Summary
Embriyo kültürlerinde kullanılan serum, özellikle sinyalizasyon etkileşimler içeren çalışmalarda deney sonucunu etkileyebilecek bilinmeyen bileşenleri içerir. Burada bir serum içermeyen kültür sistemi kullanılan oksijenli ve 16-40 saat süre ile kültüre orta gebelik fare embriyo utero gelişen embriyo benzer morfolojik gelişimini gösteren göstermektedir.
Abstract
Orta gebelik aşama fare embriyoları oksijenli haddeleme şişe kültür sistemi içinde ticari olarak temin edilebilen, kök hücre ortamı takviyesi hazırlanan bir serum içermeyen kültür ortamı kullanılarak kültürlenmiştir. E10.5 fare embriyoları dikkatlice sağlam yumurta sarısının ile rahim izole edildi ve yolk kesesi ile embriyonun damar sürekliliğini korurken hassas cerrahi manevra kapsayan bir süreçte embriyoların yavaşça sarısı kesesi eksterioze edildi. Bozulmamış yolk kesesi veya uzaklaştırılarak yumurta sarısı ile hazırlanan embriyolar ile karşılaştırıldığında, bu embriyolar, üstün hayatta kalma oranı ve benzer koşullar altında kültüre gelişim ilerlemesi sergiledi. Biz, bu fare embriyoları, ne 16-40 saat boyunca 37 ° C'de% 95 O yuvarlanan şişe kültür cihazı içinde 2/5% CO2 atmosferinde tanımlanmış bir ortam içinde kültürlendi, karşılaştırılabilir morfolojik büyüme ve gelişme sergilerler olduğunu göstermektedir Embriyoların rahimde gelişmekte. Biz inci inanıyorumyöntem embriyonik organogeneziste önemli sinyal etkileşimleri incelemek için, tüm embriyo kültürünü kullanmak için ihtiyaç duyan araştırmacılar için yararlı olacaktır.
Introduction
In vitro bütün embriyolarını kullanarak kültür yöntemleri utero erişimi aksi takdirde zor olan embriyonik organogeneziste alan mekanizmaların sinyalizasyon incelemek için uygundur. Tüm embriyolar doku bütünlüğünü sağlamak ve gerekli mekanizmaları sinyalizasyon zamanında oluşumu için önemli olan doku etkileşimleri için uygun destek organojenez esnasında farklı hücresel süreçler için. Bütün embriyo kültürleri vb nakli çalışmaları, genetik ve doku manipülasyonları, boncuk implantasyon çalışmaları, toksikolojik çalışmalar, gibi uygulamalar bir bolluk için bir platform sağlarken., Şu anda kullanılan embriyo kültür sistemleri embriyoların uygun büyüme ve bakım için serum esas bağımlı kültür 1-9.
Serum kültür ortamı 6-8, 10, 11% 10-100 arasında değişen en önemli bileşenlerinden biri olarak kullanılmıştır., Bununla birlikte, serumun bileşim, iyi tanımlanmış değildir ve hayvandan hayvana farklı olabilir ve her zaman serum toplanır. Serum laboratuvar hazırlık zaman alıcı ve sıkı prosedürleri içerir iken, tedarik serum ticari farklı partiler arasında önemli değişkenlik gösterir ve deneysel maliyetlerini yükseltir. Bunlara ek olarak, serum gibi potansiyel olarak bazı deneylerin sonuçlarını etkileyebilir büyüme faktörleri, hormonlar veya başka proteinler, doku etkileşimlerinin önemli sinyal molekülleri çalışma gerektirir özellikle bu bilinmeyen faktörler içerebilir. Çalışmalar kültüre serumu ilaveli potansiyel olarak siklik adenosin monofosfatın (cAMP) ve mitojenik sinyal ve fosfoinositid 3 katılan proteinleri (3 PI) kinaz geçitler 12-14 sinyal gibi bazı sinyal moleküllerinin hücre içi seviyelerini değiştirebilir göstermiştir. Bu aksine, bir serum içermeyen kültür sistemi, antijen serbest ortamının avantajlar sağlamaktadırhücresel süreçleri değiştirebilir ve biyolojik olarak aktif enzimleri oruç deneyleri arasında tutarlılık sağlar.
