Summary
血清中胚培养利用含有能影响实验特别是在涉及信令交互研究的结果未知组分。在这里，我们采用无血清培养充氧系统和显示，妊娠中期小鼠胚胎为16-40小时培养的表现出形态学发展媲美的胚胎在子宫内的发展。
Abstract
妊娠中期阶段的小鼠胚胎进行培养，利用从在充氧轧制瓶培养系统可商购的干细胞培养基补充剂制备的无血清培养基中。小鼠胚胎在E10.5小心地从具有完好卵黄囊子宫分离出，并在涉及精确的外科手术操纵过程将胚胎从卵黄囊，同时保持胚胎的血管连续性卵黄囊轻轻形象化。相较于准备与完整卵黄囊或卵黄囊的胚胎取出，这些胚胎表现出卓越的成活率和类似条件下发育进程，当培养。我们表明，这些小鼠胚胎，在95％O 2/5％CO 2中的滚动瓶培养装置，在37℃下进行16-40小时的气氛中定义的培养基中培养时，表现出形态生长和发育媲美在胚胎发展在子宫内 。我们相信钍方法是将调查员需要利用全胚胎培养研究在胚胎器官形成的重要信令的交互非常有用。
Introduction
在体外利用全胚胎培养方法非常适合学习信号参与胚胎器官形成是否则难以在子宫内的访问机制。全胚胎提供组织的完整性，并支持适当的组织相互作用，这对于及时出现信令机制必不可少的关键对于器官在不同的细胞过程。而全胚胎培养物提供了大量的应用，例如移植的研究，基因和组织操作，珠子植入研究，毒理学研究等的平台。目前用于胚胎培养系统主要依赖于血清对胚胎的正常生长和维持在培养1-9。
血清已被用作主要的组件，从培养基中6-8，10，11的10-100％1。;然而，血清的组合物不能很好地定义，并且可以从不同动物对动物和每个时间的血清被收集。虽然实验室制备血清非常耗时，而且涉及到严格的程序，血清采购商业呈现相当大的差异在不同的地段和提高实验成本。添加到这些时，血清可含有未知因素，如生长因子，激素，或其他蛋白质，这可能会影响某些实验的结果，尤其是那些涉及信号传导分子的组织相互作用重要的研究。研究表明，除了血清对培养物可以潜在地改变某些信号分子的细胞内水平，如环磷酸腺苷（cAMP）和参与有丝分裂信号和磷酸肌醇3蛋白（PI 3） -激酶信号通路12-14。违背这些中，无血清培养系统提供的抗原的环境的优点，从生物活性酶，可以改变细胞过程和禁欲令各个实验的一致性。
在本研究中，我们使用由市售的干细胞培养基补充剂准备培养妊娠中期阶段整个胚胎在95％O 2/5％CO 2中的滚动瓶培养装置的气氛中的无血清培养基中，在37 °Ç15,16。小鼠胚胎根据这些规定条件16至40小时培养的进展表现在整体胚胎体和不同的结构，如心脏，四肢，大脑和眼睛的形态发展，指示相应的细胞增殖，迁移，分化和组织的互动水平。在培养的复杂器官系统，如眼睛中的一个的胚胎发育的分子分析显示眼发展为与在眼组织中观察到EMBR一致YOS发展在子宫内 （Kalaskar和代尔堡，在准备中）。因此，我们表明，在妊娠中期阶段培养的小鼠胚胎中，表现出进行性生长和形态的发展相媲美，在胚胎在子宫内的发展变化。
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Protocol
小鼠胚胎培养：
所有试验程序都严格按照卫生指引，民族院校以下协议＃A2010 07-119，这是审查和批准格鲁吉亚实验动物管理和使用委员会，它保持持续监管的大学进行。
1。培养基的制备
- 淘汰赛的DMEM，淘汰赛血清替代品（KSR）（10％），N-2补编（1X），白蛋白，从牛血清（2％），青霉素（：使用以下金额市售的干细胞培养基和补充准备培养基50国际单位/毫升），链霉素（50微克/毫升）和两性霉素-B（1.25微克/毫升）。制备的培养基是类似于先前描述的15做出了以下改变：除了抗真菌剂和使用的抗生素两倍的浓度（对于特定的试剂和设备的细节，请参见李材料ST）。
注：抗生素浓度与先前使用（摩尔-斯科特， 等[15]）是足够的胚胎培养进行长达24小时的时间段。然而，当继续培养超过24小时，我们经历了文化的污染，这是成功的抗生素浓度倍增的控制。 - 储存媒体元件，在4°C或-20°C按照制造商的建议。 KSR和N-2补充应贮存在分装于-20℃，避免反复冻融。一旦打开淘汰赛的DMEM应在30天内予以确认按照制造商的建议。在使用之前，预热的水浴中的组分到37℃。
