Summary
Soro utilizado em culturas de embriões contém componentes desconhecidos que podem afetar o resultado de experimentos especialmente em estudos que envolvem interações de sinalização. Aqui, utilizamos um sistema de cultura oxigenado sem soro e mostram que os embriões no meio da gestação rato cultivadas durante 16-40 horas apresentam desenvolvimento morfológico comparável aos embriões em desenvolvimento in utero.
Abstract
Embriões fase mid-gestação de rato foram cultivadas utilizando um meio de cultura isento de soro preparado a partir de células-tronco suplementos media comercialmente disponíveis em um sistema de cultura em frasco de rolamento oxigenado. Mouse embriões em E10.5 foram cuidadosamente isolada do saco vitelino com útero intacto e num processo que envolve a manobra cirúrgica precisa os embriões foram gentilmente exteriorizado partir do saco vitelino, enquanto mantém a continuidade vascular do embrião com o saco vitelino. Em comparação com os embriões preparados com saco vitelino intacta ou com o saco vitelino removidos, estes embriões apresentaram a taxa de sobrevivência superior e progressão do desenvolvimento, quando cultivadas sob condições semelhantes. Mostramos que estes embriões de ratinho, quando cultivadas num meio definido em uma atmosfera de 95% O2 / 5% de CO 2, num aparelho de cultura de garrafa de rolamento a 37 ° C durante 16-40 horas, exibem crescimento e desenvolvimento morfológico comparável à os embriões em desenvolvimento no útero. Acreditamos ªé o método será útil para pesquisadores que necessitam de utilizar a cultura do embrião inteiro para estudar interações de sinalização importantes na organogênese embrionária.
Introduction
In vitro, utilizando métodos de cultura de embriões inteiros são adequados para estudar mecanismos de sinalização envolvidos na organogênese embrionária que são de outra maneira difícil acesso no útero. Embriões inteiros fornecer a integridade dos tecidos e apoio adequado para as interações de tecido que são cruciais para a ocorrência oportuna de mecanismos de sinalização essenciais para diferentes processos celulares, durante a organogénese. Enquanto as culturas de embriões inteiros fornecer uma plataforma para uma infinidade de aplicações, tais como estudos de transplante, manipulações genéticas e de tecidos, estudos de implantação do grânulo, estudos toxicológicos, etc., Sistemas de cultura de embriões atualmente utilizados são principalmente dependentes de soro para o crescimento e manutenção dos embriões na cultura 1-9.
O soro foi utilizado como um dos principais componentes que variam entre 10-100% do meio de cultura de 6-8, 10, 11.; No entanto, a composição do soro não está bem definida e pode variar de animal para animal e cada vez que o soro é recolhido. Enquanto preparação laboratorial de soro é demorado e envolve procedimentos rigorosos, o soro obtido exibe comercialmente considerável variabilidade entre lotes diferentes e aumenta os custos experimentais. A estes, o soro pode conter factores desconhecidos, como factores de crescimento, hormonas, ou outras proteínas, o que pode, potencialmente, afectar o resultado de certas experiências, especialmente aqueles que envolvem o estudo de moléculas de sinalização importantes em interacções de tecidos. Estudos têm mostrado que a adição de soro para a cultura pode potencialmente alterar os níveis intracelulares de determinadas moléculas de sinalização, tais como o monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) e de proteínas envolvidas na sinalização mitogénica e fosfoinositida 3 (PI3), as vias de sinalização da cinase 12-14. Contrariamente a isso, um sistema de cultura isento de soro, proporciona as vantagens de ambiente antigénio livre,abstinência de enzimas biologicamente ativas que podem alterar os processos celulares e permite a consistência entre experimentos.
No presente estudo, utilizámos um meio de cultura isento de soro preparado a partir de células-tronco suplementos media comercialmente disponíveis para a cultura da fase mid-gestação de embriões inteiros de uma atmosfera de 95% O2 / 5% de CO 2, num aparelho de cultura de garrafa de rolamento a 37 ° C 15,16. Mouse embriões cultivados em 16 a 40 horas sob estas condições definidas apresentaram progressão para o desenvolvimento morfológico de corpo e diferentes estruturas embrionárias gerais, tais como o coração, membros, cérebro e olhos, indicando níveis adequados de proliferação celular, a migração, a diferenciação e as interacções de tecidos. A análise molecular do desenvolvimento embrionário em cultura por um dos sistemas de órgãos complexos como o olho revelou o desenvolvimento ocular para ser coerente com o observado no tecido ocular em embryos desenvolvendo no útero (Kalaskar e Lauderdale, em preparação). Assim, mostramos que os embriões de rato cultivadas em fase mid-gestação, apresentam um crescimento progressivo e desenvolvimento morfológico comparável à observada nos embriões em desenvolvimento in utero.
