Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Muis embryonale ontwikkeling in een Serumvrij Hele Embryo Cultuur System

Published: March 1, 2014 doi: 10.3791/50803

Summary

Serum gebruikt in embryocultures bevat onbekende componenten die het resultaat van experimenten vooral in studies met signalering interacties beïnvloeden. Hier gebruikte we een serumvrij zuurstof kweeksysteem aantonen dat mid-dracht muizenembryo's gekweekt gedurende 16-40 uur vertonen morfologische ontwikkeling vergelijkbaar embryo ontwikkeling in utero.

Abstract

Mid-dracht stadium muizenembryo's werden gekweekt met behulp van een serum-vrij kweekmedium bereid uit in de handel verkrijgbare stamcel media supplementen in een zuurstofrijk rollende fles kweeksysteem. Muizenembryo's op E10.5 werden zorgvuldig geïsoleerd uit de baarmoeder met intacte dooierzak en werkwijzen waarbij nauwkeurige chirurgische handeling de embryo voorzichtig werden naar buiten gebracht vanuit de dooierzak terwijl de vasculaire continuïteit van de embryo met de dooierzak. Vergeleken met embryo's voorbereid met intacte dooierzak of met de dooierzak verwijderd, deze embryo's tentoongesteld superieure overleving en ontwikkeling progressie indien gekweekt onder vergelijkbare omstandigheden. We zien dat deze muizenembryo's, indien gekweekt in een gedefinieerde medium in een atmosfeer van 95% O 2/5% CO 2 in een rollende fles kweek inrichting bij 37 ° C gedurende 16-40 uur, vertonen morfologische groei en ontwikkeling vergelijkbaar de embryo ontwikkeling in utero. Wij geloven eis de methode nuttig zal zijn voor onderzoekers om hele embryo cultuur gebruiken om signalering interacties belangrijk in embryonale organogenese bestuderen.

Introduction

In vitro kweek methoden gebruik te maken van hele embryo's zijn zeer geschikt om te studeren signalering mechanismen die betrokken zijn bij de embryonale organogenese die anders moeilijk te bereiken in de baarmoeder. Hele embryo's bieden de weefsel integriteit en geschikt is voor het weefsel interacties die cruciaal zijn voor het tijdig voorkomen van signaleringsmechanismen essentieel zijn ondersteuning voor verschillende cellulaire processen tijdens organogenese. Terwijl de hele embryo culturen bieden een platform voor een overvloed aan toepassingen zoals transplantatie studies, genetische en weefsel manipulaties, kraal implantatie studies, toxicologische studies, enz., Momenteel toegepast embryo cultuur systemen zijn voornamelijk afhankelijk van het serum voor een goede groei en het onderhoud van de embryo's in de cultuur 1-9.

Serum is gebruikt als een van de belangrijkste componenten vinden van 10-100% van het kweekmedium 6-8, 10, 11., De samenstelling van serum is niet goed gedefinieerd en kunnen van dier tot dier en elke keer het serum verzameld. Terwijl laboratorium voorbereiding van het serum is tijdrovend en het gaat om strenge procedures, serum verkregen commercieel vertoont een aanzienlijke variatie tussen verschillende partijen en verhoogt experimentele kosten. Naast deze, kan het serum onbekende factoren zoals groeifactoren, hormonen of andere eiwitten, die mogelijk invloed hebben op de uitkomst van bepaalde experimenten, met name die de studie van signaalmoleculen belangrijk weefselinteractie inhouden. Studies hebben aangetoond dat toevoeging van serum cultuur mogelijk de intracellulaire niveaus van bepaalde signaalmoleculen zoals cyclisch adenosine monofosfaat (cAMP) en eiwitten betrokken bij mitogene signalering en fosfoinositide 3 (PI3)-kinase signaalwegen 12-14 kan veranderen. Anders dan deze, een serumvrije biedt de voordelen van antigeen vrije omgeving,onthouding van biologisch actieve enzymen die de cellulaire processen veranderen en maakt samenhang tussen experimenten.

In de huidige studie hebben we gebruik gemaakt van een serum-vrij kweekmedium bereid uit in de handel verkrijgbare stamcel media aanvullingen op cultuur medio zwangerschap stadium hele embryo's in een atmosfeer van 95% O 2/5% CO 2 in een rollende fles cultuur apparaat bij 37 ° C 15,16. Muizenembryo's gekweekt gedurende 16-40 uur onder deze gedefinieerde omstandigheden vertoonden progressie morfologische ontwikkeling van embryonale totale lichaam en verschillende structuren zoals het hart, ledematen, hersenen en de ogen aangeeft passende niveaus van cellulaire proliferatie, migratie, differentiatie en weefsel interacties. Moleculaire analyse van de embryonale ontwikkeling in de cultuur van een van de complexe orgaansystemen zoals het oog bleek de oculaire ontwikkeling overeen met die waargenomen bij oculaire weefsel embr teJo's ontwikkelen in de baarmoeder (Kalaskar en Lauderdale, in voorbereiding). Zo tonen we muizenembryo's gekweekt halverwege zwangerschap stadium vertonen progressieve groei en morfologische ontwikkeling vergelijkbaar met die waargenomen bij embryo ontwikkeling in utero.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Muizenembryo cultuur:

Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de National Institutes of Health richtlijnen volgende protocol # A2010 07-119, die werd beoordeeld en door de Universiteit van Georgia Institutional Animal Care en gebruik Comite, dat bleef regelgevend toezicht houdt goedgekeurd.