Bu çalışmada, 37 ° C'de% 95 O yuvarlanan şişe kültür cihazı içinde 2/5% CO2 atmosferinde kültür orta gebelik aşama bütün embriyolar için ticari olarak temin edilebilen, kök hücre ortamı takviyesi hazırlanan bir serum içermeyen kültür ortamı kullanılmaktadır C 15,16 °. Bu tanımlanan koşullar altında 16-40 saat için kültürlenmiştir Fare embriyolar hücresel çoğalma, göç ve farklılaşma doku etkileşimlerinin uygun seviyelerini gösteren bu kalp, kol, beyin ve göz gibi genel embriyonik gövde ve farklı yapılarda morfolojik gelişiminde ilerlemesi sergiledi. Göz gibi karmaşık organ sistemlerinin biri için kültüründe embriyonik gelişme moleküler analizi embr okular doku gözlemlenen ile tutarlı olması için, oküler gelişimini sergilemiştirYÖS (hazırlık, Kalaskar ve Lauderdale) rahimde gelişmekte. Böylece orta gebelik aşamasında kültürlendi fare embriyoları, rahimde embriyo geliştirme gözlenen ile karşılaştırılabilir aşamalı büyüme ve gelişme sergilerler morfolojik göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fare embriyo kültürü:
Tüm deneysel prosedürleri gözden ve devam düzenleyici gözetim korur Gürcistan Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanan protokol # A2010 07-119, aşağıdaki sağlık kuralları National Institutes ile sıkı göre yapılmıştır.
1.. Kültür Medya hazırlanması
- KnockOut DMEM, nakavt Serum Replacement (KSR) (% 10), N-2 Supplement (1x), Albümin, İnek Serum (2%), Penisilin (: aşağıdaki miktarlarda ticari olarak temin edilebilen, kök hücre ortamı ve takviyeleri ile kültür ortamı hazırlayın 50 IU / ml), streptomisin (50 ug / ml) ve Amfoterisin-B (1.25 ug / ml). Hazırlanan kültür ortamı, daha önce, aşağıdaki değişikliklerle 15 tarif edilene benzer: antimikotik ilavesi ve özel reaktifler ve ekipman ile ilgili ayrıntılar için antibiyotik iki konsantrasyonunun (bakınız, Li kullanarakMalzemelerin st).
Not: Daha önce kullanılan (. Moore-Scott, vd 15) olarak antibiyotik konsantrasyonu embriyo kültürleri 24 saatlik süre kadar taşınan için yeterli oldu. Kültür, 24 saat devam edildi ötesinde, ancak biz kültür kirlenmesini deneyimli bu başarılı bir antibiyotik konsantrasyonunun iki katına ile kontrol edilmiştir. - 4 ° C'de ya da üretici tavsiyelerine uygun olarak -20 ° C 'de, ortam bileşenleri saklayın. KSR ve N-2 Ek tekrarlanan donma ve erime önlemek için -20 ° C'de parçalar halinde muhafaza edilmelidir. Bir kez açıldı KnockOut DMEM üreticinin tavsiyesine göre 30 gün içinde kullanılmalıdır. Kullanımdan önce, 37 ° C bir su banyosu içinde bileşenleri sıcak
- Steril şartlar altında ortam hazırlayın. Tüm ekipman ve kültürü kaputu koymadan önce% 70 alkol sprey ile medya bileşenleri içeren şişelerin yüzeyi dezenfekte edin.
- Ortam bileşenleri steril bir beherde veya doğrudan filtre sistemi (Corning) in ya da karıştırılabilir. İlk KnockOut DMEM'ye albümin tozu ekleyin. Albümin tamamen eriyene kadar hafifçe sallayarak iyice karıştırın. Daha sonra N-2 Ek, KSR ve antibiyotik eklemek ve bir pipet ile iyice karıştırın. Daha sonra vakum emme ile 0.22 um gözenek boyutlu filtre kullanılarak filtre ortamı sterilize. Kullanılana kadar 4 ° C'de 50 ml konik tüp içine saklamak ve ortam dağıtın. Bir kez hazırlanan ortam kültür 4-5 gün içinde kullanılmalıdır.