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Protocol
Rato cultura de embriões:
Todos os procedimentos experimentais foram realizados em estrita conformidade com Instituto Nacional de diretrizes de saúde seguindo o protocolo # A2010 07-119, que foi analisado e aprovado pela Universidade de Georgia Institutional Animal Care e do Comitê Use, que mantém a supervisão regulamentar continuou.
1. Preparação de Meios de Cultura
- Preparar meio de cultura utilizando a mídia e os suplementos de células-tronco disponíveis comercialmente nos seguintes valores: Knockout DMEM, KnockOut Serum Replacement (KSR) (10%), N-2 Suplemento (1x), albumina, a partir de soro bovino (2%), penicilina ( 50 UI / ml), estreptomicina (50 ug / ml) e anfotericina-B (1,25 ug / ml). O meio de cultura preparado é semelhante ao anteriormente descrito 15, com as seguintes alterações: a adição de anti-mycotics e utilizando o dobro da concentração de antibióticos (para detalhes de reagentes e equipamentos específicos, ver Liº de Materiais).
Nota: a concentração de antibióticos como utilizado anteriormente (. Moore-Scott, 15 e outros) foi suficiente para culturas de embriões realizadas até 24 horas período de tempo. No entanto, quando a cultura foi prorrogado para além de 24 horas, tivemos a contaminação da cultura e esta foi controlada com sucesso através da duplicação da concentração de antibiótico. - Armazenar os componentes de media, a 4 ° C ou a -20 ° C, conforme as recomendações do fabricante. KSR e N-2 suplemento deve ser armazenado em alíquotas a -20 ° C para evitar o congelamento e descongelamento repetidos. KnockOut DMEM uma vez aberto deve ser utilizado no prazo de 30 dias, por recomendação do fabricante. Antes de usar, aquecer os componentes em um banho de água a 37 ° C.
- Prepare a mídia em condições estéreis. Desinfetar a superfície de todos os equipamentos e frascos contendo os componentes de mídia com 70% spray de álcool antes de colocá-los na capa de cultura.
- Os componentes do meio podem ser misturados ou num copo esterilizado, ou directamente no sistema de filtro (Corning). Primeiro adicione o pó de albumina para o KnockOut DMEM. Misturar bem, agitando suavemente até a albumina se dissolva completamente. Em seguida, adicione o N-2 Suplemento, KSR e os antibióticos e misture bem com uma pipeta. Em seguida, filtrar esterilizar os meios de comunicação utilizando um filtro de 0,22 mM tamanho dos poros com sucção a vácuo. Dispensar a mídia em tubos de 50 ml e armazenar cônicas a 4 ° C até ser usado. Os meios de comunicação, uma vez preparados devem ser utilizados dentro de 4-5 dias para a cultura.
2. Preparação do Equipamento Cultura
- Esterilizar os frascos de cultura de vidro e rolhas de borracha. Enrole as garrafas de cultura em uma folha de alumínio e colocar as rolhas de borracha em um copo de água e esterilizar em autoclave.
- Esterilizar a câmara de cultura (Unidade de precisão Incubadora) com 70% de álcool de pulverização e aquecer a 37 ° C antes de iniciar a cultura. A câmara de cultura é ebrincou com um disco de rolamento no centro que detém as garrafas de cultura. O fluxo de gás para dentro da câmara é regulada por um medidor de pressão e a taxa de fluxo pode ser ajustada por meio da observação do fluxo de saída de bolhas de ar através de água em um tubo de vidro no final. Este aparelho cultura garrafa rolando é uma versão modificada do aparelho original introduzidas pelo Novo e Cockcroft 17.
- Conectar um cilindro de gás contendo uma mistura gasosa de 95% O2 / 5% de CO 2 para a câmara de cultura e ajustar o fluxo de gás para "uma bolha de ar por segundo", que dá uma taxa de fluxo de 50 cc / min, e assegura o fornecimento adequado de oxigénio para os embriões cultura.
3. Rato Embryo Coleta e Preparação para a Cultura
- Para obter o tipo de embriões de rato selvagens, utilizamos camundongos C57BL/6J e de CD-1 (Charles River Laboratories) cepas de fundo genético.
- Confira os ratos fêmea para plugs vaginais todas as manhãs dia. O meio-dia do dia de encontrar ªe tampão vaginal, deve ser considerado como E0.5 dpc (dias pós-coito).
- Coletar embriões de camundongos em E10.5 dpc por eutanásia das ratas grávidas seguindo protocolos padrão. Os camundongos foram sacrificados utilizando um dispositivo de inalação de CO 2, conforme especificado pela American Veterinary Medical Association (AVMA) Diretrizes para a eutanásia de animais (2013). Para segurar a morte, luxação cervical foi realizado após a exposição ao CO 2.
