Summary
Сыворотка используется в эмбриональных культур содержит неизвестные компоненты, которые могут повлиять на исход экспериментов, особенно в исследованиях с участием сигнальных взаимодействий. Здесь мы использовали кислородом систему культуры бессывороточную и показать, что эмбрионы середине беременности мыши, культивированные в течение 16-40 часов проявляют морфологическое развитие, сравнимую с эмбрионов, развивающихся в период внутриутробного развития.
Abstract
Эмбрионы середине беременности этап мыши культивировали с использованием бессывороточной культуральной среды, полученной из коммерчески доступных добавок стволовых клеток СМИ в качестве кислородом системе культуры прокатки бутылки. Мышиные эмбрионы в E10.5 были тщательно изолированы от матки с неповрежденной желточного мешка и в процессе с участием точное хирургическое маневр эмбрионы были аккуратно выводили из желточного мешка при сохранении сосудистую непрерывность эмбриона с желточного мешка. По сравнению с эмбрионами, приготовленных с неповрежденной желточного мешка или с желточного мешка удаляется, эти эмбрионы выставлены превосходную выживаемость и прогрессирование с развитием при культивировании в аналогичных условиях. Покажем, что эти мышиные эмбрионы, при культивировании в определенной среде, в атмосфере 95% O 2/5% CO 2 в прокатном стане культуры бутылки при 37 ° С в течение 16-40 ч, проявляют морфологическое рост и развитие сопоставимы с эмбрионы развиваются в период внутриутробного развития. Мы считаем йявляется метод будет полезен для исследователей, нуждающихся использовать всю культуру эмбрионов для изучения сигнальных взаимодействий важные в эмбриональном органогенеза.
Introduction
В пробирке способы культивирования, использующие целые эмбрионы хорошо подходят для изучения механизмов, участвующих в эмбриональном органогенеза которые в противном случае трудно получить доступ в утробе сигнализации. Целые эмбрионы обеспечивают целостность тканей и поддерживает подходит для тканевых взаимодействий, которые имеют решающее значение для своевременного появления механизмов существенные сигнализации для различных клеточных процессов во время органогенеза. В то время как целые культуры эмбрионов обеспечить платформу для множества приложений, таких как трансплантации исследований, генетических и тканей манипуляций, шарик имплантации исследований, токсикологических исследований, и т.д.., Используемые в настоящее время системы культуры эмбрионов в основном зависят от сыворотки для правильного роста и поддержания эмбрионов в культуре 1-9.
Сыворотка была использована в качестве одного из основных компонентов в пределах от 10-100% от культуральной среды 6-8, 10, 11.; Однако состав сыворотки не определена и может отличаться от животного к животному, и каждый раз собирают сыворотку. В то время как подготовка лаборатория сыворотке занимает много времени и включает в себя строгие процедуры, сыворотка закуплены коммерчески демонстрирует значительные различия между различными партиями и повышает экспериментальные расходы. К этому следует добавить, сыворотка может содержать неизвестные факторы, такие как факторы роста, гормоны, или других белков, которые потенциально могут повлиять на исход некоторых экспериментах, особенно те, которые связаны с изучением сигнальных молекул важные в тканевых взаимодействий. Исследования показали, что добавление сыворотки в культуре может потенциально изменить внутриклеточные уровни определенных сигнальных молекул, таких как циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) и белков, участвующих в митогенной сигнализации и фосфоинозитид 3 (PI 3)-киназы сигнальных путей 12-14. В отличие от них, система культуры бессывороточной обеспечивает преимущества антигена среде, свободной,воздержание от биологически активных ферментов, которые могут изменить клеточные процессы и позволяет согласованности экспериментов.
В настоящем исследовании мы использовали бессывороточной культуральной среды, полученной из коммерчески доступных добавок стволовых клеток СМИ, чтобы культура стадии середине беременности целых эмбрионов в атмосфере 95% O 2/5% CO 2 в прокатном стане культуры бутылки при 37 ° С 15,16. Эмбрионы мыши, культивированные в течение от 16 до 40 ч в этих определенных условиях выставлены прогрессирование в морфологического развития общих эмбриональных тела и различных структур, таких как сердце, конечностей, мозга и глаз, указывающий соответствующие уровни клеточной пролиферации, миграции, дифференциации и тканевых взаимодействий. Молекулярный анализ эмбрионального развития в культуре для одного из сложных систем органов, таких как глаза раскрыл глазной развития в соответствие с наблюдаемым в глазной ткани в EMBRйо развивается в утробе матери (Kalaskar и Лодердейл, в процессе подготовки). Таким образом, мы показали, что мышиные эмбрионы культивировали на стадии середине беременности, обладают поступательный рост и морфологическое развитие, сравнимую с наблюдается у эмбрионов, развивающихся в период внутриутробного развития.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Мышь эмбрион культуры:
Все экспериментальные процедуры были проведены в строгом соответствии с Национальными Институтами принципов здравоохранения следующий протокол # A2010 07-119, который был рассмотрен и утвержден в университете Джорджии Уходу за животными и использованию комитета, который поддерживает продолжение нормативного контроля.
