Summary
배아 배양에 활용 혈청 특히 신호의 상호 작용을 포함하는 연구 실험의 결과에 영향을 미칠 수있는 알 수없는 구성 요소가 포함되어 있습니다. 여기서 우리는 혈청 산소 배양 시스템을 활용하고 16-40 시간 동안 배양 한 중간 회임 마우스 배아가 자궁에서 개발 태아에 비해 형태 개발을 전시 것을 보여줍니다.
Abstract
중간 회임 스테이지 마우스 배아 산소화 롤링 병 배양 시스템에서 시판 줄기 세포 미디어 보조제로부터 제조 무 혈청 배지를 이용하여 배양 하였다. E10.5에서 마우스 배아는 신중 그대로 난황과 자궁에서 분리하고, 난황과 태아의 혈관 연속성을 유지하면서 정확한 수술 기동을 포함하는 과정에서 배아는 부드럽게 난황에서 exteriorized했다. 그대로 난황 또는 제거 난황을 준비 배아에 비해,이 배아는 우수한 생존율과 유사한 조건에서 배양 개발 진행을 보였다. 우리는이 마우스 배아 때 16-40 시간 동안 37 ° C에서 95 % O 롤링 병 배양 장치의 2 / 5 % CO 2의 분위기에 정의 된 배지에서 배양, 비교 형태의 성장과 발전을 전시 것을 보여 배아는 자궁에 개발. 우리는 토륨 생각방법은 배아의 기관 형성에 중요한 신호의 상호 작용을 연구하기 위해 전체 배아 문화를 활용할 필요가 조사에 유용 할 것입니다.
Introduction
체외에서 전체 배아를 이용한 배양 방법은 자궁에 접근하기 어려운 배아의 기관 형성에 관여 메커니즘을 신호 공부하기에 적합합니다. 전체 배아 조직의 무결성을 제공하고 필수적인 메커니즘을 신호의 적시 발생에 매우 중요한 조직의 상호 작용에 대한 적절한 지원 기관 형성 기간 동안 다른 세포 과정에 대한. 전체 배아 문화는 등 이식 연구, 유전자 및 조직 조작 구슬 주입 연구, 독성 연구, 같은 응용 프로그램의 과다를위한 플랫폼을 제공하는 반면., 현재 사용 배아 배양 시스템은 태아의 적절한 성장과 유지 보수를위한 혈청에 주로 의존 문화 1-9.
혈청 배양 배지 6 ~ 8, 10, 11의 10-100%에 이르기까지의 주요 구성 요소의 하나로서 활용되고 있습니다.하지만, 혈청의 조성물은 잘 정의되지 않은 동물 및 동물에 따라 다를 수 있고, 각 시간은 혈청을 수집한다. 혈청 실험 준비 시간을 소모하고 엄격한 절차를 포함하는 동안, 조달 혈청 상업적으로 다른 많은 사이에 상당한 변화를 전시 및 실험 비용을 발생시킵니다. 이러한 추가, 혈청은 잠재적으로 특정 실험의 결과에 영향을 미칠 수있는 성장 인자, 호르몬, 또는 다른 단백질, 조직의 상호 작용에 중요한 신호 분자의 연구를 포함하는 특히 알 수없는 요소를 포함 할 수있다. 연구는 문화 혈청의 첨가가 잠재적으로 순환 아데노신 monophosphate (캠프) 및 세포 분열 신호 및 phosphoinositide 3에 관련된 단백질 (PI 3) - 키나제 경로 12-14 신호와 같은 특정 신호 전달 분자의 세포 내 수준을 변경할 수있는 것으로 나타났습니다. 이들과는 반대로, 무 혈청 배양 시스템은 항원이없는 환경의 이점을 제공한다세포 프로세스를 변경할 수 생물학적 활성 효소 절제 실험 사이의 일관성을 가능하게합니다.
본 연구에서는 37에서 95 % O 롤링 병 배양 장치의 2 / 5 % CO 2의 분위기에서 문화 중반 태동 단계 전체 배아에 상업적으로 이용 가능한 줄기 세포 미디어 보충제 제조 된 무 혈청 배지를 이용 C 15, 16 °. 이러한 정의 된 조건에서 16-40 시간 동안 배양 한 쥐의 배아 세포의 증식, 이동, 분화 및 조직 상호 작용의 적절한 수준을 나타내는 등의 심장, 사지, 뇌, 눈 등 전체 배아 몸과 다른 구조의 형태 개발 진행을 보였다. 같은 눈과 같은 복잡한 장기 시스템 중 하나에 대한 문화의 배아 발달의 분자 분석은 EMBR에 안구 조직의 관찰과 일치하는 눈 개발을 발표YOS는 (준비, Kalaskar과 로더데일) 자궁에서 개발. 따라서 우리는 중앙 임신 단계에서 배양 한 쥐의 배아가 자궁에서 개발 태아에서 관찰 된 것과 유사한 진보적 인 성장과 형태 개발을 전시 것을 보여줍니다.
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Protocol
마우스 배아 문화 :
모든 실험 절차를 검토하고 지속적으로 규제 감독을 유지 조지아 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 승인 된 프로토콜 번호의 A2010 07-119, 다음의 건강 지침의 국립 연구소와 엄격한에 따라 실시되었다.
1. 문화 미디어의 준비
- 녹아웃 DMEM 녹아웃 혈청 교체 (KSR) (10 %), N-2 보충 (1X), 알부민, 소 혈청에서 (2 %), 페니실린 (다음 금액에 시판 줄기 세포 미디어와 보충 교재를 사용하여 배지를 준비 50 IU / ㎖), 스트렙토 마이신 (50 ㎍ / ㎖) 및 암포 테리 신-B (1.25 ㎍ / ㎖). 제조 된 배양 배지는 이전에 다음과 같은 변경으로 15 기술과 유사하다 : 안티 mycotics의 추가 및 특정 시약 및 장비의 세부 사항에 대한 항생제의 두 배 농도 (리에게 참조를 사용하여재료의 성).
참고 : 이전에 사용 (. 무어 - 스콧 등 15) 등의 항생제 농도는 배아 문화가 24 시간 기간까지 실시에 충분했다. 문화가 24 시간 이상 지속 된 경우에는, 우리는 문화의 오염을 경험하고이 성공적으로 항생제 농도를 두 배로에 의해 제어되었다. - 4 ° C에서 나 제조업체의 권장 사항에 따라 -20 ° C에서 미디어 구성 요소를 저장합니다. KSR 및 N-2 보충을 반복 동결 융해를 방지하기 위해 -20 ° C에서 분주에 보관해야합니다. 한 번 개봉 녹아웃 DMEM 제조 업체의 권고에 따라 30 일 이내에 사용하여야한다. 사용하기 전에, 37 ° C의 물을 욕조에있는 구성 요소를 따뜻하게
- 멸균 조건에서 미디어를 준비합니다. 모든 장비와 문화 후드에 배치하기 전에 70 % 알코올 스프레이와 미디어 구성 요소를 포함하는 병의 표면을 소독.
- 미디어 구성 요소는 무균 비이커에 직접 필터 시스템 (코닝)에서 하나를 혼합 할 수있다. 먼저 녹아웃 DMEM에 알부민 분말을 추가합니다. 알부민이 완전히 용해 될 때까지 부드럽게 흔들어 잘 섞는다. 그런 다음 N-2 보충, KSR 및 항생제를 추가하고 피펫을 사용하여 잘 혼합. 그 후 진공 흡인으로 0.22 ㎛의 공극 크기의 필터를 사용하여 미디어를 살균 고를. 사용할 때까지 4 ° C에서 50 ML 원뿔 튜브 및 저장소에 미디어를 분배. 일단 제조 된 미디어 문화 4 ~ 5 일 이내에 사용해야합니다.
2. 문화 장비의 제조
- 유리 배양 병 및 고무 마개를 소독. 알루미늄 호일의 문화 병을 감싸고 물을 비이커에 고무 병 코르크를 배치하고 고압 증기 멸균에 의해 소독.
- 문화를 시작하기 전에 70 % 알코올 스프레이 따뜻한 37 ° C에와 문화 실 (정밀 보육 단위)를 소독. 문화 챔버는 전자입니다문화 병을 보유하고있는 중앙에 회전 디스크를 보이지 않네요. 챔버로 가스 흐름은 압력계에 의해 규제되고 유량 끝에 유리관에서 물을 통해 공기 방울의 유출을 관찰함으로써 조정될 수있다. 이 롤링 병 배양 장치는 새로운 Cockroft (17)에 의해 도입 된 원래 장치의 수정 된 버전입니다.
- 배양 챔버에 95 %, O2 / 5 % CO 2의 혼합 가스를 함유하는 가스 실린더를 연결하고 50 CC / 분의 유량을 제공하고 충분한 산소 공급을 보장 "초당 하나의 기포"에 가스 흐름을 조절 문화 배아.
3. 마우스 배아 수집 및 문화를위한 준비
- 야생형 마우스 배아를 얻으려면, 우리는 C57BL/6J 및 CD-1 (찰스 리버 연구소) 유전 적 배경 계통의 마우스를 이용했다.
- 매일 아침 질 플러그의 암컷 생쥐를 확인합니다. 일을 찾는 일에 정오전자 질 플러그 E0.5 DPC (일 성교를 게시)로 간주되어야한다.
- 표준 프로토콜 다음 임신 쥐를 안락사에 의해 E10.5 DPC에 마우스 배아를 수집합니다. 마우스는 미국의 의학 협회 (AVMA) 동물의 안락사 (2013)에 대한 지침에 지정된대로 CO 2 흡입 장치를 이용하여 안락사했다. 죽음을 보장하기 위해, 자궁 경부 전위는 CO 2에 노출 된 후 실시 하였다.
- 악기에 복부 머리의 고착을 방지하기 위해 복부 복부 표면에 70 % 에탄올 스프레이. 그런 다음 날카로운 무딘 운영 가위와 자궁의 위치를 집게를 microdissecting에서 4-3/4의 쌍을 사용하여 배쪽으로 복강을 엽니 다. microdissecting 집게에 4를 사용하면 전체 자궁을 들어 올려 자궁 몸에와 자궁 뿔의 끝에서 빛을 운영 가위로 절단하여 몸에서 분리.
- 빨리 씻어 1X PBS에서 전체 자궁은 37 ° C로 가열자궁에있는 혈액의 고집을 제거하고 즉시 DMEM에 배치하는 페트리 접시에 37 ° C로 가열. 더 사용하기 전에 70 %의 에탄올 스프레이기구를 소독.
참고 : PBS, DMEM과 문화 매체를 포함하고, 전체 과정 동안 37 ° C에서 그들을 유지하는 솔루션을 예열하는 것은 좋습니다. - 해부 현미경, 자궁 준하는 빛 운영 가위로 해부한다. 이것은 (무딘 단부) 변경됨 microdissecting 용 핀셋 부드럽게 개구를 넓히기 위해 삽입 될 수있는 분할 된 자궁의 양쪽에 작은 개구 초래한다. 이것은 조심스럽게 레이 처트의 막을 정수리 난황 (PYS)를 노출 microdissecting 핀셋 한 쌍의 찢어에 의해 제거 될 수있다 태반 탈락의 노출을 허용합니다. 핀셋의 한쪽 가장자리를 사용하여 부드럽게 PYS와 함께 레이 처트의 막을 뚫고 일부터 분리전자 난황 (VYS를) 기본은 그대로 VYS으로 배아를 노출 층. ectoplacental 콘과 trophoectoderm 유도체는 태반의 탈락 또는 레이 처트의 막으로도 제거 할 수 있습니다. 치료는 태아가 즉시 팝업으로 VYS의 파열을 방지하기 위해주의해야합니다.
- 그대로 VYS와 배아는 배양 배지는 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 37 ° C로 가열이 들어있는 페트리 접시에 전송해야합니다.
참고 : 바로 자궁에서 분리 한 후 배양 배지에 전송 문화 배아의 더 나은 발전을 위해 도움이됩니다. - 작은 구멍은 주요 혈관을 피하는 microdissecting 핀셋 한 쌍의 난황에서해야한다. 핀셋 샤프한 쌍 부드럽게 머리 영역에 인접 영역에 관통하여 개구부를 만들기 위해 사용될 수있다. 또는 무딘 핀셋 두 쌍의 난황을 잡고 조심스럽게 작은 구멍을 만들기 위해 눈물을 사용할 수 있습니다.그런 다음 부드럽게 배아의 머리에 맞게 충분한 크기로 족집게로 확장하여 개방을 확대. 밀접하게 배아를 포장하는 양막 부드럽게 떨어져 몸에서 개최 핀셋을 사용하여 찢어해야합니다. 15 주머니 노른자의와 배아 혈관의 무결성을 유지하면서 배아 머리 이후 전체 배아 부드럽게 난황에서 exteriorized해야한다.
참고 : 난황 혈관에 어떤 손상이 잠재적으로 문화 태아의 발달에 영향을 미칠 수있다. 손상된 혈관과 같은 배아는 배양을 위해 사용해서는 안되며 나중에 폐기 할 수있는 배아를 준비 사용할 수 있습니다. - 배아 준비 기준 : 몸과 머리의 크기, 사지 각 그룹에서 두 개 이상의 배아를위한 체절의 수 (들)을 계산하여 눈의 형태와 단계 등의 형태 학적 기준에 따라 해부 현미경 및 그룹에서 배아를 검사합니다.
<강한> 참고 : 보통 자궁 내 발달에있는 같은 쓰레기의 차이에서 얻은 몸의 크기, 형태 학적 특징과 somites의 수에 차이가 배아. 그러나, 우리는 우리의 형태 학적 기준에 따라 분류 된 배아는 보통 비슷한 체절 번호 (± 1) 전시 것으로 나타났습니다. 이러한 이유로, 본 배양을 시작하는 시간을 지연하는 것처럼 각각의 배아위한 somites를 카운트 할 필요가 없다.
참고 : 문화 somites를 계산하는 데 사용 된 배아를 사용하지 마십시오. 배양 개시까지의 시간 지연을 방지하기 위해 다른 배아위한 배양을 시작한 후 somites 횟수. 자궁에서 분리 한 후 배양 연기 된 배아는 보통 가난한 개발을 나타낸다. - 매체는 37 ° C로 가열 신선한 문화를 페트리 접시에 즉시 배아를 전송하고 배아를 다시 멸균의 cultur와 페트리 접시에 전송해야하는 문화 후드로 가져전자 매체는 매체와 문화 병에 넣어 전에 문화를 시작합니다.
참고 : 배아에 대한 다수의 미디어 전송을 문화 배아 수집 및 해부의 여러 단계가 문화 후드에 설치되지 않은 해부 현미경을 수행 하였다으로 오염을 방지하는 데 도움이되기 전에.
참고 : 쓰레기의 크기 (> 12 배아), 공정의 절반 배아 크고 문화를 시작하거나 배지와 함께 접시에 넣어 37 ℃에서 CO 2 배양기에 배치하는 경우 배아는 더 긴 기간 (> 35 ~ 40 분) 밖에 서 왼쪽 때 우리는 천천히 그리고이 문화에 나중에 개발에 영향을 미칠 것입니다 심장 박동을 관찰했다.
4. 마우스 배아를 배양
- 문화 후드에서 멸균 배양 병을 열고 적절하게 레이블을 붙입니다. 문화 매체의 이동 3 ㎖를 t에 각각 37 ° C로 가열그 병 후 마우스 배아 멸균 플라스틱 이전 피펫을 사용하여 배양 병으로 부드럽게 이송한다. 문화 병은 배양 장치의 회전 디스크에 문화 병을 유지하는 데 도움이 고무 병 코르크 덮인해야합니다.
참고 : 미디어와 문화 병 쥐를 안락사 전에 준비 및 배양 장치의 회전 디스크에 배치 할 수 있습니다. 이것은 배양 병에 배아의 전송 시간을 단축시킨다.
참고 : 마우스 배아는 개별적으로 또는 같은 문화 병 두 개 또는 세 개의 배아와 공 배양으로 배양 될 수있다. - 문화 병은 무균 적으로 37 ° C에서 배양 장치에 실시 단단히 고무 코르크 회전 디스크의 구멍에 후크해야합니다. EMBR의 무료 부상을 수 분 (RPM) 당 35 회전의 일정한 속도로 회전하는 회전 디스크를 켭니다또한 언론과의 YOS은 배아 조직으로 무료 가스 교환에 도움이됩니다. 문화 실에 연결된 실린더에서 가스는 문화 병에 회전 디스크와 고무 마개를 통해 흐른다.
- 정기적으로 문화 16-40 시간 동안 배아 및 가스 유출 및 문화 챔버 온도를 확인합니다.
참고 : 마우스 배아의 조작을 문화 : 배아가 적어도 30 분 동안 배양 조건에 적응하자. 그런 저조한 수행 미약 하트 비트를 나타내는 배아는 폐기 될 수 있고, 나머지는 상기 배아 조작 연구에 이용 될 수있다. 이러한 일렉트로의 5,9,16, microinjections 18, 구슬 주입 16, 약물 치료 및 기타 절차 등의 배아 조작은이 시간에 수행 할 수 있습니다. 우리는 성공적으로 초기 눈 개발에 자신의 역할을 연구하는 특정 신호 전달 분자로 취급 아피 - 겔 아가로 오스 비즈의 주입을 수행 하였다. 배아 후조작은 새로운 매체에 다시 반환과 문화에 계속 될 수있다. - 9 ~ 10 시간과 문화의 18 ~ 19 시간 배양 40 시간 동안 계속 된 후 특정 간격으로 완전히 새로운 미디어와 문화 매체를 교체합니다.
참고 : 문화가 16 ~ 18 시간에 의해 정지되는 경우 문화 미디어 교체가 필요하지 않을 수 있습니다. - 문화의 성공의 측정 : 문화의 배아 성장이 신체 크기의 증가, 체절 번호와 머리, 사지, 심장, 눈의 형태 개발에 의해 평가되어야한다 동안 문화 배아의 생존이 몸에 볼 심장 박동과 혈액 순환에 의해 결정되어야한다.
- E11.0 DPC (~ 40-41들)과 E12.0 DPC (~ 49 ~ 50 초)에서 자궁 개발 배아에서 각각 16 ~ 18 시간과 38 ~ 40 시간, 배양 한 배아를 비교하기위한 대조군으로 사용되어야한다.
- 문화 동안과 자궁의 단계에 대해 서로 다른 시점에서 배아 발달은 존을 할 수 있습니다해부 현미경 하에서이라는 군. 스팟 이미징 소프트웨어는 이미지를 캡처하기 위해 이용 이상 화상 처리 소프트웨어를 사용하여 처리 하였다.
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Representative Results
마우스 배아의 개발은 전 자궁 자궁이 배아는 배양 시간에 몸에서 분리 될 때부터 여러 요인에 따라 달라집니다. 그림 1에 도시 된 바와 같이, 절차는 몸에서 임신하는 자궁의 분리 (그림 1A), 그대로 난황 (그림 1B)와 배아의 분리를 포함하여 일련의 단계를 포함, 난황에서 배아의 exteriorization ( 그림 1C), 37 ° C에서 95 % O 롤링 병 배양 장치의 2 / 5 % CO 2의 분위기에 혈청이없는 배지에서 배아를 배양 바로 자궁에서 분리 한 후 배양 배지로 전송하면 태아는 100 % 생존을 전시. 이러한 배양 조건, 마우스 배아에서 경우에 해당하는 개발 단계의 배아에서 관찰에 16-40 시간 전시의 성장과 형태 학적 개발을위한 배양 비교자궁 (그림 2).
E10.5 (~ 34 ~ 35 초) (그림 2A) 16-40 시간 동안 배양 살아 잘 35 (S)의 단계를 넘어 개발에 고급 때의 배아. 문화에 16-18 시간 (그림 2D 및 3B, 표 1) 이후의 배아는 약 5-6 ~ 문화에 매 2 시간 반에 대해 하나의 체절의 성장률을 전시하고 E11.0 (에 형태 학적으로 비교했다들 추가 자궁 (그림 2B 및 3A)에서 개발 40-41의) 배아. 개발이에 대한 시간 지연되었지만, 문화의 이러한 배아는 별개의 뇌 소포와 몸 크기의 전반적인 증가와 비례 머리를 나타냈다. 배아는 또한 망막 색소 상피 세포에서 잘 챔버 마음과 색소 침착의 외관의 형성을 사지 꽃 봉오리를 개발했다. 그러나, 이러한 유형의 개발은 emb를 약 58 %에서 관찰되었다배아의 28 %가 중간 개발 (그림 3C)를 전시하면서 ryos 배양. 그들은에서 자궁 개발 배아에 비해 비슷한 체절 수 있었다하지만이 이후 배아는 작은 본체 크기를 보여 주었다. 뇌 소포가 경계가되었다하더라도 그들은 상대적으로 작은 머리를 가지고 있었다. 심장 챔버 구별되지 않은 일부 태아의 사지 싹이 사지에서 어두운 영역을 나타내었다. 스펙트럼의 다른 끝에, 배아의 약 14 %는 배양 (도 3d)에 불량 현상을 나타내었다. 이 배아는 짧은 몸과 머리 크기를 가지고와 퇴행성 변화를 나타내는 신체의 어떤 부분에서 어두운 부분을 보여 주었다. 심장 박동이되었지만 그것은 병이 개발 한 다른 사람의 팔다리가 어둡고 성장 지체 등장하면서 약간의 배아에있는 챔버로 차별화 부족했다.
SH, 태아는 38 ~ 40 시간 (표 1 그림 2E)에 대한 문화에 계속약 49 ~ 50의 빚과 E12.0 배아를 자궁 내에서 개발 (그림 2C)에 비교했다. 2 ~ 3 시간 지연 있지만, 문화의 이러한 배아는 몸의 크기에 비례 증가를 전시하고 머리 지역에서 잘 경계가 주둥이의 망막 색소 상피 형성에 색소의 개발에 관찰 적절한 기관 형성과 조직의 분화를 보여 주었다. 사지 새싹과 꼬리 등 사지의 일부가 아래에 개발 한 것으로 나타났다 있지만, 배아의 자궁 내 태아에 비해 개발하는 것으로 나타났다. 그들의 나머지는 성장 지연의 지역 또는 아래 개발 신체의 일부 또는 개발 진행의 범위를 전시하면서 그러나, 개발의 종류는 (표 1) 배양 한 배아 만 30-40%에서 관찰되었다 전체 배아.
따로 따로 개발 위의 차이에서, 우리는 중요한의 다른 작풍을 관찰 배아가 동일한 문화 병에 동시 배양 된 개발 후부. 다른 배아 (도 4a 및도 4A ')에 비해 공 배양에, 잘 발달 된 배아 (그림 (b)와 (b)는') 배아 발달의 모든 측면에서 더 나은 성장을 보였다. 주요 차이점은 전체 몸의 크기와 머리 크기에, 때로는 심장과 사지의 개발에서 관찰되었다. 공 배양에서 잘 발달 된 배아가 자궁에서 개발 태아에 대한 형태 학적으로 비교 동안, 공 배양의 다른 배아는 항상 잘 발달 된 배아에 비해 덜 개발 된 것으로 나타났다. 공 배양 (N = 33)의 나머지는 공동 배양 모두 배아 거의 유사한 개발을 보인 반면 개발의 차이에 이러한 종류, (N = 27) 공 배양의 45 %에서 관찰되었다.
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어머니 마우스에서 분리 된 배아 그림 1. 마우스 배아 배양 프로토콜의 단계. (A) 임신하는 자궁. 자궁의 분절 절제술 후 탈락 분리 그대로 난황와 (B)의 태아. (C) 태아는 난황에서 exteriorized. (D) 롤링 병 문화 37 ° C에서 장치 및 95 % O 2 / 5 더 마우스 배아를 배양 %의 CO 2와 함께 제공. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
<문화 BR /> 그림 2. 태아는 자궁의 개발에 복제합니다. E10.5 (A), E11.0 (B)와 E12.0 (C)에서 자궁 개발. 18 시간 (D)과 40 시간 (E) 후 문화의 개발. (E)의 스케일 바는 모든 패널에 적용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
문화 그림 3. 배아 발달. 배아는 E11.0 DPC 문화 (A). 개발 (B, C, D)에서 자궁 내에서 개발. (B문화의 좋은 배아 발달의) 표현. 전체 배아의 약 58 %가 자궁 개발 배아에 전시 대등 한 발전을 배양. 문화의 중간 개발 (C) 대표. 배아의 약 28 %는 쇼 중간 개발을 배양. 문화의 가난한 배아 발달의 (D) 대표. 약 14 %의 배아는 문화의 가난한 개발을 보여줍니다. (D)의 스케일 바는 모든 패널에 적용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 공 배양 (A의 시작에서 마우스 배아 공동 배양 시스템. 태아의 발달 차이 B). 배아 발달 공 배양의 16 시간 (A ', B') 후. 공 배양 (A ')의 배아 중 하나는 공 배양에 (다른 배아 B)에 비해 아래에 크기가 나타납니다'. (B ')의 스케일 바는 모든 패널에 적용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 16 ~ 18 시간 동안 배양 전체 배아 | 16 ~ 18 시간 동안 배양 한 후 개발 | 38 ~ 40 시간 동안 배양 전체 배아 | 38 ~ 40 시간 동안 배양 한 후 개발 | |||
| 좋은 | 중간의 | 가난한 | 좋은 | 가난한 | ||
| 112 | 65 | 31 | 16 | 12 | 4 | 8 |
마우스 배아 배양 시스템에서 배아의 표 1. 개발. 16 ~ 18 시간 또는 38 ~ 40 시간 중 하나를 배양 한 배아. 16 ~ 18 시간, 65 (58 %), 태아가 자궁에서 개발 태아에 비교 개발을 전시 배양 총 112 배아의, 31 (28 %)의 중간 보여 16 (14 %)은별로 발전을 보여 주었다. 39 ~ 40 시간 동안 배양 총 12 배아의, 단지 4 (~ 35 %) 배아는 동안 나머지 보였다별로 개발 좋은 발전을 보여 주었다.
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Discussion
중간 임신 단계 마우스 배아는 37 ° C에서 95 % O 2 / 5 더 롤링 병 배양 장치에서 %의 CO 2의 분위기에 혈청이없는 배지에서 배양 하였다 배아 개발 EX의 자궁은 자궁이 문화의 완성 (그림 1)에 안락사 생쥐에서 분리되는 순간부터 절차를 수행하는 동안 각 단계에서 여러 요인에 결정적으로 의존했다. 발전을 좌우하는 가장 중요한 요소는 배양을 시작하는 데 걸리는 시간이었다. 대부분의 치료를 필요로하는 절차를 수행하는 동안 다른 중요한 점은 그대로 노른자 자궁에서 골목과 난황에서 배아의 exteriorization와 배아의 분리 등의 단계를 포함한다. 설치류 원반 태반이 때, 자궁 분절 해부 태반 탈락이 약간 모서리 파손 되더라도 배아에 혈액 공급을 손상하지 않았다. 사실이 에이에 작은 구멍을 왼쪽으로무딘 포셉 한 쌍의 부드럽게 열고 자궁 그대로 난황을 가진 배아 쉽게 격리를 가능하게하는 태반의 탈락을 찢어 삽입 될 수있는 거기가 끝납니다. 그러나, 난황에서 배아의 exteriorization의 다음 단계는 난황의 주요 혈관의 손상이 잠재적으로 문화 배아의 발달을 초래할 것이 중요합니다. 태아는 난황의 혈관의 intactness을 유지 난황에서 exteriorized 때 적절한 배아 발달이 지원되었다. 배아 단계 E10 이상 마우스 배아는 1, 15, 18, 19 배양 할 때 이전 연구는 난황의 개통을 표시했다. 따라서, 우리는 퇴행성 변화를 관찰 E10.5 배아는 그대로 난황과 함께 배양하면 배아는 배양 기간 살아남을 수 없습니다. 우리는 배아의 exteriorization 효과적인 영양을 용이하게 가정난황과 혈관의 연속성을 유지하면서 조직을 통해 bsorption. 문화의 이러한 배아는 난황없이 배양 된 배아에 비해 배아 신체 부위에 효과적인 심장 박동 및 혈액 순환을 나타냈다.
배지에서 배아를 유지하는 것이 바로 그들이 문화의 시간에 자궁에서 분리 된 시간에서 37 ° C로 가열 즉시 문화 나중에 개발을위한 능력을 유지하는 가장 적합한 환경을 제공 할 것이다. 또한이 때문에 중간에있는 항생제의 존재에 오염을 방지하고 문화에 PBS / DMEM의 미세한 양의 혼입을 방지 할 수 있습니다. 우리가 활용 한 정의 매체는 이전에 Wawersik 등. (20)에 설명 된 다른 설립 정의 미디어, 21 (데이터가 표시되지 않음)에 비해 우수한 배아 발달을 얻었다. 배아 발달의 차이는 주로이 될 수같은 녹아웃 혈청 교체 (KSR)과 N-2 보충, 우리의 정의 매체의 고유 한 구성 요소. N-2 보충이 후 유사 분열 신경 세포의 성장과 표현을 지원하기 위해 표시되는 동안, KSR은 소 태아 혈청 (22, 23)에 대한 직접 교체 할 것으로 나타났다. KSR는 미분화 다 능성 줄기 세포의 성장뿐만 아니라 23-25 유능한 안정하고 생식 세포계 것으로 나타났다 인간과 마우스의 배아 줄기 세포 배양을 지원하기 위해 사용되었다. 제외한 배지에서 배양 병의 산소 농도는 배아 발달에 중요한 역할을한다. 배아는 종래의 배양기에서 5 % CO 2 조건에서 살아남을 수 없었다. 우리가 이전에 5,9을 제안 다른 산소 농도와 다른 유량을 테스트하지 않았습니다 만, 95 % O 일정한 유량의 2 개의 / 5 % CO 2의 사용은 문화에서 배아의 생존을 지속하고있다. 회전하는 동안문화 병은 태아가 동일한 조건 하에서 만의 문화 병없이 회전을 배양 할 때 눈에 보이는 하트 비트 배아의 nonsurvival 결과는 필요합니다. 우리는 롤링 병 배양 장치에서 일정한 회전 (35 회전)이 무료 매체에서 배아의 중단뿐만 아니라 강화 된 배아 조직을 통해 영양분과 산소의 흡수를 사용할 수 있다고 가정합니다. 전체 몸과 머리의 크기, 형태, 잘 챔버 마음의 형성, 뇌 소포 및 안구 개발의 측면에서 문화에서 이러한 배아의 성장은 자궁에서 개발 태아의 비교했다. 우리 손에, 우리는 무어 - 스콧 등. (15)에 의해 관찰 된 배아 발달을 복제 할 수 있었다
문화의 배아는 여러 요인 (; 표 1 그림 3)에 따라 성장과 형태 학적 개발의 범위를 나타내었다. 정의 문화에서28 %가 중간 보였고, 14 %가 가난한 개발을 보였다 동안 우리가 사용하는 조건은, 16 ~ 18 시간 동안 배양 한 배아, 배아의 약 58 %가 자궁에서 개발 태아에서 관찰 된 것과 유사한 발전을 보여 주었다. 38 ~ 40 시간에 문화의 확장 배양 총 배아 만 30-40%에 비교 발전을 보여줄 수있는 능력을 감소. 배아는 시간의 연장 길이를 배양 할 때 외에도 잠재적으로 배아 발달의 예를 자궁에 영향을 미치는 고유의 요인에서, 어느 정도 관리 할 수있는 많은 외부 요인이 중요한 역할을 할 수 있습니다. 제어 할 수있는 하나의 잠재적 인 요인은 문화의 시작 자궁에서 태아의 분리에서 소요되는 시간입니다. 그것은 제 절연 배아 모두 배아 배양 병으로 가서 95 %, O2 / 5 % CO 2를 받자 끝에 절연 배아에 비해 배양 접시에서 적은 산소에 노출되는 것을 해석 할 수있다동시에. 그러나 분절 해부 후 태반에 남아있는 혈액에 제공되는 산소를 장시간지지 않을 수 있고 이런 이유로 배양 설비 및 장치의 대부분은 마우스를 안락사 이전에 사용될 준비가 설정되어야한다. 우리는 일반적으로 마우스를 안락사 된 시점에서 25 ~ 30 분에 문화에 배아를 얻을. 배아 스엡에서 제안 한번에 하나씩 처리되어야한다면 배양을 시작하는이 단시간 불가능 해, M. 등. 18 배아가 개별적으로 처리 될 때, 태아의 그룹화는 불가능하며, 각 배아되어야 체절의 수를 세었다. 이 절차는 외면 화하다 난황에서, 각각의 배아를 격리하는 적어도 5 ~ 6 분을 somites를 계산하고, 문화 병에 전송하는 것이다. 우리가 일반적으로 우리의 CD-1 마우스에서 얻을 10-12 배아의 쓰레기의 크기, 전체 프로세스는 C에 들어가 지난 몇 배아에 대한 60-72 분 걸릴 것입니다ulture. 이 꽤 긴 기간이고 우리는 배아 exteriorized 왼쪽 PBS와 문화를 지연 때 천천히 거의 중지 심장 박동을 관찰했다. 또 다른 잠재적 인 요인이 절차를 수행하는 동안 배아의 처리 또는 취급 부주의가 될 수 있습니다. 처리하는 동안, 당신은 쉽게 감지되지 배아 또는 난황 주머니의 몸이나 혈관의 일부에 대한 우발적 인 손상을 일으킬 수 있습니다. 이도 잘 발달 된 배아는 때때로 불충분 한 혈액 공급을 나타내는 사지 새싹과 꼬리처럼 사지에서 아래 개발의 종류를 표시하는 것이 관찰로이 몸 때로는 전체 배아의 부분의 발달에 영향을 미칠 수있다. 이 절차를 수행하는 동안 손상되거나 손상된 것으로 나타 이러한 배아를 폐기하는 것이 좋습니다. 일반적으로 절차를 수행하는 동안 발생하는 다른 문제는 그대로 난황을 가진 배아 중 일부는 자궁의 분절 해부에 탈락에서 갑자기 밖으로 소품이었다. 이것은 때때로 미주리 결과난황과 혈관이 그대로 남아 있지만 태반에서 분리 시점에서 혈액 손실을 다시. 이 혈액 손실은 분리 동안 배아, 체내 혈액의 적은 양에 태아의 이상 발달에 영향을 미칠 수있다.
외에도 위의 요인의 문화를 시작하는 시점에서 태아의 단계와 같은 특정 조건은 문화의 발전에 영향을. 우리는 성공적으로 배양 된 중간 회임 마우스 배아는 16-40 시간 동안 28-37의 사이에 원거리 및 개발에 약간의 차이를 관찰 단계로 시작. 34-36의 단계에서 배아는 나중 단계에서 배양 된 배아의 배양 조건에 적응성의 증가를 나타내는 30-33 해제 단계에서 배아에 비해 배양에서 잘 발달을 보였다. 배양 중에 관찰되는 다른 놀라운 사실은 두 개 이상의 배아 동시 배양 된 배아의 발달 (도 4)이었다. 공 배양 resulte공 배양의 45 %의 다른 배아에 비해 배아의 하나로 개발에 상당한 개선 D. 동일한 자궁에서 배아 형태 학적 및 체절 카운트에서 비슷하지만, 본질적으로 관련이 배아 발달의 동일한 단계에서있을 수 있으며, 이는 공동 배양에서 다른 비교 배아 하나 발달 차이에 대한 이유 중 하나가 될 수 시스템.
따라서 우리는 보여 그 37 ° C 전시의 성장과 형태 개발 비교에에서 95 %, O2 / 5 % 롤링 병 배양 장치에서 CO 2의 분위기 속에서 무 혈청 배지에서 중반 태동 단계 마우스 배아 배양 EX의 자궁 그 자궁에서 개발 태아에서 관찰. 우리는 마우스 배아 배양 시스템의이 방법은 초기 배아 기관 형성에 중요한 신호의 상호 작용을 연구하기 위해 전체 배아를 활용할 필요가 실험실에 유용 할 것으로 판단된다.
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Disclosures
우리는 어떤 경쟁하는 금융 이익이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 문화 기술과의 도움이 조언을 쥴리 고든 박사 낸시 맨리에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 어린이 녹내장 재단과 샤론 - 스튜어트 무 홍채 증 연구들에 의해지지를 받고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KnockOut DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| N-2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock: 100x |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma | A9418-50G | Stock: 100% |
| Antibiotic - Antimycotic Solution | Cellgro | 30-004-Cl | Stock: Penicillin (10,000 IU/ml); Streptomycin (10,000 µg/ml; Amphotericin (250 µg/ml) |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| Precision Incubator Unit | B.T.C. Engineering Milton Cambridge England | Id.No. 840-374 | |
| Glass Bottles for Rotating Unit | B.T.C. Engineering | ||
| Silicone Rubber Cork | B.T.C. Engineering | ||
| 95% O2/5% CO2 Cylinder | AirGas Inc. | ||
| Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Stemi SV6 Microscope | Zeiss | ||
| CO2 Water Jacketed Incubator | Forma Scientific | Model: 3110 | |
| Culture Hood | Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2 | Model: Nu-425-600 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | IsoTemp205 | |
| Weigh Balance | Mettler Toledo | AG285 | |
| Centrifuge Tube, 50 ml | Corning | 430291 | |
| Light Operating Scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Operating Sharp-Blunt Scissors | Roboz | RS-6812 | |
| Microdissecting Forceps, 4 in | Roboz | RS-5211 | |
| Microdissecting Forceps - Hudson (cWALD), 4-3/4 in | Roboz | RS-5237 | |
| Microdissecting Tweezers (5/45) | Roboz | RS-5005 | Modified - Sharp ends were made blunt |
| Microdissecting Tweezers (5) | Roboz | RS-5060 | Modified - Sharp ends were made blunt |
| Microdissecting Tweezers (55) | Roboz | RS-5063 | Modified - Sharp ends were made blunt |
| Instrument Tray | Roboz | RT-1401S | |
| Instrument Tray Lid | Roboz | RT-1401L | |
| Petri Dish-100 mm | Fisher Scientific | 087571Z | |
| Petri Dish-60 mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Petri Dish-35 mm | Fisher Scientific | 0875711YZ | |
| Filter System ( 0.22 µm Cellulose Acetate)-150 ml | Corning | 431153 | |
| Filter System (0.22 µm Cellulose Acetate)-250 ml | Corning | 430756 | |
| Filter System (0.22 µm Cellulose Acetate)-500 ml | Corning | 430758 | |
| Pipet-aid Pipettor | Drummond Scientific Co. | D57849 | |
| Serological Pipette-10 ml | VWR | 89130-898 | |
| Disposable Serological Pipette-25 ml | Corning | 4251 | |
| Transfer Pipette - 7.7 ml | Thermo Scientific | 202-20S |
References
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