1. Voorbereiding van Cultuur Media

  1. Bereid kweekmedium in de handel verkrijgbare stamcel media en supplementen in de volgende hoeveelheden: KnockOut DMEM, KnockOut Serum Vervangende (KSR) (10%) N-2 supplement (1x), albumine uit runderserum (2%), penicilline ( 50 IE / ml), streptomycine (50 ug / ml) en amfotericine B (1,25 ug / ml). Het kweekmedium bereid is gelijk aan die eerder beschreven 15 met de volgende wijzigingen: toevoeging van antimycotica en met tweemaal de concentratie antibiotica (voor details van specifieke reagentia en apparatuur, zie List van Materialen).
    Opmerking: antibioticumconcentratie zoals eerder gebruikt (. Moore-Scott, et al. 15) was voldoende voor embryocultures uitgevoerd tot 24 uur periode. Wanneer cultuur na 24 uur werd voortgezet, we ondervonden verontreiniging van de kweek en dit werd succesvol gecontroleerd door een verdubbeling van de concentratie antibioticum.
  2. Bewaar de mediacomponenten bij 4 ° C of bij -20 ° C volgens aanbevelingen van de fabrikant. KSR en N-2 supplement worden in porties bewaard bij -20 ° C tot herhaaldelijk bevriezen en ontdooien te voorkomen. KnockOut DMEM eenmaal geopend moet worden gebruikt binnen 30 dagen volgens aanbevelingen van de fabrikant. Voor gebruik verwarmen van de componenten in een waterbad tot 37 ° C.
  3. Bereid de media onder steriele omstandigheden. Ontsmet het oppervlak van alle apparatuur en flessen die de media componenten met 70% alcohol spuiten voordat u ze in de cultuur kap.
  4. De media componenten kunnen hetzij in een steriele beker of direct in het filtersysteem (Corning) gemengd. Voeg eerst de albumine poeder om de knock-out DMEM. Meng goed door zachtjes schudden totdat de albumine volledig oplost. Voeg vervolgens de N-2 Supplement, KSR en de antibiotica en meng met behulp van een pipet. Vervolgens filteren steriliseren de media met behulp van een 0,22 um poriegrootte filter met afzuiging. Breng het materiaal in 50 ml conische buizen en bewaar bij 4 ° C tot gebruik. De media eenmaal voorbereid moeten worden gebruikt binnen 4-5 dagen voor cultuur.

2. Voorbereiding van Cultuur Equipment

  1. Steriliseer de glazen cultuur flessen en rubber kurken. Wikkel de cultuur flessen in een aluminiumfolie en plaats de rubber kurken in een water beker en steriliseer in de autoclaaf.
  2. Steriliseer de cultuur kamer (Precision Incubator Unit) met 70% alcohol spray en warm tot 37 ° C voordat de cultuur. De cultuur kamer is egrapte met een rollende schijf in het midden, die de cultuur flessen houdt. Gasstroom in de kamer wordt geregeld door een manometer en het debiet kan door het observeren van de uitstroom van luchtbellen door het water in een glazen buis aan het einde. Deze rollende fles cultuur apparaat is een aangepaste versie van het originele apparaat geïntroduceerd door nieuwe en Cockroft 17.
  3. Sluit een gasfles met een gasmengsel van 95% O 2/5% CO 2 bij de kweekkamer en stel de gasstroom "een luchtbel per seconde" met een stroomsnelheid van 50 cc / min geeft en dat een adequate zuurstoftoevoer de cultuur embryo.