1. Подготовка питательных сред
- Подготовка питательной среды с использованием коммерчески доступных стволовых клеток СМИ и дополнений в следующих размерах: Нокаут DMEM, запасные KnockOut Сыворотка (КСР) (10%), N-2 Дополнение (1x), альбумина, из бычьей сывороткой (2%), пенициллин ( 50 МЕ / мл), стрептомицин (50 мкг / мл) и амфотерицин-B (1,25 мкг / мл). Культуральную среду подготовлен аналогично ранее описанной 15 со следующими изменениями: добавление анти-mycotics и используя два раза концентрацию антибиотиков (подробнее конкретных реагентов и оборудования, см. Liул материалов).
Примечание: Антибиотик концентрацию как ранее использовался (. Мур-Скотт, и др. 15) было достаточно для эмбриона культуры осуществляется до 24 ч периода времени. Однако, когда культура была продолжена за 24 часа, мы испытали заражения культуры, и это было успешно контролируется удвоение концентрации антибиотика. - Храните компоненты носителя при 4 ° С или при -20 ° С в соответствии с рекомендациями производителя. КСР и N-2 Дополнение следует хранить в аликвоты при -20 ° С, чтобы избежать повторного замораживания и оттаивания. KnockOut DMEM как только открылась следует использовать в течение 30 дней в соответствии с рекомендацией завода-изготовителя. Перед использованием нагреть компоненты в водяной бане до 37 ° С
- Подготовьте СМИ в стерильных условиях. Лечить поверхности всего оборудования и бутылок, содержащих компоненты медиа с 70% спрей алкоголя перед помещением их в капот культуры.
- Компоненты средств массовой информации могут быть смешаны или в стерильном стакане или непосредственно в системе фильтра (Corning). Сначала добавьте альбумина порошок в плей-DMEM. Тщательно перемешать, осторожно встряхивая, пока альбумина полного растворения. Затем добавить N-2 Дополнение, KSR и антибиотики и тщательно перемешать с помощью пипетки. Затем процеживают стерилизовать СМИ, используя размер пор фильтра 0,22 мкм с вакуумного отсоса. Внесите СМИ в 50 мл конические пробирки и хранят при температуре 4 ° С до использования. Средства массовой информации, как только подготовленные следует использовать в течение 4-5 дней для культуры.
2. Подготовка культуры оборудование
- Стерилизовать стеклянные культуры бутылки и резиновые пробки. Обертка культуры бутылки в алюминиевую фольгу и помещают пробки для бутылок каучук в стакан воды и стерилизовать автоклавированием.
- Стерилизовать культуры камеру (Precision инкубатор Unit) с 70% спрей алкоголя и теплой до 37 ° С перед началом культуры. Культура камера епошутил с прокатки диска в центре, которая является основой культуры бутылки. Расход газа в камеру регулируется манометром и скорость потока можно регулировать путем наблюдения отток пузырьков воздуха через воду в стеклянной трубке в конце. Это прокатки аппарат культура бутылка представляет собой модифицированную версию оригинального аппарата появляются вместе с новыми и Cockroft 17.
- Подключите газовый баллон, содержащий газовую смесь 95% O 2/5% СО 2 в культуральной камере и отрегулировать поток газа, чтобы "один пузырек воздуха в секунду", которая дает скорость потока 50 мл / мин и обеспечивает адекватное снабжение кислородом с эмбрионами культуры.
3. Мышь эмбрионов и подготовка по культуре
- Для получения диких эмбрионов Тип мыши, мы использовали мышей из C57BL/6J и CD-1 (Charles River Laboratories) штаммов генетического фона.
- Проверьте самок мышей для вагинальных пробок ежедневно утром. Полдень в день нахождения тыс.э вагинальные плагин следует рассматривать как E0.5 DPC (дней после полового акта).
- Сбор эмбрионов мышей на E10.5 DPC по эвтаназии беременных мышей в соответствии со стандартными протоколами. Мыши были подвергнуты эвтаназии, используя устройство для ингаляции CO 2, как указано в Американской Ветеринарной Медицинской Ассоциации (АВМА) Руководящие принципы для эвтаназии животных (2013 г.). Для обеспечения смерть, шейки дислокации была выполнена после воздействия СО 2.
- Спрей 70% этанола на брюшной брюшной поверхности, чтобы избежать прилипания брюшной волос к инструментам. Затем откройте брюшную полость снизу Используя острый-тупой операционные ножницы и пару 4-3/4 в microdissecting щипцы, чтобы найти матку. Использование 4 в microdissecting щипцов поднять всю матку и отделить его от тела за счет сокращения с легкой эксплуатации ножницами в тела матки и на кончиках рогов матки.
- Быстро промыть весь матки в 1x PBS нагревают до 37 ° Счтобы удалить прилипание крови к матке и сразу поместить в DMEM нагревали до 37 ° С в чашке Петри. Стерилизовать инструменты на 70% спрей этанола перед дальнейшим использованием.