- Spray de etanol a 70% sobre a superfície abdominal ventral para evitar a aderência de cabelo abdominal para os instrumentos. Em seguida, abrir a cavidade abdominal ventral utilizando uma tesoura afiada romba de funcionamento e um par de 4-3/4 em microdissecting fórceps para localizar o útero. Utilizando um fórceps 4 em microdissecting levantar todo o útero e separá-lo do corpo por corte com uma tesoura de luz de funcionamento no corpo uterino e nas pontas dos cornos uterinos.
- Enxaguar rapidamente todo o útero em 1x PBS aquecido a 37 ° Cpara remover qualquer colagem de sangue para o útero e colocar imediatamente em DMEM aquecido a 37 ° C em uma placa de Petri. Esterilizar os instrumentos em 70% spray de etanol antes de nova utilização.
Nota: O pré-aquecimento das soluções, incluindo o PBS, DMEM e o meio de cultura e a sua manutenção a 37 ° C durante todo o procedimento é recomendado. - Sob um microscópio de dissecação, o útero deve ser segmentally dissecado com uma luz tesoura operacionais. Isto resulta em pequenas aberturas em cada lado do útero segmentada, através do qual um par de modificados (extremidades embotadas) pinças microdissecting pode ser inserido suavemente para alargar a abertura. Isto permite que a exposição do decidua placentário, que pode então ser removido por arrancamento suavemente com um par de pinças microdissecting para expor o saco vitelino parietal (PYS) com a membrana de Reichert. Utilizando uma ponta de perfurar as pinças suavemente membrana de Reichert, juntamente com os PYS e separar the subjacente saco vitelino visceral (VYS) camada de expor os embriões com VYS intactas. O cone ectoplacental e os derivados trofoectoderma pode ser removido quer com a decídua placentária ou com a membrana de Reichert. Cuidados devem ser tomados para evitar a ruptura do VYS como os embriões sair imediatamente.
- Os embriões com VYS intactas deve então ser transferido para uma placa de Petri contendo o meio de cultura aquecido a 37 ° C utilizando uma pipeta de transferência de plástico.
Nota: Transferência para o meio de cultura imediatamente após a separação do útero ajuda para um melhor desenvolvimento do embrião em cultura. - Uma pequena abertura deve ser feito no saco vitelino com um par de pinças microdissecting evitando grandes vasos sanguíneos. Um par de pinças acentuada pode ser usada para fazer a abertura por perfuração suavemente numa área adjacente à região de cabeça. Alternativamente, dois pares de pinças sem corte pode ser utilizado para segurar o saco vitelino e suavemente rasgar para fazer uma pequena abertura.Então alargar suavemente a abertura expandindo com a pinça a um tamanho suficiente para caber a cabeça embrionária. A membrana amniótica, que é envolver estreitamente o embrião deve ser realizada suavemente para fora do corpo e rasgado usando um par de pinças. A cabeça embrionária e depois todo o embrião deve ser suavemente exteriorizado partir do saco vitelino, mantendo a integridade da vasculatura embrionária com o do saco vitelino 15.
Nota: Qualquer dano à vasculatura saco vitelino podem potencialmente afetar o desenvolvimento do embrião em cultura. Tais embriões com vasculatura danificada não devem ser utilizados para a cultura e pode ser utilizado para encenar os embriões que podem mais tarde ser descartados. - Critérios de estadiamento Embrionárias: Examinar os embriões sob o microscópio de dissecação e de grupo por critérios morfológicos, incluindo corpo e tamanho da cabeça, membros e morfologia do olho e estágio através da contagem do número de somite (s) por pelo menos dois embriões de cada grupo.
<strong> Nota: Normalmente embriões obtidos a partir da mesma ninhada apresentam diferenças de desenvolvimento no útero e diferem no tamanho do corpo, características morfológicas e número de somitos. No entanto, descobrimos que os embriões agrupados por nossos critérios morfológicos geralmente exibiram número somite semelhante (± 1). Por esta razão, não é necessário contar somitos de cada embrião como esta iria atrasar o tempo para o início da cultura.
Nota: Não usar os embriões que foram usados para contar os somitos para a cultura. Contagem de somitos após o início da cultura de outros embriões de modo a evitar o atraso de tempo no início da cultura. Os embriões que foram retardados de cultura depois da separação do útero geralmente exibem fraca desenvolvimento. - Transferir os embriões imediatamente para uma placa de Petri com meio de cultura fresco aquecido a 37 ° C e levá-la para a capa de cultura, onde os embriões devem ser novamente transferido para uma placa de Petri com cultur estérile mídia antes de colocá-los em frascos de cultura com meio para iniciar a cultura.
Nota: As múltiplas transferências de mídia para os embriões antes de cultura ajuda na prevenção de contaminação como as diferentes etapas de colheita de embriões e dissecção foram realizados sob um microscópio de dissecação que não foi instalado na capa de cultura.