3. Muis Embryo verzamelen en bereiden voor Cultuur

  1. Met wild-type muis embryo's te verkrijgen, hebben we gebruik gemaakt van muizen C57BL/6J en CD-1 (Charles River Laboratories) genetische achtergrond stammen.
  2. Controleer de vrouwelijke muizen voor vaginale plugs elke dag 's ochtends. Het uur op de dag van het vinden van the vaginale plug moet worden beschouwd als E0.5 DPC (dagen na de coïtus).
  3. Verzamel muizenembryo's op E10.5 dpc door euthanizing de zwangere muizen volgende standaard protocollen. Muizen werden gedood met behulp van een CO 2 inhalatie-apparaat, zoals gespecificeerd door de American Veterinary Medical Association (AVMA) Richtsnoeren voor de euthanasie van dieren (2013). Om dodelijke verzekeren, werd cervicale dislocatie uitgevoerd na blootstelling aan CO2.
  4. Spray 70% ethanol aan de ventrale abdominale oppervlak kleven van abdominale haar te vermijden de instrumenten. Open vervolgens de buikholte ventraal met een scherp-botte operationele schaar en een paar 4-3/4 in microdissecting tang om de baarmoeder te lokaliseren. Met een 4 in microdissecting tang heffen de gehele baarmoeder en scheiden van het lichaam door snijden met een lichte werkende schaar op de baarmoeder lichaam en bij de uiteinden van de baarmoederhoorns.
  5. Snel spoel de gehele baarmoeder in 1x PBS verwarmd tot 37 ° Ceen bloedtest plakken verwijderen om de baarmoeder en direct plaats in DMEM verwarmd tot 37 ° C in een petrischaal. Steriliseren van de instrumenten met 70% ethanol spuiten vóór verder gebruik.
    Opmerking: Voorverwarmen oplossingen waaronder PBS, DMEM en het kweekmedium en handhaven ervan bij 37 ° C gedurende de gehele procedure wordt aanbevolen.
  6. Onder een microscoop ontleden, moet de baarmoeder per segment worden ontleed met een lichte operationele schaar. Dit resulteert in kleine openingen aan weerszijden van de gesegmenteerde baarmoeder waardoor een paar gemodificeerde (afgestompte uiteinden) microdissecting pincet voorzichtig kan worden opgenomen de opening verbreden. Hierdoor kan de blootstelling van de placenta decidua, die vervolgens kan worden verwijderd door voorzichtig scheuren met een paar microdissecting pincet om de pariëtale dooierzak (PYS) bloot aan de Reichert's membraan. Met de ene rand van de pincet voorzichtig doorboren de Reichert's membraan met de PYS en scheiden van ee van viscerale dooierzak (VYS) laag om de embryo's bloot met intacte VYS. De ectoplacental kegel en trophoectoderm derivaten kunnen worden verwijderd of met de placenta decidua of de Reichert's membraan. Zorg moeten worden genomen om breuk van de VYS voorkomen als de embryo's pop uit onmiddellijk.
  7. De embryo's met intacte VYS moet dan worden overgebracht naar een petrischaal met het kweekmedium verwarmd tot 37 ° C met een plastic overdracht pipet.
    Opmerking: Transfer naar kweekmedium direct na afscheiding van baarmoeder draagt ​​voor een betere ontwikkeling van het embryo in kweek.
  8. Een kleine opening moet worden gemaakt in de dooierzak met een paar pincetten microdissecting grote bloedvaten voorkomen. Een scherpe pincet kan worden gebruikt om de opening te maken door voorzichtig piercing in een gebied grenzend aan het hoofdgebied. Ook twee paar stompe pincet kan worden gebruikt om de dooierzak houden en voorzichtig scheuren een kleine opening te maken.Dan zachtjes verbreden de opening door de uitbreiding met de pincet om juist groot genoeg om de embryonale hoofd past. De amnionmembraan die nauw wikkelen het embryo moet voorzichtig van het lichaam worden gehouden en gescheurd met een pincet. De embryonale hoofd en later het hele embryo moet voorzichtig worden naar buiten gebracht uit de dooierzak behoud van de integriteit van de embryonale vasculatuur met die van de dooierzak 15.
    Opmerking: Eventuele schade aan de dooierzak vaatstelsel kan mogelijk invloed hebben op de ontwikkeling van het embryo in de cultuur. Dergelijke embryo's met beschadigde bloedvaten mag niet worden gebruikt voor kweek en kan worden gebruikt voor het organiseren van de embryo's die later kunnen worden verwijderd.
  9. Embryonale staging criteria: Onderzoek de embryo's onder de microscoop ontleden en groeperen op morfologische criteria, waaronder lichaam en hoofd grootte, ledematen en oog morfologie en het stadium door het tellen van het aantal somiet (s) gedurende ten minste twee embryo's van elke groep.
    <strong> Opmerking: Meestal embryo's verkregen uit hetzelfde nest vertonen verschillen in de ontwikkeling in de baarmoeder en verschillen in lichaamsgrootte, morfologische kenmerken en het aantal somieten. Toch vonden we dat embryo's gegroepeerd op onze morfologische criteria meestal tentoongesteld soortgelijke somiet nummer (± 1). Daarom is het niet nodig om voor elk embryo somieten tellen omdat dit de tijd voor het starten van de kweek vertragen.
    Opmerking: de embryo's die werden gebruikt om de somieten voor cultuur tellen niet gebruiken. Tel de somieten na aanvang van de kweek van andere embryo's om de vertraging in het starten van de kweek te voorkomen. De embryo's die werden uitgesteld tot cultuur na afscheiding van de baarmoeder meestal vertonen een slechte ontwikkeling.
  10. Breng de embryo onmiddellijk een petrischaal met vers kweekmedium verwarmd tot 37 ° C en het naar de cultuur kap wanneer de embryo weer worden overgebracht naar een petrischaal met steriele cule media alvorens ze in de cultuur flessen met medium om de cultuur te starten.
    Opmerking: De meerdere media transfers voor de embryo's vóór cultuur helpt bij het ​​voorkomen van besmetting met de verschillende stappen van het embryo en de dissectie werden uitgevoerd onder een dissectie microscoop die niet in de cultuur kap is geïnstalleerd.
    Opmerking: Wanneer het nest groot is (> 12 embryo's), proces de helft van de embryo's en start de cultuur of leg ze in een schotel met kweekmedium en plaats deze in een CO 2 incubator bij 37 ° C. Wanneer embryo's buiten werden gelaten voor een langere periode (> 35-40 min) zagen we de hartslag te vertragen en dit zal invloed hebben op de latere ontwikkeling in de cultuur.