Примечание: Предварительный нагрев решения в том числе PBS, DMEM и культуральной среды и поддержание их при 37 ° С в течение всей процедуры рекомендуется. - Под микроскопом рассекает, матка должна быть сегментально расчлененный с света, работающих ножниц. Это приводит к небольшие отверстия по обе стороны от сегментированного матки, через которую пара модифицированных (затупленных концы) microdissecting пинцета может быть слегка вставлен расширить отверстие. Это позволяет экспозицию плацентарный децидуальной, которые затем могут быть удалены, осторожно срывая с парой microdissecting пинцетом, чтобы разоблачить теменной желточный мешок (ПыС) с мембраной Reichert в. Использование одного края пинцетом аккуратно проколоть мембрану в Reichert наряду с ПыС и отдельно от гое, лежащий в основе висцерального желточного мешка (выс) слой, чтобы разоблачить эмбрионов с неповрежденными выс. Ectoplacental конус и производные трофэктодермы могут быть удалены либо с плацентарной децидуальной или мембраны Reichert в. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать разрыв VYS как эмбрионы выскочить сразу.
- Эмбрионы с интактными выс должны быть переданы в чашку Петри, содержащую культуральную среду нагревают до 37 ° С с помощью пластиковой пипетки передачи.
Примечание: Трансфер в культуральной среде сразу после отделения от матки помогает для лучшего развития эмбриона в культуре. - Небольшое отверстие должно быть сделано в желточного мешка с парой microdissecting пинцетом, избегая крупных кровеносных сосудов. Резкое пинцет может быть использован, чтобы сделать открытие, осторожно пирсинг в районе, прилегающем к области головы. В качестве альтернативы две пары тупыми пинцетом может быть использован для хранения желточный мешок и аккуратно оторвать, чтобы сделать небольшое отверстие.Затем аккуратно расширить отверстие, расширяя с помощью пинцета до размера просто достаточно, чтобы соответствовать эмбриональных головой. Амниотической мембраны, которая тесно упаковка эмбрион следует осторожно оттянуть от тела и рваные помощью пинцета. Эмбриональное головы и спустя весь эмбрион следует осторожно выводили из желточного мешка при сохранении целостности эмбриональной сосудистой с тем, что желточного мешка 15.
Примечание: Любое повреждение желточного мешка сосудистой могут потенциально повлиять на развитие эмбриона в культуре. Такие эмбрионы с поврежденной сосудистой не должны использоваться для культуры и может быть использован для постановки эмбрионов, которые в дальнейшем могут быть уничтожены. - Эмбриональные критерии постановки: Проверьте эмбрионов под микроскопом рассекает и группы по морфологическим критериям, включая тела и размер головы, конечностей и глаз морфологии и стадии путем подсчета количества сомита (ы) не менее двух эмбрионов из каждой группы.
<сильный> Примечание: Обычно эмбрионов, полученных из одного помета отображением различий в развитии в утробе матери и отличаются по размеру тела, морфологических особенностей и количества сомитов. Тем не менее, мы обнаружили, что эмбрионы, сгруппированные по нашим морфологическим критериям, как правило, выставлены аналогичные сомитов номер (± 1). По этой причине это не требуется для подсчета сомитов для каждого эмбриона, как это приведет к задержке времени начала культивировани.
Примечание: Не используйте эмбрионов, которые были использованы для подсчета сомиты для культуры. Подсчитайте сомитов после начала культивировани в других эмбрионов, чтобы избежать временной задержки в запуске культуры. Эмбрионы, которые были с задержкой в культуре после отделения от матки, как правило, демонстрируют слабое развитие. - Перенесите эмбрионы сразу в чашку Петри со свежей культуральной среде подогретой до 37 ° С и принять его на капот культуры, где эмбрионы должны снова быть передано в чашку Петри стерильной культурное СМИ, прежде чем положить их в культуры бутылок с среде, чтобы начать культуру.
Примечание: несколько переводы средств массовой информации для эмбрионов перед культура помогает в предотвращении загрязнения как были выполнены различные этапы отбора эмбрионов и рассечения под микроскопом рассекает который не был установлен в капот культуры.
Примечание: Если размер помета велико (> 12 эмбрионов), процесс половина эмбрионов и начать культуру или положить их в блюдо с культуральной среды и поместить его в СО 2 инкубаторе при температуре 37 ° С. Когда эмбрионы остались за протяжении долгого времени (> 35-40 мин) мы наблюдали сердцебиение, чтобы замедлить и это повлияет на дальнейшее развитие в культуре.
4. Культивирование эмбрионов мыши
- Откройте автоклавного культуры бутылки в капот культуры и должным образом маркировать их. Передача 3 мл культуральной среды нагревают до 37 ° С для каждого из тон бутылки, а затем эмбрионы мыши должны быть переданы мягко в культуральных бутылок с использованием стерильных пластиковых пипетки передачи. Культуральные бутылки должны быть ограничены с резиновой Пробки для бутылок, которые помогают держать культуры бутылки прокатки диска в устройстве культуры.
Примечание: культура бутылки со средствами массовой информации могут быть подготовлены и размещены на прокатки диска аппарата культуры до эвтаназии мышей. Это сокращает время для передачи эмбрионов в культуру бутылок.
