. भ्रूण के विकास में अंतर मुख्य रूप से कारण हो सकता हैऐसे पीटा सीरम रिप्लेसमेंट (एस आर) और एन 2 अनुपूरक के रूप में हमारे परिभाषित माध्यम में विशिष्ट घटकों के लिए. एन 2 अनुपूरक बाद mitotic न्यूरॉन्स के विकास और अभिव्यक्ति का समर्थन करने के लिए दिखाया गया था जबकि, एस आर भ्रूण गोजातीय सीरम 22, 23 के लिए एक सीधा प्रतिस्थापन होना दिखाया गया था. एस आर undifferentiated pluripotent स्टेम कोशिकाओं के विकास के साथ ही 23-25 सक्षम स्थिर और germline होना दिखाया गया है कि मानव और माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं का समर्थन करने के लिए संस्कृतियों में इस्तेमाल किया गया था. इसके अलावा संस्कृति के माध्यम से, संस्कृति बोतल में ऑक्सीजन एकाग्रता भ्रूण के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. भ्रूण एक पारंपरिक इनक्यूबेटर में 5% सीओ 2 की शर्तों को जीवित नहीं रह सकता. हम पहले से 5,9 सुझाव के रूप में अन्य ऑक्सीजन सांद्रता और विभिन्न प्रवाह दर का परीक्षण नहीं किया है, 95% हे निरंतर प्रवाह की दर पर 2/5% सीओ 2 का उपयोग संस्कृति में भ्रूण के survivability कायम है. रोटेशन की जबकिसंस्कृति की बोतलें भ्रूण ही परिस्थितियों लेकिन संस्कृति बोतलों की कोई रोटेशन के साथ सुसंस्कृत जब कोई दिखाई दिल की धड़कन के साथ भ्रूण की nonsurvival में हुई, आवश्यक है. हम रोलिंग बोतल संस्कृति तंत्र में निरंतर रोटेशन (35 आरपीएम) मुक्त माध्यम में भ्रूण के निलंबन और साथ ही बढ़ाया भ्रूण ऊतकों के माध्यम से पोषक तत्वों और ऑक्सीजन का अवशोषण सक्षम मान रही है. समग्र शरीर और सिर के आकार, आकृति विज्ञान, एक अच्छी तरह से संभाग दिल के गठन, मस्तिष्क vesicles और आंख के विकास के संदर्भ में संस्कृति में इन भ्रूण के विकास के गर्भ में भ्रूण के विकास के बराबर था. हमारे हाथ में, हम मूर स्कॉट एट अल. 15 द्वारा देखा गया है कि भ्रूण के विकास को दोहराने में सक्षम थे
संस्कृति में भ्रूण कई कारकों (; तालिका 1 चित्रा 3) के आधार पर विकास और रूपात्मक विकास की एक श्रृंखला का प्रदर्शन किया. परिभाषित संस्कृति के तहत28% मध्यवर्ती दिखाया और 14% एक गरीब विकास दिखाया है, जबकि हम इस्तेमाल शर्तों, 16-18 घंटे के लिए सुसंस्कृत भ्रूण, भ्रूण के बारे में 58% में गर्भ में भ्रूण के विकास में मनाया बराबर विकास दिखाया. 38-40 घंटे के लिए संस्कृति का विस्तार आगे सुसंस्कृत कुल भ्रूण का केवल 30-40% के लिए तुलनीय विकास दिखाने की क्षमता की कमी हुई. भ्रूण समय की लंबी अवधि के लिए संवर्धित कर रहे हैं के अलावा जब संभावित भ्रूण विकास के पूर्व utero कि प्रभावित निहित कारणों से, कुछ हद तक नियंत्रित किया जा सकता है कि कई बाह्य कारकों महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं. नियंत्रित किया जा सकता है कि ऐसा ही एक संभावित कारक संस्कृति की शुरुआत करने के लिए गर्भाशय से भ्रूण के अलगाव से समय लिया है. यह पहली बार पृथक भ्रूण सभी भ्रूण संस्कृति बोतल में जाने और 95% 2 हे / 5% सीओ 2 प्राप्त के रूप में अंत में पृथक भ्रूण की तुलना में संस्कृति डिश में कम ऑक्सीजन के संपर्क में हैं कि व्याख्या की जा सकतीएक ही समय में. हालांकि कमानी विच्छेदन के बाद नाल में छोड़ दिया जाता है कि रक्त में उपलब्ध ऑक्सीजन समय की विस्तारित अवधि के लिए समर्थन नहीं कर सकते और इस कारण संस्कृति उपकरण और तंत्र की सबसे माउस euthanizing से