4. Het kweken van muizenembryo's

  1. Open de geautoclaveerde cultuur flessen in de cultuur kap en correct te labelen. Overdracht 3 ml kweekmedium verwarmd tot 37 ° C voor elk van de thij flessen en vervolgens de muis embryo's moet voorzichtig in de cultuur flessen met steriele plastic pipetten worden overgedragen. De cultuur flessen moet vervolgens worden afgedekt met rubber kurken die helpen om de cultuur flessen houden om de rollende schijf in de cultuur apparaat.
    Opmerking: De cultuur flessen met de media kan worden voorbereid en geplaatst op de rollende schijf van de cultuur apparaat voordat euthanizing de muizen. Dit verkort de tijd voor overdracht van embryo's in de cultuur flessen.
    Opmerking: muizenembryo's kunnen afzonderlijk of als hulpkweken met twee of drie embryo's in dezelfde cultuur fles worden gekweekt.
  2. De cultuur flessen moeten aseptisch worden uitgevoerd aan de kweek inrichting bij 37 ° C en ze stevig aansluiten op de openingen in de rollende schijf met de rubber kurken. Zet de rollende schijf roteren met een constante snelheid van 35 omwentelingen per minuut (rpm), die vrij opdrijven van de embr maaktJo's in de media en helpt ook in de vrije gasuitwisseling door de embryonaal weefsel. Het gas uit de cilinder verbonden met de kweekkamer stroomt door de rollende schijf en de rubber kurken in de cultuur flessen.
  3. Cultuur van de embryo's voor 16-40 uur en regelmatig te controleren op de gas uitstroom en cultuur kamertemperatuur.
    Opmerking: muis embryo manipulatie cultuur: Laat de embryo's krijgen aangepast aan de kweekomstandigheden gedurende tenminste 30 minuten. Dan embryo's die slecht presteren en tonen zwakke hartslag kan worden verwijderd en de resterende embryo's worden gebruikt voor verdere manipulatie studies. Embryo manipulaties zoals elektroporatie 5,9,16, 18 micro-injecties, kraal implantatie 16, medicamenteuze behandeling en andere procedures kunnen worden uitgevoerd op dit moment. We succes uitgevoerd implantatie van Affi-gel agarose parels behandeld met bepaalde signaalmoleculen hun rol in de vroege ontwikkeling oog bestuderen. De embryo namanipulaties kunnen worden geretourneerd in een vers medium en bleef in de cultuur.
  4. Vervang het kweekmedium volledig met verse media op bepaalde tijdstippen na 9-10 uur en 18-19 uur van de cultuur als de cultuur werd gedurende 40 uur.
    Opmerking: Cultuur media teniet kan worden vereist als de cultuur wordt gestopt door 16-18 uur.
  5. Maatstaven voor succes in cultuur: embryonale overleving in cultuur moet worden bepaald door zichtbare hartslag en bloedcirculatie in het lichaam, terwijl embryonale groei in de cultuur dient te worden beoordeeld door de toename van de lichaamsgrootte, somiet aantal en de morfologische ontwikkeling van het hoofd, de ledematen, het hart en de ogen.
  6. In de baarmoeder ontwikkeld embryo's in E11.0 DPC (~ 40-41 s) en E12.0 DPC (~ 49-50 s) moeten worden gebruikt als controle voor het vergelijken van embryo's gekweekt voor 16-18 uur en 38-40 uur, respectievelijk.
  7. Embryonale ontwikkeling op verschillende tijdstippen gedurende de cultuur en in de baarmoeder stadia worden captbestrooide onder dissectiemicroscoop. Spot imaging software werd gebruikt om de beelden vast te leggen en later verwerkt met behulp van software voor beeldverwerking.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ontwikkeling van muizenembryo's ex utero afhankelijk van meerdere factoren vanaf het moment dat de baarmoeder wordt geïsoleerd uit het lichaam en het moment van embryo's gekweekt. Zoals weergegeven in figuur 1, de procedure omvat een aantal stappen, waaronder scheiding van de zwangere baarmoeder van de behuizing (Figuur 1A), isolatie van de embryo's met intacte dooierzak (Figuur 1B), uittreding van de embryo's uit de dooierzak ( figuur 1C) en de kweken embryo's in een serumvrij medium in een atmosfeer van 95% O 2/5% CO 2 in een rollende fles kweek inrichting bij 37 ° C. Embryo's tentoongesteld 100% overleving wanneer overgebracht in voedingsbodems onmiddellijk na afscheiding van de baarmoeder. Onder deze kweekomstandigheden, muis embryo's indien gekweekt voor 16-40 uur vertoonden groei en morfologische ontwikkeling vergelijkbaar met die in gelijkwaardige stadium embryo's te ontwikkelen inbaarmoeder (figuur 2).

Embryo's in E10.5 (~ 34-35 s) (Figuur 2A) indien gekweekt voor 16-40 uur overleefd en geavanceerde in ontwikkeling veel verder dan het stadium van 35 s. De embryo's na 16-18 uur in kweek (Figuren 2D en 3B, tabel 1) toegevoegd over 5-6 Tussen vertoont een groei van een somite per twee en een half uur in kweek en waren morfologisch vergelijkbaar E11.0 (~ 40-41 s) embryo ontwikkeld in utero (Figuren 2B en 3A). Hoewel de ontwikkeling werd vertraagd door ongeveer een uur, deze embryo's in de cultuur vertoonde een totale toename in lichaamsgrootte en een evenredige hoofd met verschillende hersenen blaasjes. De embryo's toonden ook de ontwikkeling van ledematen, de vorming van een goed chambered hart en het uiterlijk van pigmentatie in de retinale pigment epitheel. Echter, dergelijke ontwikkeling werd waargenomen bij ongeveer 58% van de EMBzelfgerolde sigaretten gekweekt terwijl 28% van de embryo's vertoonden een tussenproduct ontwikkeling (figuur 3C). Deze latere embryo's vertoonden een kleinere body hoewel ze een vergelijkbare somite telling vergeleken met de in utero ontwikkelde embryo. Ze hadden een relatief kleiner hoofd, hoewel de hersenen vesicles afgebakend. De hartkamers waren niet duidelijk en de ledematen in een aantal embryo's tentoongesteld donkere gebieden aan de uiteinden. Aan het andere uiteinde van het spectrum, ongeveer 14% van de embryo's vertoonden slechte ontwikkeling in kweek (Figuur 3D). Deze embryo's had korter lichaam en hoofd maten en toonde donkere gebieden in sommige delen van het lichaam aangeeft degeneratieve veranderingen. Hoewel het hart klopte het was ziek ontwikkelde en miste differentiatie in kamers in een aantal embryo's, terwijl in andere lidstaten de ledematen donker en vertraagde de groei verscheen.