Примечание: Мышиные эмбрионы можно культивировать по отдельности или в совместных культурах с двумя или тремя эмбрионов в той же самой бутылки культуры. - Культуральные флаконы должны быть асептически переносится в устройства дл культивировани при 37 ° С и плотно подключить их к отверстиям на прокатки диска с резиновыми пробками. Включите прокатки диска во вращение с постоянной скоростью 35 оборотов в минуту (RPM), что дает свободную размещения в EMBRйо в средствах массовой информации, а также помогает в свободном обмене газа на эмбриональной ткани. Газ из баллона, подключенного к культуральной камере протекает через прокатки диска и резиновых пробок в культуральных флаконах.
- Культура эмбрионы для 16-40 часов и регулярно проверять оттока и температуры газа культура камерного.
Примечание: мышиного эмбриона манипуляции в культуре: Давайте эмбрионы адаптироваться к условиям культуры, по крайней мере 30 мин. Тогда эмбрионы, которые выполняют плохо и показывающие слабую сердцебиение может быть отброшен, а оставшиеся эмбрионы могут быть использованы для дальнейших исследований манипуляции. Эмбрион манипуляции, такие как электропорации 5,9,16, микроинъекций 18, шарик имплантации 16 медикаментозного лечения и других процедур может быть выполнено в это время. Мы успешно выступили имплантацию Affi-гель агарозы получавших определенных сигнальных молекул для изучения их роли в развитии раннего глаз. Эмбрионы послеманипуляции могут быть возвращены обратно в свежей среде и продолжал в культуре. - Заменить культуральной среде полностью свежей средой через определенные промежутки времени после 9-10 ч и 18-19 ч культуры, когда культура продолжали в течение 40 часов.
Примечание: Культура замена СМИ может не потребоваться, если культура останавливается на 16-18 часов. - Критерии успеха в культуре: Эмбриональные выживание в культуре должны быть определены видимого сердцебиение и кровообращение в организме во время эмбрионального развития в культуре следует оценивать путем увеличения размеров тела, числа сомита и морфологического развития головы, конечностей, сердца и глаз.
- Внутриутробно разработан эмбрионов на E11.0 DPC (~ 40-41 с) и E12.0 DPC (~ 49-50), должны быть использованы в качестве контроля для сравнения эмбрионов культивировали в течение 16-18 ч и 38-40 ч соответственно.
- Эмбриональное развитие в различные моменты времени в течение культуры и для внутриутробному стадиях может быть капитанизмерял под рассекает микроскопом. Программное обеспечение Спот изображений был использован для захвата изображений, а затем обрабатываются с помощью программного обеспечения для обработки изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Развитие эмбрионов мыши экс маточно зависит от многих факторов, начиная с момента матки выделяют из организма ко времени эмбрионы культивируют. Как показано на рисунке 1, процедура включает в себя ряд шагов, включая, отделения беременной матки от тела (рис. 1А), изоляция эмбрионов с неповрежденной желточного мешка (рис. 1В), экстериоризации из эмбрионов из желточного мешка ( Рисунок 1C) и культивирование эмбрионов в бессывороточной СМИ в атмосфере 95% O 2/5% CO 2 в прокатном стане культуры бутылки при 37 ° С Эмбрионы выставлены 100% выживаемость при передаче в культуральной среде непосредственно после отделения от матки. В этих условиях культивирования эмбрионов мыши, когда культивировали в течение 16-40 ч выставлены роста и морфологического развития сопоставим с наблюдается в эквивалентных эмбрионов на стадии развивающихся вматочно (рис. 2).
Эмбрионы в E10.5 (~ 34-35 с) (рис. 2А), когда культивировали в течение 16-40 ч выжил и передовых в развитии далеко за рамки стадии 35 с. Эмбрионы после 16-18 ч в культуре (рис. 2D и 3В; табл. 1) добавил около 5-6 ы демонстрируя темпы роста одного сомита на каждые два с половиной часа в культуре и были морфологически сопоставимы с E11.0 (~ 40-41 лет) эмбрионы, разработанные в период внутриутробного развития (рис. 2В и 3А). Хотя развитие было задержано около часа, эти эмбрионы в культуре выставлены общее увеличение размеров тела и пропорциональное головой с различными мозговых пузырей. Эмбрионы также показали разработки зачатках конечностей, формирование хорошо патрон сердца и появлению пигментации в пигментного эпителия сетчатки. Тем не менее, этот тип развития наблюдалось примерно в 58% от набryos культивировали в то время как 28% из эмбрионов выставлены промежуточное развитие (рис. 3C). Эти более поздние эмбрионы показали меньший размер тела, хотя они имели подобный подсчет сомитов сравнению с у эмбрионов маточно разработаны. Они имели относительно меньшую голову, хотя мозговые пузыри были разграничены. Камер сердца не были различны и зачатках конечностей в некоторых эмбрионов выставлены темные участки на концах. На другом конце спектра, около 14% эмбрионов показала плохую развитие в культуре (рис. 3D). Эти эмбрионы имели более короткие тела и головы размеры и показал темные области в некоторых частях тела, указывающих дегенеративные изменения. Хотя сердце билось это было плохо развита и не хватало дифференцировку в камерах в некоторых эмбрионов, а в других конечности появились темные и отстают в росте.