- 准备介质在无菌条件下。消毒的所有设备和包含它们放置在培养罩在媒体面前组件用70％的酒精喷雾瓶的表面。
- 媒体组件可以在无菌烧杯中，或者直接在过滤系统（Corning）中进行混合。首先，白蛋白粉末添加到淘汰赛的DMEM。通过轻轻晃动，直到白蛋白完全溶解调匀。然后加入N-2补充，KSR和抗生素，并用移液器调匀。然后过滤使用0.22微米孔径过滤器，真空吸消毒媒体。免除媒体到50ml锥形管，并储存在4℃直至使用。一旦准备的媒体应在4-5天培养使用。
2。文化生产设备的研制
- 消毒的玻璃培养瓶和橡胶瓶塞。包裹培养瓶在一个铝箔，并放置在橡胶瓶塞在水的烧杯中，并通过高压灭菌消毒。
- 开始培养前用70％的酒精喷雾和温暖至37°C杀菌文化室（精密孵化器单位）。文化室为e打趣说一个会滚动的圆盘在其持有的培养瓶的中心。气体流进腔室由一个压力计和调节流率可以通过观察通过水在玻璃管中，在结束了气泡的流出进行调节。此滚动瓶培养装置是由新的和Cockroft 17引入的原始设备的修改版本。
- 连接含有95％O 2/5％CO 2的混合气体在培养室中的气体钢瓶和调节气体流量为“每秒一个气泡”，这给出了50毫升/分钟的流速，并确保足够的氧供应向培养的胚胎。
3。小鼠胚胎的收集和准备文化
- 为了获得野生型小鼠胚胎中，我们利用C57BL/6J和CD-1（Charles River实验室）遗传背景品系的小鼠。
- 检查雌性小鼠阴道塞，每天早上。在发现日当天中午Ë阴道塞应被视为E0.5 DPC（天性交后）。
- 通过实施安乐死的孕鼠下列标准协议收集的小鼠胚胎在E10.5 DPC。小鼠利用CO 2吸入装置所指定的美国兽医协会（AVMA）准则动物的安乐死（2013）安乐死。以确保死亡，暴露于CO 2后进行颈椎脱位。
- 喷上腹部腹面表面70％的乙醇，以避免腹毛粘到仪器。然后用锋利的钝操作剪刀和在microdissecting镊子来定位子宫一对4-3/4腹侧打开腹腔。使用4中microdissecting钳子抬起整个子宫，并通过在子宫体和在子宫角的切割尖端具有光操作剪刀它从主体中分离出来。
- 赶紧用1X PBS漂洗整个子宫加热到37°C以除去任何血液附着于子宫，并立即在DMEM放置在培养皿中温热至37℃。进一步使用前用70％乙醇喷雾消毒器械。
注：预热的解决方案，包括PBS，DMEM培养液和培养基并在整个过程中保持它们在37℃的建议。 - 在解剖显微镜下，子宫应当节段性解剖与轻作业剪刀。这将导致在上分段子宫，通过该一对改性（钝端）microdissecting镊子可以轻轻地插入，以扩大开口的任一侧上的小开口。这允许胎盘蜕膜，然后可以通过用一对microdissecting镊子轻轻撕开以露出顶叶卵黄囊（PYS）与赖克特的膜被除去的曝光。使用镊子的一个边缘沿着与PYS轻轻刺破赖克特的膜并从日分开Ë相关卵黄囊（VYS）层，露出胚胎完好VYS。的外胎盘锥和trophoectoderm衍生物可以与胎盘蜕膜或与赖克特的膜被去除。必须小心，以避免VYS破裂作为胚胎马上弹出。
- 用完整VYS胚胎应被转移至培养皿含有用塑料移液管将培养基升温至37℃。
注：从子宫分离后，立即转移到培养液有助于获得更好的发展，文化的胚胎。 - 一个小的开放应以卵黄囊有一对microdissecting镊子避免大血管。一个尖锐的镊子可以使用在相邻的头部区域的区域轻轻地刺入，以使所述开口。备选地两对钝镊子可以用来保持卵黄囊，轻轻撕，使一个小开口。然后，通过扩大与镊子大小刚好适合胚胎头轻轻扩大开放。羊膜被紧紧缠绕的胚胎应轻轻持远离身体与使用一对镊子的撕裂。胚胎头部和后来的全胚胎应轻轻地从卵黄囊，同时维持胚胎脉管系统与卵黄囊15的的完整性形象化。
注：卵黄囊血管的任何损坏都可能影响到文化的胚胎发育。受损的血管，例如胚胎不应被用于培养，并且可以在用于分段以后可以丢弃的胚胎。 - 胚胎分期标准：检查解剖显微镜和组通过形态学标准包括身体和头部大小，四肢和眼的形态和阶段计数体节数（s）的各组至少两个胚胎在胚胎。