Embryo's voortgezet in cultuur voor 38-40 uur (figuur 2E; tabel 1) shverschuldigde ongeveer 49-50 s en waren vergelijkbaar met E12.0 embryo (figuur 2C) ontwikkeld in utero. Hoewel vertraagd door 2-3 uur, deze embryo in kweek vertoonden evenredige verhoging van lichaamsgrootte en toonde passende organogenese en weefsel differentiatie waargenomen in de ontwikkeling van de pigmentatie in het retinale pigmentepitheel en de vorming van een goed afgebakende snuit in het hoofdgebied. Hoewel sommige elementen van de uiteinden zoals de ledematen en staart bleek onvoldoende ontwikkeld, de embryo bleek ontwikkelen vergelijkbaar met de in utero embryo. Echter, een dergelijke ontwikkeling werd waargenomen bij slechts 30-40% van de embryo's gekweekt (tabel 1), terwijl de rest vertoonde verschillende ontwikkelings progressie met gebieden van vertraagde groei of onderontwikkeling in sommige delen van het lichaam of de hele embryo.

Naast de hierboven verschillen in ontwikkeling, zagen we een aanzienlijke differe NVU in ontwikkeling toen de embryo's werden gekweekt samen in dezelfde cultuur fles. Vergeleken met de andere embryo (Figuren 4A en 4A ") in de co-cultuur, de goed ontwikkelde embryo (Figuren 4B en 4B) vertoonden betere groei in alle aspecten van de embryonale ontwikkeling. Grote verschillen waargenomen in de totale lichaamsgrootte en grootte van het hoofd en soms ook in het hart en ledematen ontwikkeling. Terwijl de goed ontwikkelde embryo uit de co-cultuur was morfologisch vergelijkbaar met de embryo ontwikkeling in utero, heeft de andere embryo in het gemengde cultuurmedium altijd bleek minder ontwikkeld worden vergeleken met de goed ontwikkelde embryo. Dit soort verschillen in ontwikkeling werd waargenomen bij 45% van de hulpkweken (N = 27), terwijl de rest van de hulpkweken (N = 33) vertoonden bijna gelijk ontwikkeling in zowel de embryo coculture.

e 1 "fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/50803/50803fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50803/50803fig1.jpg "/>
Figuur 1. Stappen in muizenembryo cultuur protocol. (A) Gravid baarmoeder met embryo's geïsoleerd van de moeder muis. (B) Embryo's met intacte dooierzak gescheiden van decidua na segmentale dissectie van de baarmoeder. (C) Embryo's exteriorized van de dooierzak. (D) Rolling fles cultuur apparaat bij 37 ° C en 95% O 2/5% CO 2 voor het kweken van muizenembryo's geleverd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2 <Br /> Figuur 2. embryo in kweek repliceren in utero ontwikkelen. In utero ontwikkeling op E10.5 (A), E11.0 (B) en E12.0 (C). Ontwikkeling in kweek na 18 uur (D) en 40 uur (E). Schaal bar in (E) geldt voor alle panelen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. Embryonale ontwikkeling in kweek. Embryo ontwikkeld in de baarmoeder bij E11.0 DPC (A). Ontwikkeling in de cultuur (B, C, D). (B) Vertegenwoordiging van goede embryonale ontwikkeling in de cultuur. Ongeveer 58% van de totale embryo gekweekt vertonen vergelijkbaar ontwikkeling in utero ontwikkelde embryo. (C) Weergave van tussenproduct ontwikkeling in kweek. Ongeveer 28% van de embryo's gekweekt tonen tussenliggende ontwikkeling. (D) Vertegenwoordiging van slechte embryonale ontwikkeling in de cultuur. Ongeveer 14% embryo's tonen slechte ontwikkeling in de cultuur. Schaal bar in (D) is van toepassing op alle panelen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4. Ontwikkelings verschillen in muizenembryo gemengde cultuursysteem. Embryo begin co-cultuur (A B). Embryonale ontwikkeling na 16 hr coculture (A ', B'). Een van de embryo coculture (A) weergegeven ondermaatse vergelijking met de andere embryo (B) in de co-cultuur. Schaal bar in (B ') is van toepassing op alle panelen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Totaal embryo gekweekt voor 16-18 uur Ontwikkeling na kweek gedurende 16-18 uur Totaal embryo gekweekt voor 38-40 uur Ontwikkeling na kweek gedurende 38-40 uur
Goed Tussenliggend Arm Goed Arm
112 65 31 16 12 4 8