Эмбрионы продолжал в культуре в течение 38-40 ч (рис. 2E; табл. 1) SHзадолжал около 49-50 с и были сопоставимы с E12.0 эмбрионов (рис. 2С), разработанные в период внутриутробного развития. Хотя задерживается на 2-3 ч, эти эмбрионы в культуре выставлены пропорциональное увеличение размеров тела и показал соответствующую органогенеза и тканевой дифференцировки, как наблюдалось в развитии пигментации в пигментного эпителия сетчатки и формирование хорошо разграничены мордой в области головы. Хотя некоторые части в конечностях, как в зачатках конечностей и хвоста, казалось, недостаточно развиты, эмбрионы, казалось, разработки сопоставимы с внутриутробно эмбрионов в. Тем не менее, этот вид развития наблюдалась только у 30-40% эмбрионов, культивируемых (табл. 1), а остальные из них выставлены ряд эволюционного развития с участками замедление роста или низкого уровня развития в некоторых частях тела или Весь эмбрион.
Помимо перечисленных выше различий в развитии, мы наблюдали значительное Differe сть в развитии, когда эмбрионы были совместно культивировали в той же бутылки культуры. По сравнению с другим эмбриона (4A и 4A ') в сокультивирования, хорошо развитый эмбрион (рис. 4Б и 4В ") выставлены более высокие темпы роста во всех аспектах эмбрионального развития. Основные различия наблюдались в общем размера тела и размера головы, а иногда и в сердце и развития конечностей. В то время как хорошо развитый эмбрион от сокультивирования был морфологически сопоставимы с эмбрионов, развивающихся в матке, другой эмбрион в сокультивирования всегда казалось, менее развита по сравнению с хорошо развитой эмбриона. Этот вид разницы в развитии наблюдался в 45% совместных культурах (N = 27), в то время как остальная часть совместных культурах (N = 33) показали почти подобное развитие в обоих эмбрионов в сокультивирования.
е 1 "FO: контент-ширины =" 5 дюймов "FO: Пребывание" / files/ftp_upload/50803/50803fig1highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50803/50803fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Шаги в протоколе мыши для культивирования эмбрионов. (А) беременной матки с эмбрионами, выделенных из родного мыши. (В) Эмбрионы с неповрежденной желточного мешка, отделенной от децидуальной после сегментарной рассечения матки. (С) Эмбрионы выводили из желточного мешка. (D) Роллинг бутылка культура аппарат при 37 ° С и поставляются с 95% O 2/5% СО 2 для культивирования эмбрионов мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
<бр /> Рисунок 2. Эмбрионы в культуре повторить в развитии маточно. В разработке маточно на E10.5 (A), E11.0 (B) и E12.0 (C). Развитие в культуре после 18 ч (D) и 40 ч (E). Бар Масштаб в (Е) применяется ко всем панелей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Эмбриональное развитие в культуре. Эмбрион разработан в утробе матери на E11.0 DPC (А). Развития в культуре (B, C, D). (В) Представительство хорошего эмбрионального развития в культуре. Около 58% всех эмбрионов культивировали выставочная сравнимую развитие в внутриутробному разработан эмбрионов. (C) Представительство промежуточного развития в культуре. Около 28% эмбрионов культивировали шоу промежуточное развития. (D) Представление плохой эмбрионального развития в культуре. Около 14% эмбрионы обнаруживают слабое развитие в культуре. Бар Масштаб в (D) относится ко всем панелей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Развивающие различия в мыши эмбрион сокультивирования системы. Эмбрионов в начале совместного культивирования (А B). Эмбриональное развитие после 16 часов из сокультивирования (A ', B'). Один из эмбрионов в сокультивирования (A ') появляется под размера по сравнению с другими эмбриона (B') в сокультивирования. Бар Масштаб в (В ') относится ко всем панелей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Всего эмбрионы культивировали в течение 16-18 ч | Разработка После культивирования в течение 16-18 часов | Всего эмбрионы культивировали в течение 38-40 ч | Разработка После культивирования в течение 38-40 часов | |||
| Хорошо | Промежуточный | Бедный | Хорошо | Бедный | ||
| 112 | 65 | 31 | 16 | 12 | 4 | 8 |