Nota: Quando o tamanho da ninhada é grande (> 12 embriões), processo de metade dos embriões e iniciar a cultura ou colocá-los em um prato com meio de cultura e colocá-lo em uma incubadora de CO 2 a 37 ° C. Quando os embriões foram deixados de fora por períodos mais longos (> 35-40 min) observou-se o coração desacelerar e isso vai afetar o posterior desenvolvimento da cultura.
4. Cultivar embriões de camundongos
- Abra as garrafas de cultura autoclavado na capa de cultura e etiquetá-las corretamente. Transferência de 3 ml de meio de cultura aquecido a 37 ° C para cada um dos the garrafas e, em seguida, os embriões de rato deve ser transferido suavemente nos frascos de cultura, utilizando pipetas de transferência de plástico esterilizadas. As garrafas de cultura deve, então, ser cobertas com as rolhas de garrafas de borracha, que ajudam a segurar as garrafas de cultura para o disco do rolamento no aparelho de cultura.
Nota: Os frascos de cultura com os meios de comunicação podem ser preparado e colocado sobre o disco de laminagem do aparelho de cultura antes da eutanásia dos ratos. Isto encurta o tempo para a transferência de embriões para os frascos de cultura.
Nota: os embriões do rato podem ser cultivadas individualmente ou como co-culturas com dois ou três embriões no mesmo frasco de cultura. - As garrafas de cultura deve ser assepticamente transportados para o aparelho de cultura a 37 ° C e força-las para ligar os furos na disco do rolamento com as rolhas de borracha. Ligue o disco de rolamento para girar a uma velocidade constante de 35 rotações por minuto (rpm), que permite a flutuação livre do embryos na mídia e também ajuda na troca de gás livre pelo tecido embrionário. O gás do cilindro ligada à câmara de cultura flui através do disco do rolamento e as rolhas de borracha nas garrafas de cultura.
- Cultura dos embriões para 16-40 horas e verificar regularmente para o escoamento de gás e temperatura da câmara de cultura.
Nota: manipulação de embrião de rato em cultura: Deixe os embriões se adaptar às condições de cultura, pelo menos, 30 min. Em seguida, os embriões que mostram um desempenho fraco e batimento cardíaco fraco pode ser descartada e os embriões restantes podem ser utilizadas para estudos de manipulação. Manipulações de embrião, tais como 5,9,16 electroporação, micro-injecções 18, o implante de talão 16, de tratamento de droga e outros procedimentos pode ser realizada nesta altura. Foi realizada com sucesso a implantação de agarose Affi-gel tratada com determinadas moléculas de sinalização para estudar o seu papel no desenvolvimento do olho adiantada. Os embriões depoismanipulações podem ser devolvidos num meio fresco e continuaram em cultura. - Substitua os meios de cultura totalmente com meios frescos em intervalos específicos após 9-10 horas e 18-19 horas de cultura quando a cultura foi mantida por 40 horas.
Nota: A substituição meios de cultura não pode ser necessária se a cultura é parado por 16-18 horas. - Medidas de sucesso na cultura: a sobrevivência embrionária em cultura devem ser determinados pelo batimento cardíaco visível e circulação do sangue no corpo, enquanto o crescimento embrionário na cultura deve ser avaliada pelo aumento do tamanho do corpo, número somite e desenvolvimento morfológico de cabeça, membros, coração e os olhos.
- No útero desenvolvido em embriões E11.0 dpc (~ 40-41 s) e E12.0 dpc (~ 49-50 s) devem ser utilizados como controlos para comparação de embriões cultivados em 16-18 horas e 38-40 horas, respectivamente.
- O desenvolvimento embrionário em diferentes pontos de tempo durante a cultura e para em fases utero pode ser captrado sob microscópio de dissecação. Software de imagem local foi utilizado para capturar as imagens e posteriormente processadas utilizando o software de processamento de imagem.
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Representative Results
Desenvolvimento de embriões de ratinho ex utero depende de múltiplos factores, a partir do momento em que o útero é isolado a partir do corpo para o momento em que os embriões são cultivados. Como representado na Figura 1, o processo envolve uma série de passos, incluindo, a separação do útero grávido do corpo (Figura 1A), isolamento de embriões com saco vitelino intacta (Figura 1B), exteriorização dos embriões a partir do saco vitelino ( Figura 1C) e cultivando os embriões num meio isento de soro, numa atmosfera de 95% O2 / 5% de CO 2, num aparelho de cultura de garrafa de rolamento a 37 ° C. Os embriões apresentaram 100% de sobrevivência, quando transferido para o meio de cultura imediatamente após a separação a partir do útero. Sob estas condições de cultura, os embriões de ratinho, quando cultivadas durante 16-40 hr exibiram um crescimento e desenvolvimento morfológico comparável à observada nos embriões em desenvolvimento na fase de equivalentesutero (Figura 2).
Embriões em E10.5 (~ 34-35 s) (Figura 2A), quando cultivadas por 16-40 h sobreviveu e avançado no desenvolvimento bem além do estágio de 35 s. Os embriões após 16-18 horas em cultura (Figuras 2D e 3B; Tabela 1) adicionado cerca de 5-6 s exibindo uma taxa de crescimento de um somito para cada duas horas e meia na cultura e eram morfologicamente comparável ao E11.0 (~ 40-41 s) embriões desenvolvidos no útero (figuras 2B e 3A). Embora o desenvolvimento foi adiada por cerca de uma hora, esses embriões em cultura exibiu um aumento geral no tamanho do corpo e uma cabeça proporcional com vesículas cerebrais distintas. Os embriões também mostrou desenvolver brotos dos membros, a formação de um coração bem compartimentado e aparecimento de pigmentação no epitélio pigmentado da retina. No entanto, este tipo de desenvolvimento foi observada em cerca de 58% do embtabaco de enrolar cultivadas enquanto que 28% dos embriões apresentaram um desenvolvimento intermediário (Figura 3C). Estes embriões posteriores mostraram um menor tamanho do que eles tinham uma contagem de somito semelhante em comparação com os embriões em desenvolvimento in utero. Eles tinham uma cabeça relativamente menor, embora as vesículas cerebrais foram demarcadas. As câmaras do coração não eram distintos e os brotos dos membros em alguns embriões exibiram áreas escuras nas extremidades. Na outra extremidade do espectro, cerca de 14% dos embriões apresentaram pobre desenvolvimento em cultura (Figura 3D). Estes embriões tinham tamanhos de corpo e da cabeça e mais curtos mostrou áreas escuras em algumas partes do corpo, indicando alterações degenerativas. Embora o coração estava batendo era mal desenvolvida e faltava diferenciação em câmaras em alguns embriões, enquanto em outros membros apareceram escuro e retardado em crescimento.
Embriões continuaram em cultura durante 38-40 horas (Figura 2E, Tabela 1) shdevido cerca de 49-50 s e foram comparáveis aos embriões E12.0 (Figura 2C), desenvolvido no útero. Embora retardada por 2-3 horas, estes embriões em cultura apresentaram um aumento proporcional no tamanho do corpo e mostrou diferenciação organogénese e tecido adequado como observado no desenvolvimento da pigmentação no epitélio pigmentado da retina e a formação de uma tromba bem demarcada, na região da cabeça. Embora algumas partes nas extremidades, como os brotos dos membros ea cauda parecia ser subdesenvolvido, os embriões parecia estar desenvolvendo comparável aos embriões no útero. No entanto, esse tipo de desenvolvimento foi observada em apenas 30-40% dos embriões em cultura (Tabela 1), enquanto o resto deles exibiu uma gama de progressão do desenvolvimento com as áreas de crescimento retardado ou sub-desenvolvimento em algumas partes do corpo ou a embrião inteiro.
Além das diferenças acima em desenvolvimento, observou-se uma significativa difere nce em desenvolvimento quando os embriões foram co-cultivadas no mesmo frasco de cultura. Em comparação com o outro embrião (Figuras 4A e 4A ') na co-cultura, o embrião bem desenvolvida (Figuras 4B e 4B') exibiu um melhor crescimento em todos os aspectos do desenvolvimento embrionário. As principais diferenças foram observadas no tamanho total do corpo e tamanho da cabeça e, às vezes, no coração e no desenvolvimento dos membros. Enquanto o embrião bem desenvolvido a partir da co-cultura foi morfologicamente semelhante aos embriões em desenvolvimento in utero, o outro embrião na co-cultura sempre pareceu ser menos desenvolvida em comparação com o embrião bem desenvolvida. Esta espécie de diferença de desenvolvimento foi observada em 45% de co-culturas (N = 27), enquanto o resto das co-culturas (N = 33) apresentaram crescimento quase semelhante em ambos os embriões na co-cultura.
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Figura 1. Passos no rato protocolo de cultura de embriões. (A) útero gravídico com embriões isolados do rato mãe. (B) Os embriões com saco vitelino intacta separada da decídua após dissecção segmentar do útero. (C) Embriões exteriorizado a partir do saco vitelino. (D) garrafa de rolamento aparelho cultura a 37 ° C e é fornecido com 95% O 2/5% de CO 2 para a cultura de embriões de camundongos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
<Br /> Figura 2. embriões em cultura replicar em desenvolvimento in utero. No desenvolvimento in utero em E10.5 (A), E11.0 (B) e E12.0 (C). Desenvolvimento em cultura após 18 horas (D) e 40 h (E). Barra de escala em (E) aplica-se a todos os painéis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Desenvolvimento Figura 3. Embrionário em cultura. Embrião desenvolvido no útero em E11.0 dpc (A). Desenvolvimento em cultura (B, C, D). (B) Representação do bom desenvolvimento embrionário em cultura. Cerca de 58% dos embriões totais cultivadas exibem desenvolvimento comparável no útero embriões desenvolvidos. (C) Representação de desenvolvimento intermédio, em cultura. Cerca de 28% dos embriões cultivados show de desenvolvimento intermédio. (D) Representação do desenvolvimento embrionário pobre em cultura. Cerca de 14% de embriões mostrar fraco desenvolvimento da cultura. Barra de escala em (D) aplica-se a todos os painéis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Diferenças de desenvolvimento no mouse do sistema de co-cultura de embriões. Embriões no início da co-cultura (A B). O desenvolvimento embrionário após 16 horas de co-cultura (A ', B'). Um dos embriões na co-cultura (A ') aparece sob porte em comparação com o outro embrião (B') na co-cultura. Barra de escala em (B ') aplica-se a todos os painéis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Total de embriões cultivados em 16-18 horas | Desenvolvimento tempo de cultivo de 16-18 horas | Total de embriões cultivados em 38-40 horas | Desenvolvimento tempo de cultivo de 38-40 horas | |||
| Bom | Intermediário | Pobre | Bom | Pobre | ||
| 112 | 65 | 31 | 16 | 12 | 4 | 8 |
Tabela 1. Desenvolvimento de embriões no mouse do sistema de cultura de embriões. Embriões cultivados tanto para 16-18 h ou 38-40 horas. Do total de 112 embriões cultivados por 16-18 horas, 65 (58%) embriões exibiram desenvolvimento comparável aos embriões em desenvolvimento no útero, 31 (28%) apresentaram intermediário e 16 (14%) apresentaram fraco desenvolvimento. Do total de 12 embriões cultivados por 39-40 horas, apenas os embriões 4 (~ 35%) apresentaram um bom desenvolvimento, enquanto o desenvolvimento pobre mostrou restante.
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Discussion
Embriões fase mid-gestação de ratinho foram cultivadas num meio de cultura livre de soro, numa atmosfera de 95% O2 / 5% de CO 2, num aparelho de cultura de garrafa de rolamento a 37 ° C. O desenvolvimento embrionário ex útero foi criticamente dependente de vários factores, em cada passo durante o processo a partir do momento que o útero é isolado a partir de murganhos sacrificados para a realização da cultura (Figura 1). O fator mais importante que influenciou o desenvolvimento foi o tempo necessário para iniciar a cultura. Os outros pontos críticos durante o procedimento que exige mais atenção incluem os passos tal como a separação dos embriões com saco vitelino intacto do útero e a exteriorização de embriões a partir do saco vitelino. Como os roedores têm placenta discóide, dissecção segmentar do útero não danificou o fornecimento de sangue para o embrião, mesmo que a decídua placentária é ligeiramente danificado nos cantos. Na verdade, este deixou uma pequena abertura na eiLá acabam por meio do qual um par de fórceps sem corte pode ser inserido a rasgar delicadamente aberto do útero e da placenta decídua permitindo fácil isolamento dos embriões com saco vitelino intacta. No entanto, o passo seguinte de exteriorização dos embriões a partir do saco vitelino é crítico na medida em que qualquer dano para os grandes vasos sanguíneos do saco vitelino, potencialmente, afectar o desenvolvimento do embrião em cultura. Desenvolvimento embrionário adequado foi suportada quando os embriões foram exteriorizados partir do saco vitelino mantém o intacto da vasculatura no saco vitelino. Estudos anteriores indicaram a abertura do saco vitelino quando embriões de camundongos para além fase embrionária E10 foram cultivadas 1, 15, 18, 19. Assim, observou-se alterações degenerativas e os embriões não poderiam sobreviver ao período de cultura, quando embriões E10.5 foram cultivadas com saco vitelino intacta. Assumimos a exteriorização dos embriões facilitaria eficaz de nutrientes umabsorption através dos tecidos, mantendo a continuidade na vasculatura com o saco vitelino. Estes embriões em cultura exibiu batimento cardíaco eficaz e circulação sanguínea nas partes do corpo embrionárias em comparação com os embriões cultivados sem o saco vitelino.
Manter os embriões no meio de cultura aquecido a 37 ° C desde o momento em que são isolados a partir do útero para o tempo de cultura seria imediatamente proporcionar o melhor ambiente adequado para sustentar a sua capacidade para o desenvolvimento posterior na cultura. Isso também evita a contaminação devido à presença de antibióticos no meio e evita a incorporação de quantidades mesmo diminutas de PBS / DMEM na cultura. O meio definido que utilizaram produziu desenvolvimento embrionário superior em comparação com outros meios definidos anteriormente estabelecidas descritas em Wawersik et al. 20, 21 (dados não mostrados). A diferença no desenvolvimento embrionário pode ser devido, principalmente,para os componentes originais em nosso meio definido, tais como, substituição KnockOut Soro (KSR) e N-2 suplemento. Embora as N-2 suplemento foi mostrado para suportar o crescimento e expressão dos neurónios pós-mitóticos, KSR mostrou ser um substituto directo para o soro fetal de bovino a 22, 23. KSR foi utilizado em culturas para suportar o crescimento de células estaminais pluripotentes indiferenciadas, bem como células estaminais embrionárias humanas e de ratinho que foram mostrados para ser estável e de linha germinal competente 23-25. Para além do meio de cultura, a concentração de oxigénio no frasco de cultura desempenha um papel crítico no desenvolvimento embrionário. Os embriões não poderia sobreviver as condições de 5% de CO 2 num incubador convencional. Embora não testámos as outras concentrações de oxigénio e diferentes taxas de fluxo, como previamente sugerido 5,9, o uso de 95% de O2 / 5% de CO 2 a um caudal constante sustentou a sobrevivência dos embriões em cultura. Enquanto a rotação daé necessário frascos de cultura, quando os embriões cultivados sob as mesmas condições mas sem a rotação das garrafas de cultura resultou em não-sobrevivência dos embriões sem pulsação visível. Assumimos que a rotação constante (35 rpm) no aparelho de cultura garrafa de rolamento habilitado suspensão livre dos embriões no médio e assim aumentou a absorção de nutrientes e oxigênio através dos tecidos embrionários. O crescimento destes embriões em cultura em termos de corpo e cabeça de tamanho total, a morfologia, a formação de um coração bem compartimentado, vesículas cerebrais e desenvolvimento ocular foi comparável à dos embriões em desenvolvimento in utero. Em nossas mãos, nós fomos capazes de replicar o desenvolvimento embrionário que foi observado por 15 Moore-Scott et al.
Os embriões em cultura exibiu um intervalo de crescimento e desenvolvimento morfológico, dependendo de vários factores (Figura 3, Tabela 1). Sob a cultura definidacondições que usamos, embriões cultivados por 16-18 hr mostrou desenvolvimento comparável ao observado em embriões em desenvolvimento no útero em cerca de 58% dos embriões, enquanto 28% apresentaram intermediário e 14% mostraram uma evolução pobres. Extensão da cultura de 38-40 horas diminuiu ainda mais a capacidade de mostrar o desenvolvimento comparável a apenas 30-40% do total de embriões em cultura. Além dos fatores inerentes que potencialmente influenciam o desenvolvimento embrionário ex utero, muitos fatores externos que podem ser gerenciados, até certo ponto pode desempenhar papel crítico quando os embriões são cultivados por tempo prolongado. Um tal factor de potencial que pode ser controlada é o tempo que decorre entre o isolamento de embriões a partir do útero para o início da cultura. Ele pode ser interpretado que os primeiros embriões isolados são expostos a menos de oxigénio na placa de cultura em comparação com os embriões isolados no final como todos os embriões entrar no frasco de cultura e recebem 95% de O2 / 5% de CO 2ao mesmo tempo. No entanto, o oxigénio disponível no sangue que é deixado na placenta após a dissecação segmentar pode não suportar por um longo período de tempo e, por esta razão, a maior parte do equipamento e aparelho de cultura deve ser montado, pronto para ser usado antes da eutanásia de rato. Normalmente Temos os embriões para a cultura em 25-30 min do que o mouse foi sacrificado. Este período de tempo curto para iniciar a cultura não seria possível se os embriões estavam a ser processados um de cada vez, tal como sugerido na Zeebe, M. et al. 18 Quando os embriões são processadas individualmente, de agrupamento de embriões não é possível e cada embrião deve ser contabilizados pelo número somite. Este procedimento levaria pelo menos 5-6 min para cada embrião para isolar, exteriorizar de saco vitelino, conte somitos e transferir para o frasco de cultura. Para um tamanho de ninhada de 10-12 embriões, que normalmente começa a partir de nossos ratinhos CD-1, todo o processo levaria 60-72 min para os últimos embriões para entrar no culture. Isso é muito longo período e observou-se o batimento cardíaco para abrandar e quase parar quando os embriões foram exteriorizados e deixou em PBS e atrasou a cultura. Um outro fator potencial pode ser a manipulação ou mau uso dos embriões durante o procedimento. Durante o manuseio, você pode induzir um dano acidental em alguma parte do corpo ou dos vasos sanguíneos no saco embrionário ou gema que não é facilmente detectado. Isto pode afectar o desenvolvimento da referida parte do corpo, ou, por vezes todo o embrião, uma vez que foi observado que, mesmo um embrião bem desenvolvida, por vezes, mostra um tipo de desenvolvimento sob-nas extremidades como os botões dos membros e da cauda, indicando fornecimento insuficiente de sangue. É melhor para descartar tais embriões que parecem ser comprometida ou danificada durante o procedimento. O outro problema que habitualmente se encontram durante o processo era, alguns dos embriões com saco vitelino intactas prop abruptamente a partir decídua à dissecção segmentar do útero. Isto às vezes resulta em more a perda de sangue no ponto de separação a partir da placenta, embora a vasculatura com o saco vitelino mantém-se intacta. A perda de sangue pode afectar o desenvolvimento posterior do embrião devido à menor quantidade de sangue retido no organismo embrionário durante a separação.
Além dos factores acima certas condições, como, a fase de embrião no momento de iniciar a cultura influenciado o desenvolvimento da cultura. Nós, com sucesso cultivadas de embriões meados de gestação rato começando com etapas que variaram entre 28-37 s para 16-40 horas e observadas algumas diferenças no desenvolvimento. Embriões em 34-36 s palco exibiram um melhor desenvolvimento na cultura em comparação com os embriões em estágio de 30-33 s, indicando um aumento na capacidade de adaptação às condições de cultivo em embriões cultivados em fases posteriores. O outro facto surpreendente foi observado durante a cultura foi o desenvolvimento de embriões em que dois ou mais embriões foram co-cultivadas (Figura 4). Coculture redundoud numa melhoria significativa no desenvolvimento de um dos embriões em comparação com o outro embrião em 45% de co-culturas. Embora os embriões do mesmo útero semelhante morfologicamente e na contagem de somito, inerentemente não há dois embriões podem estar na mesma fase de desenvolvimento e isto pode ser uma das razões para a diferença de desenvolvimento de um dos embriões em comparação com o outro na co-cultura sistema.
Assim, mostramos que os embriões no meio da fase de gestação de rato cultivadas ex útero num meio livre de soro, numa atmosfera de 95% O2 / 5% de CO 2, num aparelho de cultura de garrafa de rolamento a 37 ° C o crescimento e desenvolvimento morfológico exposição comparável à observada nos embriões em desenvolvimento in utero. Acreditamos que este método de mouse do sistema de cultura de embriões será útil para laboratórios que necessitam de utilizar embriões inteiros para estudar as interações de sinalização importantes na organogênese embrionária.
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Disclosures
Não temos quaisquer interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Julie Gordon e Dr. Nancy Manley para o seu conselho útil com a técnica de cultura. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Glaucoma Infantil e Sharon-Stewart Aniridia Research Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KnockOut DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| N-2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock: 100x |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma | A9418-50G | Stock: 100% |
| Antibiotic - Antimycotic Solution | Cellgro | 30-004-Cl | Stock: Penicillin (10,000 IU/ml); Streptomycin (10,000 µg/ml; Amphotericin (250 µg/ml) |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| Precision Incubator Unit | B.T.C. Engineering Milton Cambridge England | Id.No. 840-374 | |
| Glass Bottles for Rotating Unit | B.T.C. Engineering | ||
| Silicone Rubber Cork | B.T.C. Engineering | ||
| 95% O2/5% CO2 Cylinder | AirGas Inc. | ||
| Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Stemi SV6 Microscope | Zeiss | ||
| CO2 Water Jacketed Incubator | Forma Scientific | Model: 3110 | |
| Culture Hood | Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2 | Model: Nu-425-600 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | IsoTemp205 | |
| Weigh Balance | Mettler Toledo | AG285 | |
| Centrifuge Tube, 50 ml | Corning | 430291 | |
| Light Operating Scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Operating Sharp-Blunt Scissors | Roboz | RS-6812 | |
| Microdissecting Forceps, 4 in | Roboz | RS-5211 | |
| Microdissecting Forceps - Hudson (cWALD), 4-3/4 in | Roboz | RS-5237 | |
| Microdissecting Tweezers (5/45) | Roboz | RS-5005 | Modified - Sharp ends were made blunt |
| Microdissecting Tweezers (5) | Roboz | RS-5060 | Modified - Sharp ends were made blunt |
| Microdissecting Tweezers (55) | Roboz | RS-5063 | Modified - Sharp ends were made blunt |
| Instrument Tray | Roboz | RT-1401S | |
| Instrument Tray Lid | Roboz | RT-1401L | |
| Petri Dish-100 mm | Fisher Scientific | 087571Z | |
| Petri Dish-60 mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Petri Dish-35 mm | Fisher Scientific | 0875711YZ | |
| Filter System ( 0.22 µm Cellulose Acetate)-150 ml | Corning | 431153 | |
| Filter System (0.22 µm Cellulose Acetate)-250 ml | Corning | 430756 | |
| Filter System (0.22 µm Cellulose Acetate)-500 ml | Corning | 430758 | |
| Pipet-aid Pipettor | Drummond Scientific Co. | D57849 | |
| Serological Pipette-10 ml | VWR | 89130-898 | |
| Disposable Serological Pipette-25 ml | Corning | 4251 | |
| Transfer Pipette - 7.7 ml | Thermo Scientific | 202-20S |
References
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