<STRONG>注：通常胚胎在子宫内的发育同一窝秀差异，并获得不同的车身尺寸，形态特征和体节数。然而，我们发现，胚胎由我们的形态学标准进行分组，通常具有相似的体节数（±1）。出于这个原因，它是不需要计数体节的每个胚胎，因为这会耽误时间，开始培养。
注：请不要使用被用来计数体节文化的胚胎。为了避免时延在开始培养开始培养对于其它胚后计数体节。被推迟到文化，从子宫分离后的胚胎通常表现出发育不良。 - 立即胚胎转移到培养皿用新鲜培养基加热到37℃，并把它的文化引擎盖那里的胚胎应再次转移到培养皿中，用无菌文化视角e媒体并将其放入培养瓶中等之前启动的文化。
注意：对于胚胎的多个媒体传输之前培养有助于防止污染作为其中未安装在培养罩在解剖显微镜下进行的不同步骤胚胎收集和清扫。
注意：当产仔数大（> 12个胚胎），进程一半的胚胎，并开始培养或把它们用在培养液中一盘，并将其放置在CO 2培养箱中在37°C当胚胎被留在外面的时间较长（> 35-40分钟），我们观察到的心跳减缓，这将影响到文化的后期发展。
4。培养小鼠胚胎
- 在文化引擎盖打开蒸压培养瓶，妥善贴上标签。传输3 ml培养介质中加热到37°C至每吨他的瓶子，然后将小鼠胚胎应该轻轻地转移到使用无菌塑料移液管转移的培养瓶。在培养瓶然后应上铺橡胶瓶塞，这有助于保持培养瓶在培养装置的滚盘。
注意：该培养瓶与媒体可制备并放置在培养装置的轧制盘安乐死的小鼠前。这样就缩短了时间为转移的胚胎放入培养瓶。
注意：小鼠胚胎可以单独使用或作为共培养物在相同的培养瓶2或3的胚胎培养。 - 培养瓶应在37℃下在无菌条件下进行的培养装置和紧钩他们在滚动圆盘与橡胶瓶塞的孔中。打开轧制盘以每分钟（rpm）35旋转而产生的恒定速度，这使得电磁制动的自由漂浮旋转在媒体上，也YOS由胚胎组织有助于游离气体交换。从连接到培养腔室中的气缸的气体流过滚盘和橡胶瓶塞入培养瓶。
- 文化的胚胎16-40小时，并定期检查是否有气体流出和文化室的温度。
注：鼠标操纵胚胎培养：让胚胎得到适应的文化条件下至少30分钟。那么表现不佳，并显示微弱心跳的胚胎可以被丢弃，剩余的胚胎可用于进一步的处理研究。胚胎操作，如电穿孔5,9,16，显微注射18，胎圈注入16，药物治疗和其它程序可以在此时执行。我们成功地完成与某些信号分子治疗研究它们在早期眼睛发育的作用阿菲 - 凝胶琼脂糖珠植入。后的胚胎操作可以返回回来的新鲜培养基，继续培养。 - 9-10小时和18-19小时的文化时，继续培养40小时后更换培养基完全新鲜的媒体在特定的时间间隔。
注：可以不要求培养基更换，如果文化是由16〜18小时停止。 - 在文化成功的措施：在培养胚胎存活率应可见心跳和血液循环在体内被确定，而在培养胚胎生长应该由增加的车身尺寸，体节数和头部，四肢，心脏和眼睛形态发育进行评估。
- 在子宫内的胚胎发展在E11.0 DPC（〜40-41次）和E12.0 DPC（〜49-50 s）应作为对照组进行比较胚胎16〜18小时和38-40小时，分别进行培养。
- 在过程中培养和宫内阶段的不同时间点胚胎发育可CAPT解剖显微镜下ured。现货成像软件是用来捕捉图像，使用图像处理软件后处理。
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Representative Results
小鼠胚胎的发育子宫外取决于从子宫从主体分离，以当时的胚胎进行培养的时间开始的多个因素。如描绘在图1中 ，该过程涉及一系列步骤，包括，妊娠子宫从主体分离（ 图1A），具有完整的卵黄囊（ 图1B）的胚胎的分离，从卵黄囊的胚外化（ 图1C），并在37℃下在95％O 2/5％CO 2中的滚动瓶培养装置的气氛下培养在无血清培养基中的胚胚胎表现出100％的存活率，当从子宫分离后立即转移到培养基。在这种培养条件下，小鼠胚胎时的16-40小时表现出增长和形态发育培养相媲美，在相当于阶段的胚胎发展的观察子宫内（ 图2）。