Таблица 1. Развитие эмбрионов в мыши эмбриона системе культуры. Эмбрионы культивировали в течение либо 16-18 часов или 38-40 часов. Из общего числа 112 эмбрионов культивировали в течение 16-18 ч, 65 (58%) эмбрионов показал сравнимую развитие эмбрионов, развивающихся в матке, 31 (28%) показали средний и 16 (14%) показал плохую развитие. Из общего числа 12 эмбрионов, культивируемых на 39-40 ч, только 4 (~ 35%) эмбрионов показал хорошее развитие в то время как остальные показали слабое развитие.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эмбрионы середине беременности этап мыши культивировали в бессывороточной культуральной среде в атмосфере 95% O 2/5% СО 2 в прокатном стане культуры бутылки при 37 ° С Развитие эмбриона экс маточно в решающей степени зависит от множества факторов на каждом шаге во время процедуры с момента матка, выделенной из эвтаназии мышей с завершением культуры (рис. 1). Наиболее важным фактором, который повлиял на развитие было время, необходимое, чтобы начать культуру. Другие критические точки во время процедуры, которые требуют больше всего заботиться включать в себя этапы, такие как разделение эмбрионов с неповрежденной желточного мешка из матки и экстериоризации эмбрионов из желточного мешка. Как грызуны имеют дискоидную плаценту, сегментарный рассечение матки не повредить кровоснабжение эмбриона даже если плацентарная децидуальная слегка поврежден по углам. На самом деле это оставило небольшое отверстие в еиТам конец, через который пара тупых щипцов можно вставить, чтобы мягко разорвать матку и через плацентарный децидуальной позволяет легко изоляцию эмбрионов с неповрежденной желточного мешка. Тем не менее, следующий шаг экстериоризации эмбрионов из желточного мешка имеет решающее значение в том, что любое повреждение главных кровеносных сосудов в желточного мешка потенциально влияет на развитие эмбриона в культуре. Правильное эмбриональное развитие при поддержке, когда эмбрионы выводили из желточного мешка поддержания интактность сосудистой в желточного мешка. Предыдущие исследования показали, открытие желточного мешка, когда мышиные эмбрионы вне эмбриональной стадии E10 культивировали 1, 15, 18, 19. Соответственно, мы наблюдали дегенеративные изменения и эмбрионы не мог пережить период культуры, когда эмбрионы E10.5 культивировали с неповрежденной желточного мешка. Мы предполагаем, что экстериоризации из эмбрионов будет способствовать эффективной питательной Absorption через ткани при сохранении преемственности в сосудистой с желточного мешка. Эти эмбрионы в культуре выставлены эффективного сердцебиение и кровообращение в эмбриональных частей тела по сравнению с эмбрионами культивируемых без желточного мешка.
Поддержание эмбрионов в культуральной среде нагревают до 37 ° С с самого момента их изоляции от матки в момент культуры немедленно обеспечить лучшее подходящую среду для поддержания их способности для последующего развития в культуре. Это также предотвращает загрязнение из-за наличия антибиотиков в среде и позволяет избежать включения даже незначительных количеств PBS / DMEM в культуру. Определенной среде мы использовали дали превосходные эмбрионального развития по сравнению с другими установленными определенных средах, описанных ранее в Wawersik соавт. 20, 21 (данные не представлены). Разница в эмбриональном развитии может в основном быть связаноуникальных компонентов в нашей определенной среде, таких как, KnockOut Serum Replacement (KSR) и N-2 Приложении. В то время как N-2 Дополнение было показано, чтобы поддержать рост и экспрессию постмитотических нейронов, КСР было показано, что прямая замена эмбриональной телячьей сыворотки 22, 23. KSR был использован в культурах, чтобы поддержать рост недифференцированных плюрипотентных стволовых клеток, а также человека и эмбриональных стволовых клеток мыши, которые были показаны, чтобы быть стабильной и зародышевой линии компетентным 23-25. Помимо культуральной среды, концентрация кислорода в бутылке культуры играет важную роль в эмбриональном развитии. Эмбрионы не могли выжить условия 5% CO 2 в обычном инкубаторе. Хотя мы не проверяли другие концентрации кислорода и различных скоростей потока, как предполагалось ранее 5,9, использование 95% O 2/5% CO 2 в постоянном расходе выдержал живучести эмбрионов в культуре. В то время как вращениекультура бутылки необходимо, эмбрионы культивируют при тех же условиях, но без вращения культуральных флаконах в результате nonsurvival эмбрионов без видимого сердцебиение. Будем считать, что постоянная ротация (35 мин) в прокатном стане культуры бутылки включен свободный подвес эмбрионов в среде и, а усиливается поглощение питательных веществ и кислорода через эмбриональных тканей. Рост этих эмбрионов в культуре с точки зрения общего тела и головы размера, морфологии, формирование хорошо патрон сердца, головного мозга пузырьков и глазной развития был сопоставим с эмбрионов, развивающихся в матке. В наших руках, мы смогли повторить эмбрионального развития, что наблюдалось на Мур-Скотт и др. 15.