Tabel 1. Ontwikkeling van embryo's in de muis embryo kweeksysteem. Embryo's gekweekt voor zowel 16-18 uur of 38-40 uur. Van de totaal 112 embryo's gekweekt gedurende 16-18 uur, 65 (58%) vertoonde vergelijkbare embryo ontwikkeling embryo ontwikkeling in utero, 31 (28%) liet tussenproduct en 16 (14%) een ongunstige ontwikkeling. Van de totale 12 embryo's gekweekt voor 39-40 uur, slechts 4 (~ 35%) embryo's toonden een goede ontwikkeling, terwijl de resterende een ongunstige ontwikkeling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mid-dracht stadium muizenembryo's werden gekweekt in een serumvrij kweekmedium in een atmosfeer van 95% O 2/5% CO 2 in een rollende fles cultuur apparaat bij 37 ° C. Embryo ex utero was sterk afhankelijk van meerdere factoren bij elke stap in de procedure vanaf het moment dat de baarmoeder wordt geïsoleerd uit de muizen gedood om de voltooiing van de kweek (Figuur 1). De belangrijkste factor die de ontwikkeling invloed was de tijd voor de kweek te starten. De andere kritieke punten in de procedure die de meeste zorg nodig de stappen omvatten zoals de scheiding van embryo's met intacte dooierzak van de baarmoeder en de uittreding van de embryo's uit de dooierzak. Aangezien de knaagdieren schijfvormige placenta, segmentale dissectie van de baarmoeder niet de bloedtoevoer naar de embryo beschadigen, zelfs wanneer de placenta decidua licht beschadigd bij de hoeken. In feite liet dit een kleine opening aan either eindigen waardoor een paar stompe tang kunnen worden ingevoegd om voorzichtig openscheuren de baarmoeder en de placenta decidua voor een eenvoudige isolatie van de embryo's met intacte dooierzak. De volgende stap van uittreding van de embryo's uit de dooierzak is cruciaal dat beschadiging van de grote bloedvaten van de dooierzak zou mogelijk invloed op de ontwikkeling van het embryo in de cultuur. Goede embryonale ontwikkeling werd ondersteund toen embryo's werden exteriorized van de dooierzak behoud van de intactheid van het vaatstelsel in de dooierzak. Eerdere studies hebben gewezen op de opening van de dooierzak bij muizenembryo's dan embryonale stadium E10 gekweekt 1, 15, 18, ​​19. Daarom zagen we degeneratieve veranderingen en de embryo's kon de cultuur periode niet overleven als E10.5 embryo's werden gekweekt met intacte dooierzak. We aannemen dat de uittreding van de embryo's zou het effectief een te vergemakkelijkenbsorption door de weefsels terwijl de continuïteit vasculatuur met de dooierzak. Deze embryo's in cultuur tentoongesteld effectieve hartslag en bloedcirculatie in het embryonale lichaamsdelen ten opzichte van de gekweekte embryo's zonder de dooierzak.

Handhaving van de embryo's in het kweekmedium verwarmd tot 37 ° C vanaf het moment dat ze worden geïsoleerd van de baarmoeder naar de tijd van de cultuur zou onmiddellijk de best passende omgeving om hun vermogen tot latere ontwikkeling in de cultuur ondersteunen. Dit voorkomt ook vervuiling door de aanwezigheid van antibiotica in het medium en voorkomt incorporatie van zelfs een minimale hoeveelheid PBS / DMEM in de cultuur. De beschreven medium we hebben gebruikt opgeleverd superieure embryonale ontwikkeling vergeleken met andere gevestigde gedefinieerde media eerder beschreven in Wawersik et al.. 20, 21 (gegevens niet getoond). Het verschil in de embryonale ontwikkeling zou vooral te wijten zijnde unieke componenten in onze gedefinieerd medium zoals KnockOut Serum Vervangende (KSR) en N-2 supplement. Terwijl N-2 supplement bleek de groei en expressie van post-mitotische neuronen te ondersteunen, werd KSR aangetoond een directe vervanging voor foetaal runderserum 22, 23 zijn. KSR werd gebruikt in kweken de groei van ongedifferentieerde pluripotente stamcellen en mens en muis embryonale stamcellen die werden stabiele en kiemlijn bekwaam 23-25 ​​te ondersteunen. Naast het kweekmedium, de zuurstofconcentratie in de Kultuurfles speelt een cruciale rol in embryonale ontwikkeling. Embryo's kunnen overleven de voorwaarden van 5% CO2 in een conventionele couveuse. Hoewel we niet andere zuurstofconcentraties en verschillende stroomsnelheden getest zoals eerder gesuggereerd 5,9, is het gebruik van 95% O 2/5% CO 2 bij constante stroomsnelheid de overlevingskansen van de embryo opgelopen in de kweek. Terwijl rotatie vancultuurflessen noodzakelijk, embryo indien gekweekt onder dezelfde omstandigheden maar zonder rotatie van de kweek flessen geleid nonsurvival van de embryo zonder zichtbare hartslag. We nemen aan dat constante rotatie (35 rpm) in de glooiende fles cultuur apparaat ingeschakeld gratis schorsing van de embryo's op de middellange en zo goed versterkt de opname van voedingsstoffen en zuurstof door de embryonale weefsels. De groei van deze embryo's in de kweek in termen van totale lichaam en hoofd grootte, morfologie, vorming van een goed chambered hart, hersenen blaasjes en oculaire ontwikkeling was vergelijkbaar met die van embryo's in utero ontwikkelen. In onze handen, konden we de embryonale ontwikkeling die werd waargenomen door Moore-Scott et al.. 15 repliceren