胚胎在E10.5（〜34-35次）（ 图2A）时，为16-40小时培养的存活和先进的发展远远超出了35秒的阶段。加入约5-6š显示一种体节，每两个半小时的文化生长速度和形态上均媲美E11.0（〜，16〜18小时培养（ 表1图2D和3B）后的胚胎在子宫内 （ 图2B和3A）开发40-41次）的胚胎。虽然开发被推迟了大约一个小时，这些胚胎在培养物呈现在车身尺寸和整体上升相称头具有鲜明的脑泡。胚胎还显示，发展中国家肢芽，形成一个良好腔心脏和外观色素沉着的视网膜色素上皮细胞。然而，这种类型的发展，观察约58％的教统局ryos培养而胚胎的28％表现出的中间发展（ 图3C）。这些后来的胚胎表现出了更小的车身尺寸虽然他们也有类似的体节数相比， 在子宫内的胚胎发展。他们有一个相对较小的头，虽然脑泡被划定。在心脏腔不分明和肢芽中的一些胚胎的四肢呈现暗区。在光谱的另一端，约14％的胚胎表现出发育不良的培养（ 图3D）。这些胚胎有更短的身体和头部的尺寸和显示出暗的区域在身体的某些部分表示的退行性改变。虽然心脏跳动是生病发达，缺乏分化成一些胚胎室而在其他四肢出现暗和迟缓的增长。
胚胎继续培养38-40小时（ 图2E，表1）SH欠约49-50 s和可比性，以E12.0胚胎（ 图2C） 在子宫内发展。虽然延迟了2-3小时，这些胚胎在培养物呈现比例增加的车身尺寸和显示相应的器官和组织分化中的色素沉着在头部区域的划分以及鼻子的视网膜色素上皮细胞的形成和发展变化。虽然在像肢芽和尾四肢某些部分似乎是欠发达，胚胎似乎是发展相媲美的子宫内的胚胎。然而，这样的发展中只有30-40％的培养（ 表1）的胚胎的观察，而他们的其余部分表现出一系列发育进程与生长迟缓的地区或欠发展在身体的某些部位或全胚胎。
除了在发展中的上述差异，我们观察到显著differe NCE在发展时，胚胎共培养在相同的培养瓶。相较于其他的胚胎（ 图4A和4A'）的共培养，在发达的胚胎（ 图4B和4B'）展示在胚胎发育的各个方面更好的成长。主要的差异，观察在整体车身尺寸与头部大小，有时在心脏和肢体发育。而从共培养发达的胚胎形态是堪比在子宫内发展的胚胎，在共培养其他的胚胎一直显得欠发达较发达的胚胎。观察到这种发展的差异，在共同培养的45％（N = 27），而共培养（N = 33），其余表现几乎相同的发展无论是在共同培养的胚胎。
Ë1“FO：内容宽度=”5英寸“FO：SRC =”/ files/ftp_upload/50803/50803fig1highres.jpg“SRC =”/ files/ftp_upload/50803/50803fig1.jpg“/>
图1中的步骤小鼠胚胎培养协议。（一 ）妊娠子宫与胚胎从母亲鼠标孤立。 （ 二）胚胎与完整卵黄囊子宫节段性切除后自蜕膜分离。从卵黄囊（C）胚胎形象化。在37°C（D）滚动瓶培养装置，并用95％O 2/5％的CO 2培养小鼠胚胎提供。 请点击此处查看该图的放大版本。
<BR /> 图2：胚胎在培养复制在子宫内发育， 在子宫内发育为10.5天（A），E11.0（B）和E12.0（C）。发展培养后18小时（D）和40小时（E）。 （E）中比例尺适用于所有面板。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3。胚胎发育中的文化。胚胎E11.0 DPC（A）。发展文化（B，C，D）的发展在子宫内 。 （二）表征的文化好胚胎发育。约58％的总胚胎的培养表现出类似的发展在子宫内的胚胎发展。 （C）表示在文化中间的发展。约28％的胚胎培养表演中间发展。 （D）表示在文化很差胚胎发育。约14％的胚胎表现出的文化发育不良。 （D）中比例尺适用于所有面板。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4。在共培养（ 一开始在小鼠胚胎共同培养系统。胚胎发育差异 >，B）。胚胎发育后16小时共培养（A'，B'）。一个在共培养（A'）的胚胎出现在尺寸比其他胚胎（B'中的共培养）。在（B'）比例尺适用于所有面板。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 16〜18小时培养胚胎总数 | 培养16〜18小时后的发展 | 为38-40小时培养胚胎总数 | 为培养38-40小时后的发展 | |||
| 好 | 中间 | 差 | 好 | 差 | ||
| 112 | 65 | 31 | 16 | 12 | 4 | 8 |
在小鼠胚胎培养体系见表1。发展胚胎，胚胎或者16-18小时或38-40小时培养。总112胚胎16-18小时，65（58％）的胚胎表现出类似的发展，胚胎在子宫内发展培养中，有31（28％）显示中间和16（14％）表现出发育不良。总12个胚胎进行39-40小时的培养，只有4个（〜35％）的胚胎表现出良好的发展，而其余表现不佳的发展。
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Discussion
妊娠中期阶段的小鼠胚胎在37℃下培养在无血清培养基中在95％O 2/5％CO 2中的滚动瓶培养装置的气氛中胚胎发育子宫外是极其依赖于多种因素，在每一步从子宫从安乐死的小鼠中分离的培养完成（ 图1）时的过程中。对影响发展的最重要因素是开始培养所需的时间。需要最关心的过程中的其它关键点包括以下步骤：如胚胎从子宫完好卵黄囊和从卵黄囊胚的外化的分离。由于啮齿动物有盘状胎盘，子宫节段性切除不损伤血液供应，胚胎即使胎盘蜕膜轻微受损的角落。事实上，这留下了一个小口EI热敏端通过一对钝钳可以插入，轻轻撕开子宫和胎盘蜕膜实现与完整卵黄囊的胚胎易于分离。然而，从卵黄囊的胚胎外化的下一步是在关键的主要血管中的卵黄囊任何损坏将潜在地影响胚胎的培养液中的发展。当胚胎的卵黄囊形象化维持血管的完整性在卵黄囊适当胚胎发育受到支持。以前的研究已经表明卵黄囊开幕时，小鼠胚胎超越萌芽阶段E10培养1，15，18，19。因此，我们观察到的退行性变化和胚胎培养期间无法生存时，E10.5胚胎与完整卵黄囊培养。我们假设胚胎的外化将有利于有效养份的bsorption通过组织，同时保持在脉管系统的连续性与卵黄囊。这些胚胎在培养物呈现有效的心脏跳动和血液循环在胚胎的身体部位相比，培养的胚胎没有卵黄囊。
维持胚胎的培养液中加热到37°C从右侧它们是从子宫中分离培养的时间的时候会立即提供最适合的环境，以维持其在文化以后的发展能力。这也防止污染由于抗生素的培养基中存在，并避免甚至微量的PBS / DMEM中掺入培养。相比以前在Wawersik 等 20描述的其他规定建立媒体，21（数据未显示），我们已利用确定的培养基中产生了卓越的胚胎发育。在胚胎发育上的差异，主要是由于在我们确定的培养基中的独特成分，例如，淘汰赛血清替代品（KSR）和N-2补充。而N-2，补编结果表明，以支持有丝分裂后神经元的生长和表达，KSR被证明是直接替换胎牛血清22,23。 KSR被用于培养以支持未分化的多能干细胞的生长，以及被证明是稳定的和种系主管23-25 人类和小鼠胚胎干细胞。除了在培养基中，在培养瓶中的氧浓度在胚胎发育中起着关键作用。胚胎无法生存在传统的恒温箱，5％CO 2的条件。虽然我们还没有测试其他氧气浓度和不同流速曾建议5,9，使用95％O 2/5％的CO 2以恒定流量维持了胚胎的生存能力的培养。而旋转培养瓶是必要的，胚胎时在相同条件下但与培养瓶的无旋转培养导致nonsurvival没有可见心跳的胚胎。我们假定恒定旋转（35转）中的滚动瓶培养装置使胚胎在培养基中自由悬浮和以及增强的养分和氧气通过胚胎组织的吸收。这些胚胎在文化的整体身体和头部大小，形态，形成一个良好的腔心脏，脑泡和眼发展方面的增长相媲美，胚胎在子宫内发展的。在我们手中，我们能复制，观察由Moore -斯科特等人 15的胚胎发育
在培养的胚胎显示出一系列生长和形态发展取决于多种因素（ 图3，表1）。根据界定文化我们使用的条件下，胚胎16〜18小时培养表现出类似的发展，在发展中的胚胎在子宫内约58％的胚胎中观察到的，而28％显示中间，14％表现出很差的发展。延长培养至38〜40小时，进一步降低到显示可比发展到只有30-40％的总胚胎培养的能力。除了 固有因素可能影响胚胎发育的前宫内 ，许多可管理在一定程度上外部因素可能发挥关键作用的时候胚胎的时间长度延长培养。可以控制这样的一个潜在因素是从子宫胚胎的隔离带至培养开始的时间。它可以解释该第一隔离的胚胎暴露于氧气少在培养皿相比孤立在末尾，因为所有的胚胎进入培养瓶和接收95％O 2/5％CO 2的胚胎在同一时间。然而，在这留在胎盘段解剖后的可用血液中的氧可能不适合在相当长时间内支持基于这个原因，大多数的文化设备及仪器应设立准备实施安乐死鼠标之前可以使用。通常我们取得的胚胎成25-30分钟的文化从小鼠安乐死的时间。这样短的时间内开始培养将是不可能的，如果胚胎在一个时间作为Zeeb建议进行处理1，M. 等人 。18当胚胎被单独处理，胚胎的分组是不可能的，每个胚胎应计数体节数。这个过程至少需要5-6分钟为每个胚胎分离，exteriorize从卵黄囊，计数体节和转移到培养瓶。 10-12胚胎，即我们通常从我们的CD-1小鼠的产仔数，整个过程需时60-72分钟过去数胚胎来获得进入culture。这是相当长的时期，我们观察到心脏跳动减慢，几乎停止，当胚胎被形象化，并留在PBS中，延迟到文化。另一种潜在的因素可能是在手术过程中的胚胎的处理或错误处理。处理过程中，你可能诱发以在不容易发现的胚胎或卵黄囊体内或血管的某一部分的意外损坏。这可能会影响身体，有时整个胚胎的那部分的发展，因为它是观察到，即使是发达的胚胎有时显示一种欠发展状肢芽和尾肢的指示供血不足。这是更好地丢弃，出现在手术过程中被破坏或损坏，这样的胚胎。通常在手术过程中遇到的另一个问题是，在子宫切除节段性突然有些具有完整卵黄囊的胚胎托从蜕膜。这有时会导致莫重新失血从胎盘分离点虽然与卵黄囊血管保持不变。这个失血量可影响胚胎的后期发展，由于较少分离期间保留在胚胎体的血液量。
除了上述的因素，例如，胚胎在开始培养时的阶段目标条件的影响在培养的发展。我们成功培养妊娠中期小鼠胚胎开始与28-37之间不等s为16-40小时，观察到在发展中的一些分歧阶段。胚胎在34-36舞台具有较好的发展，在文化相比，胚胎在30-33舞台指示要培养条件增加适应性的胚胎在后期培养。培养过程中，观察到其它令人惊讶的事实是，当两个或多个胚胎共培养胚胎的发育（ 图4）。共培养resulteD在发展显著改善相比，在共培养物中的45％的其它胚胎的胚胎中的一个。虽然来自同一个子宫的胚胎看起来相似形态和体节数，本质上没有两个胚胎可以在同一发展阶段，这可能是在胚胎之一，相比其他在共培养的原因，发育差1制度。
因此，我们表明，在95％O 2/5％CO 2中的滚动瓶培养装置，在37℃表现出生长和形态学发育媲美的气氛中的无血清培养基妊娠中期阶段的小鼠胚胎培养的子宫外胚胎在子宫内发展的观察。我们相信，小鼠胚胎培养体系的这种方法将是实验室需要利用整个胚胎研究在早期胚胎器官形成的重要信令的交互非常有用。
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Disclosures
我们没有任何竞争的经济利益。
Acknowledgments
我们要感谢朱莉戈登博士和南希·曼利博士为他们有益的建议与栽培技术。这项工作已经由儿童青光眼基金会和莎朗 - 斯图尔特无虹膜研究信托基金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KnockOut DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| N-2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock: 100x |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma | A9418-50G | Stock: 100% |
| Antibiotic - Antimycotic Solution | Cellgro | 30-004-Cl | Stock: Penicillin (10,000 IU/ml); Streptomycin (10,000 µg/ml; Amphotericin (250 µg/ml) |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| Precision Incubator Unit | B.T.C. Engineering Milton Cambridge England | Id.No. 840-374 | |
| Glass Bottles for Rotating Unit | B.T.C. Engineering | ||
| Silicone Rubber Cork | B.T.C. Engineering | ||
| 95% O2/5% CO2 Cylinder | AirGas Inc. | ||
| Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Stemi SV6 Microscope | Zeiss | ||
| CO2 Water Jacketed Incubator | Forma Scientific | Model: 3110 | |
| Culture Hood | Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2 | Model: Nu-425-600 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | IsoTemp205 | |
| Weigh Balance | Mettler Toledo | AG285 | |
| Centrifuge Tube, 50 ml | Corning | 430291 | |
| Light Operating Scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Operating Sharp-Blunt Scissors | Roboz | RS-6812 | |
| Microdissecting Forceps, 4 in | Roboz | RS-5211 | |
| Microdissecting Forceps - Hudson (cWALD), 4-3/4 in | Roboz | RS-5237 | |
| Microdissecting Tweezers (5/45) | Roboz | RS-5005 | Modified - Sharp ends were made blunt |
| Microdissecting Tweezers (5) | Roboz | RS-5060 | Modified - Sharp ends were made blunt |
| Microdissecting Tweezers (55) | Roboz | RS-5063 | Modified - Sharp ends were made blunt |
| Instrument Tray | Roboz | RT-1401S | |
| Instrument Tray Lid | Roboz | RT-1401L | |
| Petri Dish-100 mm | Fisher Scientific | 087571Z | |
| Petri Dish-60 mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Petri Dish-35 mm | Fisher Scientific | 0875711YZ | |
| Filter System ( 0.22 µm Cellulose Acetate)-150 ml | Corning | 431153 | |
| Filter System (0.22 µm Cellulose Acetate)-250 ml | Corning | 430756 | |
| Filter System (0.22 µm Cellulose Acetate)-500 ml | Corning | 430758 | |
| Pipet-aid Pipettor | Drummond Scientific Co. | D57849 | |
| Serological Pipette-10 ml | VWR | 89130-898 | |
| Disposable Serological Pipette-25 ml | Corning | 4251 | |
| Transfer Pipette - 7.7 ml | Thermo Scientific | 202-20S |
References
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