Эмбрионы в культуре выставлены диапазон роста и морфологического развития в зависимости от многих факторов (рис. 3; табл. 1). Под определенной культурыусловия, которые мы использовали, эмбрионы, культивированные в течение 16-18 часов показал сравнимую развитие той, которая наблюдается у эмбрионов, развивающихся в матке в около 58% эмбрионов, в то время как 28% показали средний и 14% показали слабое развитие. Расширение культуры до 38-40 часов дополнительно уменьшить возможность показать сравнимую развитие только 30-40% от общего объема эмбрионов, культивируемых. Помимо присущих факторов, которые потенциально влияют на эмбриональное развитие экс внутриутробно, много внешних факторов, которые могут управляться в определенной степени может играть важную роль, когда эмбрионы культивируют в течение длительного периода времени. Одним из таких потенциал фактором, который можно контролировать это время, необходимое от изоляции эмбрионов из матки до начала культуры. Это можно интерпретировать, что первые единичные эмбрионы подвергаются меньше кислорода в блюдо культуры по сравнению с эмбрионами, выделенных в конце, как и все эмбрионы пойти в бутылку культуры и получать 95% O 2/5% CO 2в то же время. Однако кислород доступен в крови, которая остается в плаценте после сегментного диссекции может не поддерживать в течение длительного периода времени и по этой причине большинство из культуральной оборудования и аппаратуры должны быть созданы готов к использованию до эвтаназии мыши. Мы обычно получаем эмбрионов в культуре в 25-30 мин с момента мышь эвтаназии. Этот короткий период времени, чтобы начать культуру не было бы возможным, если эмбрионы были быть обработаны по одному, как это предлагается в Зива, М. и др.. 18 Когда эмбрионы обрабатываются индивидуально, группировка эмбрионов невозможно, и каждый эмбрион должен быть Обновляется числа сомита. Эта процедура займет не менее 5-6 минут для каждого эмбриона, чтобы изолировать, экстериоризироваться от желтка, рассчитывать сомиты и трансфер в бутылке культуры. Для плодовитостью 10-12 эмбрионов, которые мы обычно получаем от наших CD-1 мышей, весь процесс займет 60-72 мин в течение последних нескольких эмбрионов, чтобы попасть в сulture. Это довольно длительный период, и мы наблюдали, биение сердца, чтобы замедлить и почти остановить, когда эмбрионы выводили и покинул его в PBS и отложен до культуры. Еще один потенциальный фактор может быть обращение или неправильной эмбрионов во время процедуры. Во время обработки, вы можете вызвать случайное повреждение какой-либо части тела или кровеносных сосудов в эмбриона или желточного мешка, который не легко обнаружить. Это может повлиять на развитие той части тела, а иногда и всей эмбриона, как это было отмечено, что даже хорошо развитый эмбрион иногда показывает вид под-развития на конечностях, как в зачатках конечностей и хвоста, указывающий недостаточное кровоснабжение. Лучше отказаться от таких эмбрионов, которые появляются могут быть нарушены или повреждены во время процедуры. Другая проблема, как правило, встречаются во время процедуры было, некоторые из эмбрионов с неповрежденными желтка мешок поддержать из резко от децидуальной на сегментной рассечения матки. Иногда это приводит к моповторно кровопотери в точке разделения из плаценты хотя сосудистую с желточного мешка остается неизменным. Эта потеря крови может повлиять на дальнейшее развитие эмбриона из-за меньшего количества крови сохраняется в эмбриональном тела во время разделения.
Помимо перечисленных выше факторов определенные условия, такие как, стадии эмбриона в момент запуска культуру влияние на развитие в культуре. Мы успешно культивируемые эмбрионы середине беременности мыши начиная с этапов, которые варьировались между 28-37 с для 16-40 ч и наблюдаемых некоторые различия в развитии. Эмбрионы в 34-36 с этапа выставлены лучшее развитие в культуре по сравнению с эмбрионами 30-33 с этапа с указанием увеличение адаптивности к условиям культивирования у эмбрионов, культивируемых на более поздних стадиях. Другой удивительный факт, что наблюдалось во время культивирования было развитие эмбрионов, когда два или более эмбрионов совместно культивировали (рис. 4). Сокультивирования resulteг к значительному улучшению в развитии в одном из эмбрионов по сравнению с другими эмбриона в 45% совместных культурах. Хотя эмбрионы из одной матки выглядеть примерно морфологически и в сомита подсчетам, по своей сути не существует двух эмбрионов не может быть на той же стадии развития, и это может быть одной из причин, на разницу развития в одном из эмбрионов по сравнению с другими в сокультивирования Система.
Таким образом, мы показали, что эмбрионы этап середине беременности мыши культивируют экс маточно в среде без сыворотки в атмосфере 95% O 2/5% СО 2 в прокатном стане культуры бутылки при 37 ° C рост выставочная и морфологического развития сопоставим с что наблюдается у эмбрионов, развивающихся в период внутриутробного развития. Мы считаем этот метод мыши системы эмбриона культуры будет полезна для лабораторий, нуждающихся использовать целые эмбрионы для изучения сигнальных взаимодействий важные в начале эмбрионального органогенеза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У нас нет каких-либо конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Джули Гордон и доктор Нэнси Мэнли за их полезные советы с техникой культуры. Эта работа была поддержана Детским глаукомы фонда и Шарон-Стюарт Аниридия Research Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KnockOut DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| N-2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock: 100x |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma | A9418-50G | Stock: 100% |