De embryo's in de kweek vertoonde diverse groei en morfologische ontwikkeling afhankelijk van meerdere factoren (fig. 3; tabel 1). Onder de gedefinieerde cultuuromstandigheden we gebruikten, embryo's gekweekt gedurende 16-18 uur gaf vergelijkbare ontwikkeling die waargenomen bij embryo ontwikkelt in utero in ongeveer 58% van de embryo's, terwijl 28% liet tussenproduct en 14% vertoonde een slechte ontwikkeling. Uitbreiding van cultuur 38-40 uur daalde verder de mogelijkheid vergelijkbare ontwikkeling gebleken slechts 30-40% van de gekweekte embryo's. Naast de inherente factoren die mogelijk van invloed de embryonale ontwikkeling ex utero kunnen veel externe factoren die kunnen worden beheerd op zekere hoogte kritieke rol bij de embryo's worden gedurende langere tijd. Een dergelijke mogelijke factor die gecontroleerd kan de tijd tussen de isolatie van embryo van de baarmoeder naar het begin van de kweek. Het kan worden geïnterpreteerd dat de eerste geïsoleerde embryo over minder zuurstof in de kweekschaal opzichte van embryo geïsoleerd aan het einde, zoals de embryo gaan in de cultuur fles en ontvang 95% O 2/5% CO 2tegelijkertijd. Echter, de beschikbare zuurstof in het bloed die nog in de placenta na segmentale dissectie mogelijk geen ondersteuning voor langere tijd en om deze reden het grootste deel van de cultuur en apparatuur moet worden ingesteld klaar om gebruikt te worden voor euthanasie de muis. We krijgen meestal de embryo's in de cultuur in 25-30 min. vanaf het moment dat de muis werd gedood. Deze korte periode om de cultuur te beginnen zou niet mogelijk zijn als embryo een waren om te worden verwerkt in een tijd zoals voorgesteld in Zeeb, M. et al.. 18 Wanneer embryo's individueel worden verwerkt, groepering van embryo's niet mogelijk is en elk embryo moet worden geteld voor somiet nummer. Deze procedure zou minimaal 5-6 min voor elk embryo te isoleren nemen, exterioriseren van dooierzak, tel somieten en over te dragen aan de cultuur fles. Voor een worpgrootte van 10-12 embryo's, die we meestal krijgen van onze CD-1 muizen, zou het hele proces 60-72 min voor de laatste paar embryo's te nemen om in de cultuur. Dit is vrij lang en zagen we de hartslag te vertragen en bijna stoppen als embryo's werden naar buiten gebracht en achtergelaten in PBS en vertraagde tot cultuur. Een andere mogelijke factor kan de behandeling of verkeerd gebruik van de embryo's tijdens de procedure. Tijdens de behandeling, kunt u per ongeluk schade aan een deel van het lichaam of de bloedvaten in het embryo of de dooierzak die niet gemakkelijk wordt gedetecteerd induceren. Dit kan de ontwikkeling van dat deel van het lichaam of soms het hele embryo werd waargenomen dat zelfs een goed ontwikkelde embryo toont soms een soort onderontwikkeling aan de uiteinden zoals de ledematen en staart aangeeft onvoldoende bloedtoevoer. Het is beter om deze embryo's die lijken te worden aangetast of beschadigd tijdens de procedure ontdoen. Het andere probleem gewoonlijk optreden tijdens de procedure was een van de embryo's met intacte dooierzak prop niet abrupt van decidua na segmentale dissectie van de baarmoeder. Dat leidt soms tot moopnieuw bloedverlies bij de scheiding punt uit de placenta, hoewel het vaatstelsel met de dooierzak blijft intact. Dit bloedverlies opstelling kan de latere ontwikkeling van het embryo door minder hoeveelheid bloed vastgehouden in het embryonale lichaam tijdens scheiding.

Naast de bovengenoemde factoren bepaalde aandoeningen zoals, het stadium van embryo ten tijde van het starten van de kweek invloed op de ontwikkeling van de cultuur. Wij hebben met succes gekweekte mid-dracht muis embryo's beginnen met etappes die varieerden tussen 28-37 en voor 16-40 uur en waargenomen enkele verschillen in ontwikkeling. Embryo's in 34-36 s stadium vertoonden een betere ontwikkeling in de cultuur ten opzichte van de embryo's in 30-33 s stadium wijzen op een toename van het aanpassingsvermogen aan kweekomstandigheden in embryo's gekweekt in een later stadium. De andere verrassende feit dat tijdens kweek werd waargenomen was de ontwikkeling van embryo wanneer twee of meer embryo's werden gekweekt samen (figuur 4). Coculture resulted een significante verbetering van de ontwikkeling van een van de embryo's ten opzichte van de andere embryo in 45% van de hulpkweken. Hoewel het embryo van dezelfde baarmoeder lijken morfologisch en somite tellen, inherent geen twee embryo's op hetzelfde ontwikkelingsstadium en dit kan een van de redenen voor ontwikkeling verschil in een van de embryo's ten opzichte van de andere in de co-cultuur worden systeem.

Zo laten we zien dat halverwege de zwangerschap stadium muizenembryo's gekweekt ex utero in een serum-vrij medium in een atmosfeer van 95% O 2/5% CO 2 in een rollende fles cultuur apparaat bij 37 ° C vertonen groei en morfologische ontwikkeling vergelijkbaar met die waargenomen bij embryo ontwikkeling in utero. Wij geloven dat deze manier van muizenembryo cultuur systeem zal nuttig zijn voor laboratoria om hele embryo's gebruiken om signalering interacties belangrijk in de vroege embryonale organogenese bestuderen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