पहले इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार की स्थापना की जानी चाहिए. हम आमतौर पर माउस euthanized किया गया था समय से 25-30 मिनट में संस्कृति में भ्रूण मिलता है. भ्रूण Zeeb में सुझाव के रूप में एक समय में एक संसाधित हो गया था कि संस्कृति शुरू करने के लिए इस छोटे से समय अवधि संभव नहीं होगा, एम एट अल. 18 भ्रूण व्यक्तिगत रूप से कार्रवाई कर रहे हैं, जब भ्रूण के समूह संभव नहीं है और प्रत्येक भ्रूण होना चाहिए विखंड संख्या के लिए गिना. यह प्रक्रिया अमल में लाना जर्दी थैली से, प्रत्येक भ्रूण को अलग करने के लिए कम से कम 5-6 मिनट ले somites गिनती और संस्कृति बोतल के लिए स्थानांतरण होगा. हम आम तौर पर हमारे CD-1 चूहों से मिलता है जो 10-12 भ्रूण की एक लिटर आकार के लिए, पूरी प्रक्रिया सी में लाने के लिए पिछले कुछ भ्रूण के लिए 60-72 मिनट के लिए ले जाएगाulture. यह बहुत लंबा समय है और हम भ्रूण exteriorized और छोड़ दिया पीबीएस में और संस्कृति के लिए देरी हुई जब धीमा और लगभग रोकने के लिए दिल की धड़कन मनाया. एक अन्य संभावित कारक प्रक्रिया के दौरान भ्रूण की हैंडलिंग या mishandling हो सकता है. से निपटने के दौरान, आप आसानी से पता नहीं है कि भ्रूण या जर्दी थैली में शरीर या रक्त वाहिकाओं के कुछ भाग के लिए एक आकस्मिक क्षति उत्पन्न हो सकता है. यह भी एक अच्छी तरह से विकसित भ्रूण कभी कभी अपर्याप्त रक्त की आपूर्ति का संकेत अंग अंकुरित और पूंछ की तरह हाथ - पांव में अंडर विकास का एक तरह से पता चलता है कि मनाया गया के रूप में यह शरीर या कभी कभी पूरे भ्रूण के उस हिस्से के विकास को प्रभावित कर सकते हैं. यह प्रक्रिया के दौरान समझौता किया है या क्षतिग्रस्त हो दिखाई देते हैं कि इस तरह के भ्रूण त्यागने के लिए बेहतर है. आमतौर पर प्रक्रिया के दौरान आने वाली अन्य समस्या बरकरार जर्दी थैली के साथ भ्रूण के कुछ गर्भाशय की कमानी विच्छेदन पर पतनिका से अचानक बाहर सहारा था. यह कभी कभी मो में परिणामजर्दी थैली के साथ वाहिका संरचना बरकरार है, हालांकि नाल से जुदाई बिंदु पर खून की कमी कर रहे हैं. यह खून की कमी की वजह से अलग होने के दौरान भ्रूण के शरीर में बनाए रखा रक्त की कम राशि के लिए भ्रूण के बाद विकास को प्रभावित कर सकते हैं.
इसके अलावा उपरोक्त कारकों से संस्कृति शुरू करने के समय में भ्रूण के चरण, जैसे कुछ शर्तों संस्कृति में विकास को प्रभावित किया. हम सफलतापूर्वक सुसंस्कृत मध्य हमल माउस भ्रूण 16-40 घंटे के लिए 28-37 के बीच रहा और विकास में कुछ अंतर देखा कि चरणों की शुरुआत के साथ. 34-36 मंच पर भ्रूण बाद के चरणों में सुसंस्कृत भ्रूण में संस्कृति की स्थिति के लिए अनुकूलन क्षमता में वृद्धि का संकेत 30-33 के स्तर पर भ्रूण की तुलना में संस्कृति में बेहतर विकास का प्रदर्शन किया. संस्कृति के दौरान देखा गया कि अन्य आश्चर्यजनक तथ्य यह है कि दो या अधिक भ्रूण cocultured गया जब भ्रूण का विकास (चित्रा 4) था. Coculture resultecocultures के 45% में अन्य भ्रूण की तुलना में भ्रूण में से एक में विकास में महत्वपूर्ण सुधार में डी. एक ही गर्भाशय से भ्रूण आकृति विज्ञान और विखंड गिनती में इसी तरह लग रहे हालांकि, स्वाभाविक है कि कोई दो भ्रूण के विकास के लिए एक ही चरण में हो सकता है और इस coculture में अन्य की तुलना में भ्रूण में से एक में विकास संबंधी अंतर के कारणों में से एक हो सकता है प्रणाली.
इस प्रकार हम बताते हैं कि 37 डिग्री सेल्सियस प्रदर्शनी विकास और रूपात्मक विकास तुलनीय करने पर 95% 2 हे / 5% एक रोलिंग बोतल संस्कृति तंत्र में सीओ 2 के माहौल में एक सीरम मुक्त माध्यम में मध्य हमल चरण माउस भ्रूण सुसंस्कृत पूर्व utero कि गर्भ में भ्रूण के विकास में मनाया. हम माउस भ्रूण संस्कृति प्रणाली की इस पद्धति जल्दी भ्रूण जीवोत्पत्ति में महत्वपूर्ण संकेत बातचीत का अध्ययन करने के लिए पूरे भ्रूण का उपयोग करने की आवश्यकता होगी, प्रयोगशालाओं के लिए उपयोगी हो जाएगा.
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Disclosures
हम किसी भी प्रतिस्पर्धा वित्तीय हित नहीं है.
Acknowledgments
हम संस्कृति तकनीक के साथ अपने उपयोगी सलाह के लिए डॉ. जूली गॉर्डन और डॉ. नैन्सी Manley धन्यवाद देना चाहूंगा. यह काम बच्चों के रोग फाउंडेशन और शेरोन-स्टीवर्ट अपरितारकता रिसर्च ट्रस्ट द्वारा समर्थन किया गया है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KnockOut DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| N-2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock: 100x |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma | A9418-50G | Stock: 100% |
| Antibiotic - Antimycotic Solution | Cellgro | 30-004-Cl | Stock: Penicillin (10,000 IU/ml); Streptomycin (10,000 µg/ml; Amphotericin (250 µg/ml) |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| Precision Incubator Unit | B.T.C. Engineering Milton Cambridge England | Id.No. 840-374 | |
| Glass Bottles for Rotating Unit | B.T.C. Engineering | ||
| Silicone Rubber Cork | B.T.C. Engineering | ||
| 95% O2/5% CO2 Cylinder | AirGas Inc. | ||
| Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Stemi SV6 Microscope | Zeiss | ||
| CO2 Water Jacketed Incubator | Forma Scientific | Model: 3110 | |
| Culture Hood | Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2 | Model: Nu-425-600 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | IsoTemp205 | |
| Weigh Balance | Mettler Toledo | AG285 | |
| Centrifuge Tube, 50 ml | Corning | 430291 | |
| Light Operating Scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Operating Sharp-Blunt Scissors | Roboz | RS-6812 | |
| Microdissecting Forceps, 4 in | Roboz | RS-5211 | |
| Microdissecting Forceps - Hudson (cWALD), 4-3/4 in | Roboz | RS-5237 | |
| Microdissecting Tweezers (5/45) | Roboz | RS-5005 | Modified - Sharp ends were made blunt |
| Microdissecting Tweezers (5) | Roboz | RS-5060 | Modified - Sharp ends were made blunt |
| Microdissecting Tweezers (55) | Roboz | RS-5063 | Modified - Sharp ends were made blunt |
| Instrument Tray | Roboz | RT-1401S | |
| Instrument Tray Lid | Roboz | RT-1401L | |
| Petri Dish-100 mm | Fisher Scientific | 087571Z | |
| Petri Dish-60 mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Petri Dish-35 mm | Fisher Scientific | 0875711YZ | |
| Filter System ( 0.22 µm Cellulose Acetate)-150 ml | Corning | 431153 | |
| Filter System (0.22 µm Cellulose Acetate)-250 ml | Corning | 430756 | |
| Filter System (0.22 µm Cellulose Acetate)-500 ml | Corning | 430758 | |
| Pipet-aid Pipettor | Drummond Scientific Co. | D57849 | |
| Serological Pipette-10 ml | VWR | 89130-898 | |
| Disposable Serological Pipette-25 ml | Corning | 4251 | |
| Transfer Pipette - 7.7 ml | Thermo Scientific | 202-20S |
References
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