| Antibiotic - Antimycotic Solution | Cellgro | 30-004-Cl | Stock: Penicillin (10,000 IU/ml); Streptomycin (10,000 µg/ml; Amphotericin (250 µg/ml) |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| Precision Incubator Unit | B.T.C. Engineering Milton Cambridge England | Id.No. 840-374 | |
| Glass Bottles for Rotating Unit | B.T.C. Engineering | ||
| Silicone Rubber Cork | B.T.C. Engineering | ||
| 95% O2/5% CO2 Cylinder | AirGas Inc. | ||
| Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Stemi SV6 Microscope | Zeiss | ||
| CO2 Water Jacketed Incubator | Forma Scientific | Model: 3110 | |
| Culture Hood | Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2 | Model: Nu-425-600 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | IsoTemp205 | |
| Weigh Balance | Mettler Toledo | AG285 | |
| Centrifuge Tube, 50 ml | Corning | 430291 | |
| Light Operating Scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Operating Sharp-Blunt Scissors | Roboz | RS-6812 | |
| Microdissecting Forceps, 4 in | Roboz | RS-5211 | |
| Microdissecting Forceps - Hudson (cWALD), 4-3/4 in | Roboz | RS-5237 | |
| Microdissecting Tweezers (5/45) | Roboz | RS-5005 | Modified - Sharp ends were made blunt |
| Microdissecting Tweezers (5) | Roboz | RS-5060 | Modified - Sharp ends were made blunt |
| Microdissecting Tweezers (55) | Roboz | RS-5063 | Modified - Sharp ends were made blunt |
| Instrument Tray | Roboz | RT-1401S | |
| Instrument Tray Lid | Roboz | RT-1401L | |
| Petri Dish-100 mm | Fisher Scientific | 087571Z | |
| Petri Dish-60 mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Petri Dish-35 mm | Fisher Scientific | 0875711YZ | |
| Filter System ( 0.22 µm Cellulose Acetate)-150 ml | Corning | 431153 | |
| Filter System (0.22 µm Cellulose Acetate)-250 ml | Corning | 430756 | |
| Filter System (0.22 µm Cellulose Acetate)-500 ml | Corning | 430758 | |
| Pipet-aid Pipettor | Drummond Scientific Co. | D57849 | |
| Serological Pipette-10 ml | VWR | 89130-898 | |
| Disposable Serological Pipette-25 ml | Corning | 4251 | |
| Transfer Pipette - 7.7 ml | Thermo Scientific | 202-20S |
References
- Behesti, H., Holt, J. K., Sowden, J. C. The level of BMP4 signaling is critical for the regulation of distinct T-box gene expression domains and growth along the dorso-ventral axis of the optic cup. BMC Dev. Biol. 6, 62 (2006).
- Gray, J., Ross, M. E. Neural tube closure in mouse whole embryo culture. J. Vis. Exp. , (2011).
- Tam, P. P. Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation. Int. J. Dev. Biol. 42, 895-902 (1998).
- Miura, S., Mishina, Y. Whole-embryo culture of E5.5 mouse embryos: development to the gastrulation stage. Genesis. 37, 38-43 (2003).
- Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
- Yokoo, T., et al. Human mesenchymal stem cells in rodent whole-embryo culture are reprogrammed to contribute to kidney tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3296-3300 (2005).
- Sadler, T. W. Culture of early somite mouse embryos during organogenesis. J. Embryol. Exp. Morphol. 49, 17-25 (1979).
- Kitchin, K. T., Ebron, M. T. Further development of rodent whole embryo culture: solvent toxicity and water insoluble compound delivery system. Toxicology. 30, 45-57 (1984).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev. Growth Different. 50, 485-497 (2008).
- Cuthbertson, R. A., Beck, F. Postimplantation whole embryo culture: a new method for studying ocular development. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 31, 1653-1656 (1990).
- New, D. A. Development of explanted rat embryos in circulating medium. J. Embryol. Exp. Morphol. 17, 513-525 (1967).
- Chung, K. C., Park, J. H., Kim, C. H., Ahn, Y. S. Tumor necrosis factor-alpha and phorbol 12-myristate 13-acetate differentially modulate cytotoxic effect of nitric oxide generated by serum deprivation in neuronal PC12 cells. J. Neurochem. 72, 1482-1488 (1999).
- Sasaoka, T., et al. Evidence for a functional role of Shc proteins in mitogenic signaling induced by insulin, insulin-like growth factor-1, and epidermal growth factor. J. Biol. Chem. 269, 13689-13694 (1994).
- Chotani, M. A., Mitra, S., Eid, A. H., Han, S. A., Flavahan, N. A. Distinct cAMP signaling pathways differentially regulate alpha2C-adrenoceptor expression: role in serum induction in human arteriolar smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, 69-76 (2005).
- Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos. Genesis. 35, 164-168 (2003).
- Gordon, J., Moore, B. A., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Serum-Free Culture of Mid-gestation Mouse Embryos: A Tool for the Study of Endoderm-Derived Organs. Methods Mol. Biol. 1092, 183-194 (2014).
- New, D. A., Cockroft, D. L. A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase. Experientia. 35, 138-140 (1979).
- Cockroft, D. L. Development in culture of rat foetuses explanted at 12.5 and 13.5 days of gestation. J. Embryol. Exp. Morphol. 29, 473-483 (1973).
- Zeeb, M., et al. Pharmacological manipulation of blood and lymphatic vascularization in ex vivo-cultured mouse embryos. Nat. Protoc. 7, 1970-1982 (2012).
- Wawersik, S., et al. BMP7 acts in murine lens placode development. Dev. Biol. 207, 176-188 (1999).
- Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens. Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).
- Greenfield, J. P., et al. Estrogen lowers Alzheimer beta-amyloid generation by stimulating trans-Golgi network vesicle biogenesis. J. Biol. Chem. 277, 12128-12136 (2002).
- Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39, 100-104 (2004).
- Kim, J. B., et al. Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4. Nature. 461, 649-643 (2009).
- Totonchi, M., et al. Feeder- and serum-free establishment and expansion of human induced pluripotent stem cells. Int. J. Dev. Biol. 54, 877-886 (2010).