We hebben geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

We willen graag Dr Julie Gordon en Dr Nancy Manley bedanken voor hun nuttige adviezen met de cultuur techniek. Dit werk werd ondersteund door de Children's Glaucoom Stichting en Sharon-Stewart Aniridia Research Trust.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KnockOut DMEM Invitrogen 10829-018
KnockOut Serum Replacement Invitrogen 10828-028
N-2 Supplement Invitrogen 17502-048 Stock: 100x
Albumin, from Bovine Serum Sigma A9418-50G Stock: 100%
Antibiotic - Antimycotic Solution Cellgro 30-004-Cl Stock: Penicillin (10,000 IU/ml); Streptomycin (10,000 µg/ml; Amphotericin (250 µg/ml) 
DMEM   Cellgro 15-013-CV
Precision Incubator Unit B.T.C. Engineering Milton Cambridge England Id.No. 840-374
Glass Bottles for Rotating Unit B.T.C. Engineering
Silicone Rubber Cork B.T.C. Engineering
95% O2/5% CO2 Cylinder AirGas Inc.
Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope Zeiss
Stemi SV6 Microscope Zeiss
CO2 Water Jacketed Incubator Forma Scientific Model: 3110
Culture Hood Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2 Model: Nu-425-600
Water Bath Fisher Scientific IsoTemp205
Weigh Balance Mettler Toledo AG285
Centrifuge Tube, 50 ml Corning 430291
Light Operating Scissors Roboz RS-6702
Operating Sharp-Blunt Scissors  Roboz RS-6812
Microdissecting Forceps, 4 in Roboz RS-5211
Microdissecting Forceps - Hudson (cWALD), 4-3/4 in Roboz RS-5237
Microdissecting Tweezers (5/45) Roboz RS-5005 Modified - Sharp ends were made blunt
Microdissecting Tweezers (5) Roboz RS-5060 Modified - Sharp ends were made blunt
Microdissecting Tweezers (55) Roboz RS-5063 Modified - Sharp ends were made blunt
Instrument Tray Roboz RT-1401S
Instrument Tray Lid Roboz RT-1401L
Petri Dish-100 mm Fisher Scientific 087571Z
Petri Dish-60 mm Fisher Scientific 0875713A
Petri Dish-35 mm Fisher Scientific 0875711YZ
Filter System ( 0.22 µm Cellulose Acetate)-150 ml Corning 431153
Filter System (0.22 µm Cellulose Acetate)-250 ml Corning 430756
Filter System (0.22 µm Cellulose Acetate)-500 ml Corning 430758
Pipet-aid Pipettor Drummond Scientific Co. D57849
Serological Pipette-10 ml VWR 89130-898
Disposable Serological Pipette-25 ml Corning 4251
Transfer Pipette - 7.7 ml Thermo Scientific 202-20S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Behesti, H., Holt, J. K., Sowden, J. C. The level of BMP4 signaling is critical for the regulation of distinct T-box gene expression domains and growth along the dorso-ventral axis of the optic cup. BMC Dev. Biol. 6, 62 (2006).
  2. Gray, J., Ross, M. E. Neural tube closure in mouse whole embryo culture. J. Vis. Exp. , (2011).
  3. Tam, P. P. Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation. Int. J. Dev. Biol. 42, 895-902 (1998).
  4. Miura, S., Mishina, Y. Whole-embryo culture of E5.5 mouse embryos: development to the gastrulation stage. Genesis. 37, 38-43 (2003).
  5. Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
  6. Yokoo, T., et al. Human mesenchymal stem cells in rodent whole-embryo culture are reprogrammed to contribute to kidney tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3296-3300 (2005).
  7. Sadler, T. W. Culture of early somite mouse embryos during organogenesis. J. Embryol. Exp. Morphol. 49, 17-25 (1979).
  8. Kitchin, K. T., Ebron, M. T. Further development of rodent whole embryo culture: solvent toxicity and water insoluble compound delivery system. Toxicology. 30, 45-57 (1984).
  9. Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev. Growth Different. 50, 485-497 (2008).
  10. Cuthbertson, R. A., Beck, F. Postimplantation whole embryo culture: a new method for studying ocular development. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 31, 1653-1656 (1990).
  11. New, D. A. Development of explanted rat embryos in circulating medium. J. Embryol. Exp. Morphol. 17, 513-525 (1967).
  12. Chung, K. C., Park, J. H., Kim, C. H., Ahn, Y. S. Tumor necrosis factor-alpha and phorbol 12-myristate 13-acetate differentially modulate cytotoxic effect of nitric oxide generated by serum deprivation in neuronal PC12 cells. J. Neurochem. 72, 1482-1488 (1999).
  13. Sasaoka, T., et al. Evidence for a functional role of Shc proteins in mitogenic signaling induced by insulin, insulin-like growth factor-1, and epidermal growth factor. J. Biol. Chem. 269, 13689-13694 (1994).
  14. Chotani, M. A., Mitra, S., Eid, A. H., Han, S. A., Flavahan, N. A. Distinct cAMP signaling pathways differentially regulate alpha2C-adrenoceptor expression: role in serum induction in human arteriolar smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, 69-76 (2005).
  15. Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos. Genesis. 35, 164-168 (2003).
  16. Gordon, J., Moore, B. A., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Serum-Free Culture of Mid-gestation Mouse Embryos: A Tool for the Study of Endoderm-Derived Organs. Methods Mol. Biol. 1092, 183-194 (2014).
  17. New, D. A., Cockroft, D. L. A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase. Experientia. 35, 138-140 (1979).
  18. Cockroft, D. L. Development in culture of rat foetuses explanted at 12.5 and 13.5 days of gestation. J. Embryol. Exp. Morphol. 29, 473-483 (1973).
  19. Zeeb, M., et al. Pharmacological manipulation of blood and lymphatic vascularization in ex vivo-cultured mouse embryos. Nat. Protoc. 7, 1970-1982 (2012).
  20. Wawersik, S., et al. BMP7 acts in murine lens placode development. Dev. Biol. 207, 176-188 (1999).
  21. Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens. Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).
  22. Greenfield, J. P., et al. Estrogen lowers Alzheimer beta-amyloid generation by stimulating trans-Golgi network vesicle biogenesis. J. Biol. Chem. 277, 12128-12136 (2002).
  23. Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39, 100-104 (2004).
  24. Kim, J. B., et al. Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4. Nature. 461, 649-643 (2009).
  25. Totonchi, M., et al. Feeder- and serum-free establishment and expansion of human induced pluripotent stem cells. Int. J. Dev. Biol. 54, 877-886 (2010).

Tags

Developmental Biology muizenembryo mid-dracht serum-vrij gedefinieerde media roller cultuur organogenese ontwikkeling
Muis embryonale ontwikkeling in een Serumvrij Hele Embryo Cultuur System
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D.More

Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System. J. Vis. Exp. (85), e50803, doi:10.3791/50803 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter