Summary
El suero utilizado en los cultivos de embriones contiene componentes desconocidos que pueden afectar el resultado de los experimentos sobre todo en los estudios que involucran interacciones de señalización. Aquí hemos utilizado un sistema de cultivo oxigenada libre de suero y mostramos que los embriones mitad de la gestación de ratón en cultivo de 16-40 horas exhiben desarrollo morfológico comparable a los embriones en desarrollo en el útero.
Abstract
Embriones mitad de la gestación etapa de ratón se cultivaron utilizando un medio de cultivo libre de suero preparado a partir de suplementos de medios de células madre disponibles en el mercado en un sistema de cultivo de botella de laminación oxigenada. Los embriones de ratón en E10.5 fueron cuidadosamente aislados del útero con saco vitelino intacto y en un proceso que implica la maniobra quirúrgica precisa los embriones se exteriorizaron suavemente desde el saco vitelino, mientras que el mantenimiento de la continuidad vascular del embrión con el saco vitelino. En comparación con los embriones preparados con saco vitelino intacto o con el saco vitelino se eliminan, estos embriones exhiben tasa de supervivencia superior y la progresión del desarrollo cuando se cultivan en condiciones similares. Se demuestra que estos embriones de ratón, cuando se cultivan en un medio definido en una atmósfera de 95% O 2/5% de CO 2 en un aparato de cultivo botella rodante a 37 ° C durante 16-40 horas, muestran un crecimiento y desarrollo morfológico comparable a los embriones en desarrollo en el útero. Creemos thes el método será útil para los investigadores que necesitan para utilizar el cultivo de embriones conjunto para estudiar las interacciones de señalización importantes en la organogénesis embrionaria.
Introduction
In vitro, utilizando métodos de cultivo de embriones en su conjunto son muy adecuados para estudiar los mecanismos involucrados en la organogénesis embrionaria que son difíciles de acceder en el útero de señalización. Embriones enteros proporcionan la integridad de los tejidos y el apoyo adecuados para las interacciones de tejidos que son cruciales para la aparición oportuna de los mecanismos esenciales de señalización para diferentes procesos celulares durante la organogénesis. Mientras que los cultivos de embriones enteros proporcionan una plataforma para una gran cantidad de aplicaciones, tales como estudios de trasplante, las manipulaciones genéticas y de tejidos, estudios de implantación del grano, los estudios toxicológicos, etc., Los sistemas de cultivo de embriones utilizados actualmente son principalmente dependientes de suero para el crecimiento y mantenimiento de los embriones en la cultura de 1-9.
El suero se ha utilizado como uno de los principales componentes que van desde 10-100% de los medios de cultivo 6-8, 10, 11.; Sin embargo, la composición de suero no está bien definida y puede variar de animal a animal y cada vez que se recogió el suero. Si bien la preparación de laboratorio de suero es mucho tiempo e implica procedimientos estrictos, suero adquirido comercialmente exhibe una gran variabilidad entre los distintos lotes y aumenta los costes de experimentación. Sumado a esto, el suero puede contener factores desconocidos, tales como factores de crecimiento, hormonas u otras proteínas, que pueden afectar potencialmente el resultado de ciertos experimentos, especialmente aquellos que involucran el estudio de las moléculas de señalización importantes en las interacciones de tejidos. Los estudios han demostrado que la adición de suero a la cultura puede potencialmente alterar los niveles intracelulares de ciertas moléculas de señalización tales como monofosfato de adenosina cíclico (AMPc) y de las proteínas implicadas en la señalización mitogénica y la fosfoinositida 3 (PI-3)-quinasa vías de señalización 12-14. Contrariamente a esto, un sistema de cultivo libre de suero proporciona las ventajas de ambiente libre de antígenos,abstinencia de enzimas biológicamente activas que pueden alterar los procesos celulares y permite la coherencia entre experimentos.
En el presente estudio, se utilizó un medio de cultivo libre de suero preparado a partir de suplementos de medios de células madre disponibles en el mercado a la cultura de la etapa de mediados de la gestación de embriones enteros en una atmósfera de 95% O 2/5% de CO 2 en un aparato de cultivo botella rodante a 37 ° C 15,16. Los embriones de ratón cultivados durante 16 a 40 h bajo estas condiciones definidas exhiben la progresión en el desarrollo morfológico de cuerpo y diferentes estructuras embrionarias generales tales como el corazón, las extremidades, el cerebro y los ojos que indica los niveles apropiados de la proliferación celular, la migración, la diferenciación y las interacciones de tejido. El análisis molecular del desarrollo embrionario en el cultivo para uno de los sistemas de órganos complejos como el ojo reveló el desarrollo ocular para ser consistente con la observada en el tejido ocular en EMBRyos en desarrollo en el útero (Kalaskar y Lauderdale, en preparación). Por lo tanto nos muestran que los embriones de ratón en cultivo en la etapa mitad de la gestación, exhiben crecimiento progresivo y el desarrollo morfológico comparable a la observada en los embriones en desarrollo en el útero.
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Protocol
Ratón cultivo de embriones:
Todos los procedimientos experimentales se realizaron en estricto acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud siguiendo el protocolo # A2010 07-119, el cual fue revisado y aprobado por la Universidad de Georgia Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión, que mantiene continua supervisión regulatoria.
1. Preparación de medios de cultivo
- Preparar medio de cultivo utilizando los medios de comunicación y suplementos de células madre disponibles en el mercado en las siguientes cantidades: Maravilla DMEM, Reemplazo golpe de gracia suero (KSR) (10%), N-2 del Suplemento (1x), Albúmina de Suero Bovino (2%), penicilina ( 50 UI / ml), estreptomicina (50 mg / ml) y anfotericina-B (1,25 g / ml). El medio de cultivo preparado es similar a la descrita previamente 15 con los siguientes cambios: la adición de antimicóticos y usando dos veces la concentración de antibióticos (para los detalles de los reactivos y equipos específicos, ver Liº de Materiales).
Nota: La concentración de los antibióticos que se utilizó anteriormente (. Moore-Scott, et al 15) fue suficiente para los cultivos de embriones llevaron hasta un 24 período de tiempo hr. Sin embargo, cuando se continuó la cultura más allá de las 24 horas, experimentamos contaminación del cultivo y esto fue controlado con éxito por la duplicación de la concentración del antibiótico. - Guarde los componentes de los medios a 4 º C o a -20 ° C según las recomendaciones del fabricante. KSR y N-2 Suplemento deben almacenarse en alícuotas a -20 ° C para evitar los ciclos de congelación y descongelación. Golpe de gracia DMEM una vez abierto debe ser utilizada dentro de 30 días de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Antes de su uso, calentar los componentes en un baño de agua a 37 ° C.
- Preparar los medios de comunicación en condiciones estériles. Desinfectar la superficie de todo el equipo y las botellas que contienen los componentes de los medios con un 70% de rociado de alcohol antes de colocarlos en la campana de cultivo.
- Los componentes de medios se pueden mezclar ya sea en un vaso de precipitados estéril o directamente en el sistema de filtro (Corning). Primero se debe agregar el polvo de albúmina para el golpe de gracia DMEM. Mezclar bien agitando suavemente hasta que la albúmina se disuelva completamente. A continuación, añadir el suplemento N-2, KSR y los antibióticos y mezclar bien usando una pipeta. Luego filtrar esterilizar los medios de comunicación utilizando un filtro de tamaño de poro de 0,22 micras con succión de vacío. Distribuir el medio en 50 ml tubos cónicos y se almacenan a 4 ° C hasta su uso. Los medios de comunicación, una vez preparadas se deben usar dentro de 4-5 días para la cultura.
2. Preparación del Equipo de Cultura
- Esterilizar los frascos de cultivo de vidrio y tapones de goma. Envuelva las botellas de cultivo en una lámina de aluminio y los tapones de goma en un vaso de agua y esterilizar en autoclave.
- Esterilizar la cámara de cultivo (unidad de precisión Incubadora) con 70% de pulverización de alcohol y se calienta a 37 ° C antes de comenzar la cultura. La cámara de cultivo es equipped con un disco de rodadura en el centro que sostiene los frascos de cultivo. El flujo de gas en la cámara está regulada por un medidor de presión y la velocidad de flujo se puede ajustar mediante la observación del flujo de salida de burbujas de aire a través del agua en un tubo de vidrio en el extremo. Este aparato de cultivo botella rodando es una versión modificada del aparato original introducidos por Nueva Cockroft y 17.
- Conectar un cilindro de gas que contiene una mezcla de gases de 95% de O2 / 5% de CO 2 a la cámara de cultivo y ajustar el flujo de gas a "una burbuja de aire por segundo" que da una velocidad de flujo de 50 cc / min y asegura el suministro de oxígeno adecuado para los embriones de cultivo.
3. Embrión de ratón Recogida y preparación para la Cultura
- Para obtener embriones de ratón de tipo salvaje, hemos utilizado ratones de C57BL/6J y CD-1 (Charles River Laboratories) cepas fondo genético.
- Compruebe los ratones hembra para tapones vaginales cada mañana los días. El mediodía del día de encontrar the tapón vaginal debe ser considerado como E0.5 dpc (días post coito).
- Recoger los embriones de ratón en E10.5 dpc por la eutanasia de los ratones embarazadas siguiendo protocolos estándar. Los ratones fueron sacrificados utilizando un dispositivo de inhalación de CO 2 según lo especificado por la Asociación Americana de Medicina Veterinaria (AVMA) Directrices para la Eutanasia de los Animales (2013). Para asegurarse de la muerte, la dislocación cervical se realizó después de la exposición al CO 2.
- Pulverizar etanol al 70% en la superficie ventral abdominal para evitar que se pegue de pelo abdominal para los instrumentos. A continuación, abra la cavidad abdominal ventral utilizando un afiladas tijeras contundente de operación y un par de 4-3/4 en microdissecting fórceps para localizar el útero. El uso de un 4 en fórceps microdissecting levantar todo el útero y la separan del cuerpo mediante el corte con una luz de tijeras de funcionamiento en el cuerpo uterino y en las puntas de los cuernos uterinos.
- Enjuagar rápidamente todo el útero en 1x PBS calentó a 37 ° Cpara eliminar cualquier adherencia de sangre hacia el útero y colocar inmediatamente en DMEM calentó a 37 ° C en una placa de Petri. Esterilice los instrumentos en un 70% de pulverización de etanol antes de su uso posterior.
Nota: se recomienda el precalentamiento de la soluciones incluyendo la PBS, DMEM y el medio de cultivo y manteniéndolas a 37 ° C durante todo el procedimiento. - Bajo un microscopio de disección, el útero debe segmentariamente disecado con una luz de tijeras de funcionamiento. Esto da lugar a pequeñas aberturas en cada lado del útero segmentado a través del cual un par de pinzas microdissecting modificados (extremos romos) se puede insertar suavemente para ensanchar la abertura. Esto permite la exposición de la decidua de la placenta, que luego se puede quitar rasgando suavemente con un par de pinzas microdissecting para exponer el saco vitelino parietal (PYS) con la membrana de Reichert. El uso de uno de los bordes de las pinzas perforar suavemente la membrana de Reichert junto con los PYS y separada de la ªe subyacente saco vitelino visceral (VYS) capa para exponer los embriones con VYS intactas. El cono ectoplacentario y los derivados trofoectodermo se pueden eliminar ya sea con la decidua placentaria o con la membrana de Reichert. Se debe tener cuidado para evitar la ruptura de la VYS como los embriones se salgan inmediatamente.
- Los embriones con VYS intactos deben ser transferidos a una placa de Petri que contiene el medio de cultivo se calentó a 37 ° C utilizando una pipeta de transferencia de plástico.
Nota: Traslado al medio de cultivo inmediatamente después de la separación del útero ayuda para un mejor desarrollo del embrión en la cultura. - Una pequeña abertura se debe hacer en el saco vitelino con un par de pinzas microdissecting evitando los vasos sanguíneos principales. Un fuerte par de pinzas se puede utilizar para hacer la abertura por la perforación suavemente en un área adyacente a la región de la cabeza. Alternativamente dos pares de pinzas romas pueden ser usados para sostener el saco vitelino y suavemente romper para hacer una pequeña abertura.Luego ampliar suavemente la abertura mediante la ampliación con las pinzas a un tamaño lo suficiente para que la cabeza embrionaria. La membrana amniótica que está terminando de cerca el embrión se celebrara suavemente lejos del cuerpo y desgarrado utilizando un par de pinzas. La cabeza embrionario y después todo el embrión se deben exteriorizaron suavemente desde el saco vitelino, mientras que el mantenimiento de la integridad de la vasculatura embrionaria con la de la yema de salida 15.
Nota: Cualquier daño a la vasculatura del saco vitelino puede afectar potencialmente el desarrollo del embrión en el cultivo. Tales embriones con vasculatura dañada no deben utilizarse para la cultura y pueden ser utilizados para la organización de los embriones que luego pueden ser descartados. - Criterios de estadificación embrionarias: Examine los embriones bajo el microscopio de disección y agrupar por criterios morfológicos, incluyendo el cuerpo y el tamaño de la cabeza, las extremidades y la morfología de los ojos y el escenario contando el número de somitas (s) durante al menos dos embriones de cada grupo.
<strong> Nota: Por lo general, los embriones obtenidos a partir de la misma camada muestran diferencias en el desarrollo en el útero y se diferencian en el tamaño corporal, características morfológicas y número de somitas. Sin embargo, se encontró que los embriones agrupados por nuestros criterios morfológicos generalmente exhiben número somite similares (± 1). Por esta razón, no es necesario contar somitas para cada embrión ya que esto sería retrasar el tiempo para el inicio de la cultura.
Nota: No utilizar los embriones que se utilizaron para contar los somitas para la cultura. Contar las somitas después de comenzar el cultivo durante otros embriones con el fin de evitar el retardo de tiempo en el inicio de la cultura. Los embriones que se retrasaron a la cultura después de la separación del útero por lo general presentan un escaso desarrollo. - La transferencia de los embriones de inmediato a una placa de Petri con medio de cultivo fresco calentado a 37 ° C y llevarlo a la campana de cultivo, donde los embriones de nuevo deben ser transferidos a una placa de Petri con cultur estérilmedios electrónicos antes de ponerlos en los frascos de cultivo con medio para iniciar el cultivo.
Nota: Las múltiples transferencias de medios de comunicación para los embriones antes de la cultura ayuda en la prevención de la contaminación como los diferentes pasos de recogida de embriones y la disección se realizaron bajo un microscopio de disección que no fue instalado en la campana de cultivo.
Nota: Cuando el tamaño de la camada es grande (> 12 embriones), proceso de la mitad de los embriones y comenzar la cultura o los puso en un plato con medio de cultivo y colocarlo en una incubadora de CO 2 a 37 ° C. Cuando los embriones fueron dejados afuera por períodos más largos (> 35 a 40 min) observamos los latidos del corazón para reducir la velocidad y esto afectará el desarrollo posterior en la cultura.
4. El cultivo de embriones de ratón
- Abra los frascos de cultivo en autoclave en la campana de cultivo y adecuadamente etiquetarlos. Transferencia de 3 ml de medio de cultivo se calentó a 37 ° C a cada uno de tas botellas y luego los embriones de ratón se deben transferir suavemente en los frascos de cultivo utilizando pipetas de transferencia de plástico estériles. Los frascos de cultivo deben entonces ser tapados con tapones de goma que ayudan a mantener las botellas de cultivo para el disco móvil en el aparato de cultivo.
Nota: Los frascos de cultivo con los medios de comunicación se pueden preparar y se colocan en el disco de rodadura del aparato de cultivo antes de la eutanasia de los ratones. Esto acorta el tiempo para la transferencia de embriones en los frascos de cultivo.
Nota: Los embriones de ratón se pueden cultivar de forma individual o como cocultivos con dos o tres embriones en la misma botella de cultivo. - Los frascos de cultivo deben realizarse asépticamente al aparato de cultivo a 37 ° C y herméticamente ellos enganchan en los agujeros en el disco de rodadura con los tapones de goma. Encienda el disco de rodadura para girar a una velocidad constante de 35 revoluciones por minuto (rpm), que permite la flotación libre de la EMBRyos en los medios de comunicación y también ayuda en el intercambio de gases liberados por el tejido embrionario. El gas desde el cilindro conectado a la cámara de cultivo fluye a través del disco de rodadura y los tapones de goma en los frascos de cultivo.
- Cultura de los embriones para 16-40 horas y regularmente comprueban para la salida del gas y la temperatura de la cámara de cultivo.
Nota: la manipulación de embriones de ratón en cultivo: Dejad que los embriones consiguen adaptarse a las condiciones de cultivo durante al menos 30 min. Luego los embriones que funcionan mal y que muestra los latidos del corazón débiles pueden ser descartados y los embriones restantes pueden ser utilizados para estudios posteriores de manipulación. Manipulaciones de embriones, tales como 5,9,16 electroporación, microinyección 18, la implantación de bolas 16, el tratamiento de drogas y otros procedimientos se pueden realizar en este momento. Se realizó con éxito la implantación de bolas de agarosa afi-gel tratados con ciertas moléculas de señalización para estudiar su papel en el desarrollo del ojo antes de tiempo. Los embriones después demanipulaciones pueden ser devueltos de nuevo en un medio fresco y continuaron en la cultura. - Vuelva a colocar los medios de cultivo totalmente con medio fresco a intervalos específicos después de 9-10 horas y 18-19 horas de cultivo en que se continuó el cultivo durante 40 h.
Nota: Cultura reemplazo de medios puede no ser necesaria si la cultura es detenido por 16-18 horas. - Medidas de éxito en la cultura: la supervivencia embrionaria en la cultura debe ser determinado por los latidos del corazón visible y la circulación sanguínea en el cuerpo, mientras que el crecimiento embrionario en la cultura debe ser evaluado por un aumento en el tamaño corporal, el número de somitas y el desarrollo morfológico de la cabeza, las extremidades, el corazón y los ojos.
- En el útero desarrollado embriones en E11.0 dpc (~ 40-41 s) y E12.0 dpc (~ 49-50 s) se debe utilizar como controles para la comparación de los embriones cultivados durante 16-18 horas y 38-40 horas, respectivamente.
- El desarrollo embrionario en diferentes momentos durante el cultivo y para en etapas útero puede CAPTureD bajo microscopio de disección. Software de imágenes al contado se utilizó para capturar las imágenes y luego procesados en el programa de procesamiento de imágenes.
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Representative Results
Desarrollo de embriones de ratón depende fuera del útero de múltiples factores a partir de la hora del útero está aislado del cuerpo a la vez que los embriones se cultivan. Como se representa en la Figura 1, el procedimiento implica una serie de etapas que incluyen, la separación del útero grávido del cuerpo (Figura 1A), el aislamiento de los embriones con saco vitelino intacta (Figura 1B), exteriorización de los embriones desde el saco vitelino ( Figura 1C) y el cultivo de los embriones en un medio libre de suero en una atmósfera de 95% O 2/5% de CO 2 en un aparato de cultivo botella rodante a 37 ° C. Los embriones mostraron 100% de supervivencia cuando se transfiere en medio de cultivo inmediatamente después de la separación del útero. Bajo estas condiciones de cultivo, los embriones de ratón cuando se cultivaron durante 16-40 horas exhibido crecimiento y desarrollo morfológico comparable al observado en los embriones en estadio de desarrollo equivalentes enútero (Figura 2).
Los embriones en E10.5 (~ 34-35 s) (Figura 2A) cuando se cultivaron durante 16-40 horas sobrevivieron y avanzada en el desarrollo más allá de la etapa de 35 s. Los embriones después de 16 a 18 h en cultivo (Figuras 2D y 3B, Tabla 1) añaden unos 5-6 s exhibiendo una tasa de crecimiento de uno por cada somite dos horas y media en la cultura y eran morfológicamente similar a E11.0 (~ 40-41 s), los embriones se desarrollan en el útero (Figuras 2B y 3A). Aunque el desarrollo se retrasó por una hora aproximadamente, estos embriones en cultivo mostraron un aumento general en el tamaño del cuerpo y una cabeza proporcionada con vesículas cerebrales distintas. Los embriones también mostraron el desarrollo de yemas de las extremidades, la formación de un corazón en la recámara y el aspecto de la pigmentación en el epitelio pigmentario de la retina. Sin embargo, este tipo de desarrollo se observó en aproximadamente 58% de la embryos cultivaron mientras que el 28% de los embriones mostraron un desarrollo intermedio (Figura 3C). Estos embriones posteriores mostraron un menor tamaño corporal a pesar de que tenían un recuento somito similar en comparación con los embriones en el útero desarrollado. Tenían una cabeza relativamente pequeña, aunque se demarcaron las vesículas cerebrales. Las cámaras del corazón no eran distintos y las yemas de las extremidades en algunos embriones exhiben áreas oscuras en las extremidades. En el otro extremo del espectro, aproximadamente el 14% de los embriones exhiben un pobre desarrollo en el cultivo (Figura 3D). Estos embriones tenían cuerpo y la cabeza tamaños más cortos y mostraron áreas oscuras en algunas partes del cuerpo que indican cambios degenerativos. Aunque el corazón le latía era enfermo desarrollada y carente de diferenciación dentro de las cámaras en algunos embriones, mientras que en otros las extremidades parecían oscuras y retraso en el crecimiento.
Los embriones siguieron en cultivo durante 38 a 40 h (Figura 2E, Tabla 1) shadeuda unos 49-50 s, y fueron comparables a los embriones E12.0 (Figura 2 C), desarrollado en el útero. Aunque con retraso por 2-3 horas, estos embriones en cultivo exhibieron incremento proporcional en el tamaño del cuerpo y mostraron la organogénesis y la diferenciación de tejido apropiada como se observa en el desarrollo de la pigmentación en el epitelio pigmentado de la retina y formación de un hocico bien delimitada en la región de la cabeza. Aunque algunas partes de las extremidades, como las yemas de las extremidades y la cola que parecía ser subdesarrollado, los embriones parecían estar desarrollando comparable a los embriones en el útero. Sin embargo, se observó este tipo de desarrollo en sólo el 30-40% de los embriones cultivados (Tabla 1) mientras que el resto de ellos mostró una gama de etapas del desarrollo con áreas de crecimiento retardado o bajo desarrollo en algunas partes del cuerpo o la toda embrión.
Aparte de las diferencias mencionadas anteriormente en el desarrollo, se observó una significativa difere nce en desarrollo cuando los embriones se cocultured en la misma botella de cultivo. En comparación con el otro embrión (Figuras 4A y 4A ') en el cocultivo, el embrión bien desarrollado (Figuras 4B y 4B') exhibió un mejor crecimiento en todos los aspectos del desarrollo embrionario. No se observaron diferencias importantes en el tamaño total del cuerpo y el tamaño de la cabeza y, a veces, en el corazón y el desarrollo de las extremidades. Mientras que el embrión bien desarrollado desde el cocultivo era morfológicamente comparable a los embriones en desarrollo en el útero, el otro embrión en el cocultivo siempre ha parecido ser menos desarrollada en comparación con el embrión bien desarrollado. Este tipo de diferencia en el desarrollo se observó en 45% de los cocultivos (N = 27), mientras que el resto de los cocultivos (N = 33) mostraron un desarrollo casi similar en ambos los embriones en el cocultivo.
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Figura 1. Pasos en ratón protocolo de cultivo de embriones. (A) útero grávido con embriones aislados del ratón madre. (B) Los embriones con saco vitelino intacta separado de decidua después de la disección segmentaria de útero. (C) Los embriones exterioriza desde el saco vitelino. (D) aparato de cultivo botella rodante a 37 ° C y se suministra con 95% O 2/5% CO 2 para el cultivo de embriones de ratón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
<br /> Figura 2. Los embriones en cultivo replicar en el desarrollo de útero. En el desarrollo de útero en E10.5 (A), E11.0 (B) y E12.0 (C). Desarrollo de la cultura después de 18 horas (D) y 40 h (E). La barra de escala en (E) se aplica a todos los paneles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Desarrollo embrionario en la cultura. Embriones desarrollado en el útero en E11.0 dpc (A). Desarrollo en cultivo (B, C, D). (B) Representación de un buen desarrollo embrionario en la cultura. Alrededor del 58% de los embriones totales cultivadas exhiben desarrollo comparable en el útero los embriones desarrollados. (C) Representación de desarrollo intermedio en la cultura. Alrededor del 28% de los embriones cultivados espectáculo desarrollo intermedio. (D) Representación de un pobre desarrollo embrionario en la cultura. Alrededor del 14% de embriones muestran un escaso desarrollo en la cultura. La barra de escala en (D) se aplica a todos los paneles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Las diferencias de desarrollo en el sistema de co-cultivo de embriones de ratón. Embriones al inicio del co-cultivo (A B). El desarrollo embrionario después de 16 h de cocultivo (A ', B'). Uno de los embriones en el co-cultivo (A ') aparece de tamaño muy pequeño en comparación con el otro embrión (B') en el co-cultivo. La barra de escala en (B ') se aplica a todos los paneles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Embriones totales cultivaron durante 16-18 horas | Desarrollo Después de cultivar durante 16-18 horas | Embriones totales cultivaron durante 38-40 horas | Desarrollo Después de cultivar durante 38-40 horas | |||
| Bueno | Intermedio | Pobre | Bueno | Pobre | ||
| 112 | 65 | 31 | 16 | 12 | 4 | 8 |
Tabla 1. Desarrollo de embriones de ratón en el sistema de cultivo de embriones. Los embriones se cultivaron durante 16-18 horas o bien 38 a 40 h. Del total de 112 embriones se cultivaron durante 16-18 horas, 65 (58%) los embriones exhiben desarrollo comparable al de los embriones en desarrollo en el útero, 31 (28%) mostraron intermedio y 16 (14%) mostraron un pobre desarrollo. Del total de 12 embriones se cultivaron durante 39-40 horas, sólo 4 (~ 35%), los embriones mostraron un buen desarrollo, mientras que el resto mostró un pobre desarrollo.
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Discussion
Embriones mitad de la gestación etapa de ratón se cultivaron en un medio de cultivo libre de suero en una atmósfera de 95% O 2/5% de CO 2 en un aparato de cultivo botella rodante a 37 ° C. El desarrollo del embrión fuera del útero era críticamente dependientes de varios factores en cada paso durante el procedimiento desde el momento en el útero se aisló a partir de los ratones sacrificados a la finalización de la cultura (Figura 1). El factor más importante que influyó en el desarrollo fue el tiempo necesario para iniciar el cultivo. Los otros puntos críticos durante el procedimiento que requieren más cuidados incluyen las medidas como la separación de los embriones con intacta saco vitelino del útero y la exteriorización de los embriones desde el saco vitelino. Como los roedores tienen placenta discoide, la disección segmentaria del útero no dañar el suministro de sangre al embrión incluso si la decidua placentaria está dañado ligeramente en las esquinas. De hecho esto dejó una pequeña abertura en la IEther extremo a través de la cual un par de fórceps romos se puede insertar a rasgar suavemente abierto el útero y la placenta decidua que permite un fácil aislamiento de los embriones con saco vitelino intacto. Sin embargo, el siguiente paso de exteriorización de los embriones desde el saco vitelino es crítico en que cualquier daño a los principales vasos sanguíneos en el saco vitelino sería potencialmente efectuar el desarrollo del embrión en el cultivo. El desarrollo embrionario adecuado fue apoyada cuando los embriones se exteriorizaron desde el saco vitelino el mantenimiento de la integridad de la vasculatura en el saco vitelino. Estudios previos han indicado la apertura del saco vitelino de embriones de ratón cuando más allá de la etapa embrionaria E10 se cultivaron 1, 15, 18, 19. En consecuencia, hemos observado cambios degenerativos y los embriones no podría sobrevivir el período de cultivo cuando E10.5 embriones se cultivaron con saco vitelino intacto. Asumimos la exteriorización de los embriones facilitaría un nutriente eficazbsorption través de los tejidos, mientras que el mantenimiento de la continuidad en la vasculatura con el saco vitelino. Estos embriones en cultivo exhibieron latido cardíaco eficaz y la circulación sanguínea en las partes del cuerpo de embriones en comparación con los embriones cultivados sin el saco vitelino.
El mantenimiento de los embriones en el medio de cultivo se calentó a 37 ° C desde el momento en que están aislados desde el útero hasta el momento de la cultura proporcionaría de inmediato el mejor entorno adecuado para mantener su capacidad para el desarrollo posterior de la cultura. Esto también evita la contaminación debido a la presencia de antibióticos en el medio y evita la incorporación de cantidades incluso ínfimas de PBS / DMEM en la cultura. El medio definido hemos utilizado produjo el desarrollo embrionario superior en comparación con otros medios de comunicación establecidos definidos previamente descritos en Wawersik et al. 20, 21 (datos no mostrados). La diferencia en el desarrollo embrionario podría ser debido principalmentea los componentes únicos en nuestro medio definido, tales como, suero sustitución Knockout (KSR) y N-2 Suplemento. Si bien las N-2 Suplemento se muestra para apoyar el crecimiento y la expresión de las neuronas post-mitóticas, KSR ha demostrado ser un reemplazo directo para el suero bovino fetal al 22, 23. KSR fue utilizado en las culturas para apoyar el crecimiento de las células madre pluripotentes no diferenciadas, así como las células madre embrionarias humanas y de ratón que fueron mostrados para ser estable y la línea germinal competente 23-25. Además del medio de cultivo, la concentración de oxígeno en la botella la cultura juega un papel crítico en el desarrollo embrionario. Los embriones no pueden sobrevivir a las condiciones de 5% de CO2 en una incubadora convencional. Aunque no hemos probado otras concentraciones de oxígeno y diferentes velocidades de flujo como sugerido anteriormente 5,9, el uso de 95% O 2/5% CO 2 a un caudal constante ha mantenido la capacidad de supervivencia de los embriones en la cultura. Mientras que la rotación defrascos de cultivo es necesario, los embriones cuando se cultiva en las mismas condiciones, pero sin la rotación de las botellas de cultivo resultó en no supervivencia de los embriones sin latido del corazón visibles. Suponemos que la rotación constante (35 rpm) en el aparato de cultivo botella rodante habilitado suspensión libre de los embriones en el medio y así mejorar la absorción de nutrientes y oxígeno a través de los tejidos embrionarios. El crecimiento de estos embriones en la cultura en términos de cuerpo y la cabeza tamaño general, la morfología, la formación de un corazón bien-compartimentado, vesículas cerebrales y el desarrollo ocular era comparable a la de los embriones en desarrollo en el útero. En nuestras manos, hemos sido capaces de replicar el desarrollo embrionario que se observó por Moore-Scott et al. 15
Los embriones en el cultivo mostró una gama de crecimiento y desarrollo morfológico en función de múltiples factores (Figura 3, Tabla 1). Bajo el cultivo definidocondiciones que utilizamos, los embriones se cultivaron durante 16-18 horas mostraron un desarrollo comparable al observado en los embriones en desarrollo en el útero, en alrededor del 58% de los embriones, mientras que el 28% mostró intermedio y el 14% mostró un pobre desarrollo. Extensión de la cultura de 38-40 horas se redujo aún más la capacidad de mostrar el desarrollo comparables a sólo el 30-40% del total de los embriones cultivados. Aparte de los factores inherentes que potencialmente influyen en el desarrollo embrionario fuera del útero, hay muchos factores externos que se pueden gestionar hasta cierto punto puede jugar un papel crítico en que los embriones se cultivan durante un largo período de tiempo. Uno de esos factores potencial que puede ser controlada es el tiempo transcurrido desde el aislamiento de los embriones desde el útero hasta el inicio de la cultura. Se puede interpretar que los primeros embriones aislados están expuestos a menos oxígeno en la placa de cultivo en comparación con los embriones aislados en el extremo como todos los embriones entran en la botella de cultivo y reciben 95% de O2 / 5% de CO 2al mismo tiempo. Sin embargo, la disponibilidad de oxígeno en la sangre que queda en la placenta después de la disección segmentaria puede no soportar durante largos periodos de tiempo y por esta razón la mayoría de los equipos y aparatos de la cultura debe ser configurado listo para ser utilizado antes de la eutanasia de ratón. Normalmente nos los embriones en la cultura, en 25-30 minutos desde el momento en que el ratón fue sacrificado. Este corto periodo de tiempo para iniciar la cultura no sería posible si los embriones eran para ser procesados de uno en uno como se sugiere en Zeeb, M. et al. 18 Cuando los embriones se procesan individualmente, agrupación de embriones no es posible y cada embrión debe ser contado para el número de somitas. Este procedimiento podría tomar por lo menos 5-6 minutos por cada embrión para aislar, exteriorizar de saco vitelino, cuente somitas y la transferencia a la botella de cultivo. Para un tamaño de camada de 10 a 12 embriones, que por lo general que obtenemos de nuestros ratones CD-1, todo el proceso tardaría 60-72 min durante los últimos embriones para entrar en el culture. Esto es bastante largo período y observamos los latidos del corazón para reducir la velocidad y casi detenerse cuando los embriones se exteriorizan y se dejan en PBS y se retrasaron a la cultura. Otro factor potencial podría ser la manipulación o mal manejo de los embriones durante el procedimiento. Durante la manipulación, puede inducir un daño accidental a alguna parte del cuerpo o de los vasos sanguíneos en el embrión o el saco vitelino que no se detecta fácilmente. Esto puede afectar el desarrollo de la parte del cuerpo o, a veces todo el embrión, ya que se observó que incluso un embrión bien desarrollado algunas veces muestra un tipo de desarrollo bajo-en los extremos como las yemas de las extremidades y la cola que indica el suministro de sangre insuficiente. Es mejor descartar tales embriones que parecen estar en peligro o dañado durante el procedimiento. El otro problema que suele aparecer durante el procedimiento era, algunos de los embriones con saco vitelino intactas prop a cabo abruptamente de la decidua la disección segmentaria del útero. Esto a veces se traduce en movolver a la pérdida de sangre en el punto de separación de la placenta a pesar de la vasculatura con el saco vitelino permanece intacta. Esta pérdida de sangre puede afectar el desarrollo posterior del embrión debido a la menor cantidad de sangre retenida en el cuerpo embrionario durante la separación.
Además de los factores antes mencionados ciertas condiciones como, la etapa de embrión en el momento de iniciar la cultura influyeron en el desarrollo de la cultura. Nosotros exitosamente cultivadas de embriones de ratón mediados de la gestación a partir de las etapas que oscilaron entre 28-37 s de 16 a 40 h, y observaron algunas diferencias en el desarrollo. Los embriones en la fase de 34-36 s mostraron un mejor desarrollo en el cultivo en comparación con los embriones en la fase de 30-33 s que indican un aumento en la capacidad de adaptación a las condiciones de cultivo en embriones cultivados en etapas posteriores. El otro hecho sorprendente que se observó durante el cultivo fue el desarrollo de los embriones cuando se cocultivaron dos o más embriones (Figura 4). Resulte Cocultured en una mejora significativa en el desarrollo en uno de los embriones en comparación con el otro embrión en 45% de los cocultivos. Aunque los embriones del mismo útero se parecen morfológicamente y en el recuento de somite, inherentemente no hay dos embriones pueden estar en la misma fase de desarrollo y esto podría ser una de las razones de la diferencia en el desarrollo de uno de los embriones en comparación con el otro en el co-cultivo sistema.
De esta manera se muestra que los embriones etapa de mediados de la gestación del ratón cultivadas ex utero en un medio libre de suero en una atmósfera de 95% O 2/5% de CO 2 en un aparato de cultivo botella rodante a 37 ° C el crecimiento de exposiciones y el desarrollo morfológico comparable a que se observa en los embriones en desarrollo en el útero. Creemos que este método de ratón sistema de cultivo de embriones será útil para los laboratorios que necesitan para utilizar embriones enteros para estudiar las interacciones de señalización importantes a principios de la organogénesis embrionaria.
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Disclosures
Nosotros no tenemos intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a la Dra. Julie Gordon y el Dr. Nancy Manley por sus consejos útiles con la técnica de cultivo. Este trabajo ha sido apoyado por la Fundación del Niño Glaucoma y Sharon-Stewart Aniridia Research Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KnockOut DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| N-2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock: 100x |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma | A9418-50G | Stock: 100% |
| Antibiotic - Antimycotic Solution | Cellgro | 30-004-Cl | Stock: Penicillin (10,000 IU/ml); Streptomycin (10,000 µg/ml; Amphotericin (250 µg/ml) |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| Precision Incubator Unit | B.T.C. Engineering Milton Cambridge England | Id.No. 840-374 | |
| Glass Bottles for Rotating Unit | B.T.C. Engineering | ||
| Silicone Rubber Cork | B.T.C. Engineering | ||
| 95% O2/5% CO2 Cylinder | AirGas Inc. | ||
| Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Stemi SV6 Microscope | Zeiss | ||
| CO2 Water Jacketed Incubator | Forma Scientific | Model: 3110 | |
| Culture Hood | Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2 | Model: Nu-425-600 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | IsoTemp205 | |
| Weigh Balance | Mettler Toledo | AG285 | |
| Centrifuge Tube, 50 ml | Corning | 430291 | |
| Light Operating Scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Operating Sharp-Blunt Scissors | Roboz | RS-6812 | |
| Microdissecting Forceps, 4 in | Roboz | RS-5211 | |
| Microdissecting Forceps - Hudson (cWALD), 4-3/4 in | Roboz | RS-5237 | |
| Microdissecting Tweezers (5/45) | Roboz | RS-5005 | Modified - Sharp ends were made blunt |
| Microdissecting Tweezers (5) | Roboz | RS-5060 | Modified - Sharp ends were made blunt |
| Microdissecting Tweezers (55) | Roboz | RS-5063 | Modified - Sharp ends were made blunt |
| Instrument Tray | Roboz | RT-1401S | |
| Instrument Tray Lid | Roboz | RT-1401L | |
| Petri Dish-100 mm | Fisher Scientific | 087571Z | |
| Petri Dish-60 mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Petri Dish-35 mm | Fisher Scientific | 0875711YZ | |
| Filter System ( 0.22 µm Cellulose Acetate)-150 ml | Corning | 431153 | |
| Filter System (0.22 µm Cellulose Acetate)-250 ml | Corning | 430756 | |
| Filter System (0.22 µm Cellulose Acetate)-500 ml | Corning | 430758 | |
| Pipet-aid Pipettor | Drummond Scientific Co. | D57849 | |
| Serological Pipette-10 ml | VWR | 89130-898 | |
| Disposable Serological Pipette-25 ml | Corning | 4251 | |
| Transfer Pipette - 7.7 ml | Thermo Scientific | 202-20S |
References
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