2. Kültür Ekipmanları Hazırlanması
- Cam kültür şişeleri ve kauçuk mantarlarını sterilize edin. Bir alüminyum folyo ile kültür şişeleri sarın ve su bir beher içinde kauçuk mantarı şişe yerleştirin ve otoklav ile sterilize edilir.
- Kültür başlamadan önce% 70 alkol sprey sıcak ve 37 ° C ile kültür odası (Precision Kuluçka Birimi) sterilize edin. Kültür odası ekültür şişeleri tutan merkezi bir dönme diski ile quipped. Odacık içine gaz akışı, bir basınç ölçer tarafından düzenlenir ve akış hızı sonunda bir cam tüp içinde suda hava kabarcıkları çıkış gözlemleyerek ayarlanabilir. Bu haddeleme şişe kültürü cihaz Yeni ve Cockroft 17 tarafından tanıtılan orijinal cihazının değiştirilmiş bir versiyonu.
- Kültür bölmeye% 95 O 2/5% CO2 bir gaz karışımı ihtiva eden bir gaz silindiri ve 50 cc / dk 'lık bir akış hızı sağlar ve yeterli oksijen gitmesini sağlar "saniyede bir hava kabarcığı" gaz akışını ayarlamak Kültür embriyolar.
3. Fare Embriyo Toplama ve Kültür Hazırlık
- Yaban tip fare embriyoları elde etmek için, C57BL/6J ve CD-1 (Charles River Laboratories) genetik arka soylannın fareler kullanılmıştır.
- Her gün sabah vajinal fişleri için dişi farelerin kontrol. Th bulma gün öğleE vajinal fiş E0.5 DPC (gün cinsel birleşme gönderebilir) olarak kabul edilmelidir.
- Standart protokolleri izleyen hamile fareler euthanizing tarafından E10.5 DPC de fare embriyolar toplayın. Fareler Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği (AVMA) Hayvanların Ötenazi (2013) için rehber tarafından belirtilen bir CO 2 inhalasyon cihazı kullanılarak ötenazi edildi. Ölüm sağlanması için, servikal dislokasyon CO 2 maruz kaldıktan sonra gerçekleştirilmiştir.
- Araçlara abdominal saç yapışmasını önlemek için ventral karın yüzeyi üzerinde% 70 etanol püskürtün. Sonra keskin künt işletim makas ve rahim bulmak için forseps Microdissecting içinde 4-3/4 bir çift kullanarak ventrale karın boşluğu açmak. Microdissecting forseps bir 4 kullanarak tüm rahim kaldırın ve rahim gövde ve rahim boynuzları ucunda bir ışık işletim makas ile keserek gövdesinden ayırmak.
- Çabuk durulama 1x PBS içinde bütün uterus 37 ° C'ye kadar ısıtıldırahim için bir kan yapışmasını çıkarın ve hemen DMEM içinde yerleştirmek için bir Petri kabı, 37 ° C'ye kadar ısıtıldı. Ayrıca kullanımdan önce% 70 etanol sprey tarafından aletleri sterilize edin.
Not: PBS, DMEM ve kültür ortamına dahil olmak üzere, ve tüm işlem boyunca 37 ° C'de muhafaza bunları ön ısıtma çözüm önerilir. - Bir mikroskop altında, rahim segmental bir ışık işletim makas ile disseke edilmelidir. Bu (köreltilmiş uçlar) modifiye Microdissecting cımbız hafifçe açılmasına genişletmek için sokulabildiği aracılığıyla bölümlere rahmin her iki tarafında küçük açıklıklar ile sonuçlanır. Bu, daha sonra yavaşça Reichert membran ile parietal sarısı kese (PYS) ortaya çıkarmak için Microdissecting bir çift cımbız ile yırtılarak temizlenebilir plasental decidua, maruz kalmasını mümkün kılar. Cımbız kullanarak bir kenarı hafifçe PYS birlikte Reichert membran delmek ve inci ayrıE visseral sarısı kesesi (VYS) altında yatan bozulmamış Vys ile embriyolar maruz katman. Ectoplacental koni ve trophoectoderm türevleri plasental decidua veya Reichert membran ile ya da temizlenebilir. Bakım embriyolar derhal dışarı pop gibi Vys rüptürü önlemek için alınmalıdır.
- Bozulmamış VYS ile Embriyolar daha sonra kültür ortam maddesi plastik bir transfer pipeti kullanılarak 37 ° C'ye kadar ısıtıldı içeren bir Petri tabağına transfer edilmelidir.
Not: rahim hemen ayrıldıktan sonra kültür ortamına transfer kültüründe embriyonun gelişimi için daha iyi olur. - Küçük bir açılış büyük kan damarları kaçınarak Microdissecting cımbız ile yumurta sarısının yapılmalıdır. Cımbız keskin bir çift hafifçe kafa bölgesine bitişik bir alanda delerek açılmasını sağlamak için kullanılabilir. Alternatif künt cımbız iki çift sarısı kesesi tutun ve yavaşça küçük bir açılış yapmak için gözyaşı için kullanılabilir.Sonra yavaşça embriyonik kafasını sığdırmak için yeterli bir boyuta cımbız ile genişleterek açıklığı genişletmek. Yakından embriyo tamamlıyor amniyon zarı yavaşça vücuttan düzenlenen ve bir cımbız kullanarak yırtılmış olmalıdır. 15 kese sarısı bununla embriyonik damar bütünlüğünü koruyarak embriyonik baş ve daha sonra bütün embriyo yavaşça sarısı kesesi eksterioze edilmelidir.
Not: yumurta sarısı kesesi damar hasarları potansiyel kültür embriyonun gelişimini etkileyebilir. Hasarlı damar sistemi ile bu tür embriyo kültürü için kullanılmamalıdır ve daha sonra iptal edilebilir embriyoların hazırlama için kullanılabilir. - Embriyonik evreleme kriterleri: gövde ve baş büyüklüğü, bacak ve her gruptan en az iki embriyo için hücre gruplarının sayısını (ler) sayılarak göz morfolojisi ve sahneye dahil morfolojik kriterlere göre mikroskop ve grubu altında embriyolar inceleyin.
<strong> Not: Genellikle rahimde gelişme aynı çöp gösteri farklarından elde ve vücut büyüklüğü, morfolojik özellikleri ve Somitlerin sayısında farklılık embriyolar. Ancak, bizim morfolojik kriterlere göre gruplandırılmış embriyolar genellikle benzer hücre gruplarının sayısını (± 1) sergilenen bulundu. Bu nedenle, bu kültür için başlangıç gecikme süresi gibi her embriyo için somitler saymak için gerekli değildir.
Not: kültür somitler saymak için kullanılan embriyolar kullanmayın. Kültürünü başlayarak zaman gecikmesini önlemek için diğer embriyoları için kültür başladıktan sonra somitler saymak. Rahim ayrıldıktan sonra kültüre gecikmeli embriyolar genellikle zayıf gelişme gösterirler. - Orta 37 ° C ısıtılmış taze kültürü ile bir Petri kabı hemen embriyoların transferi ve embriyoların tekrar steril Kültür ile bir Petri kabı transfer edilmelidir kültürü kaputu götürüne medya ortamı ile kültür şişeler içine koymadan önce kültürünü başlatın.
Not: embriyoların için birden fazla medya transferlerini kültür embriyo toplama ve diseksiyon farklı adımlar kültürü kaputu yüklü olmayan bir mikroskop altında gerçekleştirilmiştir gibi kirlenmeyi önlemede yardımcı olur önce.
Not: DKBKS (> 12 embriyo), süreç yarım embriyolar büyük ve başlangıç kültürü veya kültür ortamı ile bir tabak koyun ve 37 ° C'de CO 2 inkübatör yerleştirdiğinizde Embriyolar uzun süre (> 35-40 dk) kalmıştı dışında biz yavaşlatmak ve bu kültürü daha sonra gelişimini etkileyecek kalp gözlenmiştir.
4. Fare Embriyolar Kültürleme
- Kültürü kaputu otoklava kültür şişe açın ve bunları düzgün etiket. Kültür ortamı transferi 3 ml t her birine 37 ° C'ye kadar ılıtıldıo şişeler ve ardından fare embriyoları steril plastik transferi pipetler kullanılarak kültür şişeler içine yavaşça transfer edilmelidir. Kültürü şişeleri daha sonra kültür cihazında haddeleme diske kültür şişeleri tutmaya yardımcı kauçuk tıpa ile kapatılmış bir şişe olmalıdır.
Not: medya ile kültürü şişeleri farelere ötenazi önce hazırlanan ve kültür tertibatının haddeleme disk üzerine yerleştirilebilir. Bu durum, kültür şişelerine embriyo transferi için süreyi kısaltır.
Not: Fareler Embriyolar bireysel olarak veya aynı kültür şişesi içinde iki ya da üç embriyolar ile alt kültürleri olarak kültürlenebilir. - Kültürü şişeleri aseptik olarak 37 ° C 'de kültür aparatına taşınan ve sıkı bir şekilde kauçuk tıpa ile haddeleme disk üzerindeki deliklere onları kanca gerekmektedir. Embr serbest yüzmesini sağlayan dakika (rpm) başına 35 rotasyonlar sabit bir hızda dönmeye haddeleme disk açınAyrıca medya ve yolar embriyonik doku tarafından serbest gaz alışverişi olur. Kültür odası bağlı silindirden gaz kültür şişeleri içine haddeleme disk ve lastik mantarları akar.
- Düzenli Kültür 16-40 saat boyunca embriyolar ve gaz çıkışı ve kültür oda sıcaklığı kontrol edin.
Not: fare embriyo manipülasyon kültüründe: embriyoların en az 30 dakika boyunca kültür koşullarına adapte olsun. Daha sonra düşük performans ve güçsüz bir kalp atışı gösteren embriyolar iptal edilebilir ve geri kalan embriyoların daha fazla işleme çalışmaları için kullanılabilir. Örneğin elektroporasyon 5,9,16, mikroenjeksiyon 18, boncuk implantasyon 16, ilaç tedavisi ve diğer işlemler gibi Embriyo manipülasyonu, bu anda gerçekleştirilebilir. Biz başarıyla erken göz gelişimi rollerini incelemek için bazı sinyal molekülleri ile tedavi Affi-jel agaroz boncuk implantasyonu yapıldı. Embriyolar, sonramanipülasyonlar bir taze ortamda geri döndü ve kültürü devam edilebilir. - 9-10 saat ve kültür 18-19 saat kültür 40 saat boyunca devam edildi sonra belirli aralıklarla tamamen taze ortam ile kültür ortamı değiştirin.
Not: kültür 16-18 saat tarafından durdurulduğunda kültür ortamı yerine gerekmeyebilir. - Kültüründe başarılı ölçüleri: kültüründe embriyonik gelişme vücut büyüklüğü artış, hücre gruplarının sayısı ve baş, kol, kalp ve gözlerin morfolojik geliştirilmesi yolu ile değerlendirilmelidir ise kültüründe embriyonik hayatta kalma vücutta görünür kalp ve kan dolaşımı tarafından belirlenmelidir.
- E11.0 DPC (~ 40-41 ler) ve E12.0 DPC (~ 49-50 ler) utero geliştirilen embriyolarda sırasıyla, 16-18 saat ve 38-40 saat için, kültürlenmiş embriyolar karşılaştırmak için kontrol olarak kullanılmalıdır.
- Kültür sırasında ve utero aşamalarında için farklı zaman noktalarında embriyonik gelişme capt edilebilirdiseksiyon mikroskop altında değe. Nokta görüntüleme yazılımı görüntüleri yakalamak için kullanılan ve daha sonra görüntü işleme yazılımı kullanılarak işlendi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fare embriyolarının gelişimi ex utero rahim embriyolar kültürlenir süre için vücut izole edilir zaman başlangıç çok sayıda faktöre bağlıdır. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, işlem vücuttan uterus ayrılmasından (Şekil 1A), bozulmamış yolk kesesi (Şekil 1 B) ile embriyoların izolasyonu da dahil olmak üzere bir dizi adım içerir, yumurta sarısı kesesinden embriyoların eksteriorizasyon ( Şekil 1C) ve 37 ° C'de% 95 O yuvarlanan şişe kültür cihazı içinde 2/5% CO2 atmosferinde bir serumsuz ortam içinde kültür embriyoları Hemen rahim ayrıldıktan sonra kültür ortamı içine aktarıldı zaman Embriyolar% 100 hayatta kalma sergiledi. Bu kültür koşulları, fare embriyolarında altında zaman içinde gelişen eşdeğer aşamasında embriyoların gözlenene 16-40 saat sergilenen büyüme ve gelişme için morfolojik kültürlendi karşılaştırılabilirintrauterin (Şekil 2).
E10.5 (~ 34-35 s) (Şekil 2A) 16-40 saat süre ile kültüre hayatta ve iyi 35 s aşamasında ötesinde gelişme gelişmiş zaman da embriyolar. Kültür içinde, 16-18 saat (Şekil 2B ve 3B, Tablo 1) Embriyolar 5-6 ~ kültüründe her iki buçuk saat için bir hücre gruplarının bir büyüme sergileyen ve E11.0 (morfolojik olarak karşılaştırılabilir s eklendi utero (Şekil 2B ve 3A) geliştirilen 40-41 s) embriyolar. Kalkınma yaklaşık bir saat gecikmeli olarak olsa da, kültür bu embriyolar farklı beyin veziküller ile vücut büyüklüğü genel bir artış ve orantılı bir kafa sergiledi. Embriyolar, aynı zamanda, retina pigment epiteli içinde iyi odalı kalp ve pigmentasyon görünüş oluşmasını bacak tomurcukları geliştirmek gösterdi. Bununla birlikte, bu tür bir gelişme emb yaklaşık% 58 olarak gözlenmiştirembriyoların% 28 bir orta gelişme (Şekil 3C) göstermesine rağmen ryos kültürlenmiştir. Bu in utero gelişmiş embriyolara kıyasla benzer bir hücre gruplarının sayısı sahip olsa da, bu, daha sonra daha küçük bir embriyolar, vücut büyüklüğü gösterdi. Beyin veziküller demarcated olmasına rağmen onlar, nispeten daha küçük bir kafası vardı. Kalp odacıkları ayrı değildi ve bazı embriyolar ekstremite tomurcukları ekstremitelerde karanlık bölgeleri sergilendi. Spektrumun diğer ucunda, embriyoların yaklaşık% 14 kültürü (Şekil 3D) kötü bir gelişme sergilemiştir. Bu embriyolar daha kısa gövde ve baş boyutları vardı ve dejeneratif değişiklikleri gösteren vücudun bazı bölgelerinde koyu alanlar gösterdi. Kalp dövüyordu olsa hasta gelişmiş ve diğerleri uzuvların karanlık ve büyüme geriliği görülürken, bazı embriyolar odalarına farklılaşma yoktu.
SH; Embriyolar 38-40 saat (Tablo 1 Şekil 2E) kültür içinde devamyaklaşık 49-50 s borçlu ve E12.0 embriyolar rahimde gelişti (Şekil 2C) karşılaştırılabilir. 2-3 saat gecikmeli birlikte, kültürde bu embriyolar, vücut büyüklüğüne orantılı olarak artış göstermiş ve kafa bölgesinde bir de sınırlı, burun ve retina pigment epiteli ve oluşumunda pigmentasyon gelişiminde görülen gibi uygun organogenez ve doku farklılaşması gösterdi. Ekstremite tomurcukları ve kuyruk gibi ekstremitelerde bazı parçaları altında gelişmiş olduğu ortaya çıktı rağmen, embriyolar utero embriyoların karşılaştırılabilir gelişmekte olduğu ortaya çıktı. Bunların geri kalan gecikmeli büyüme alanları ile ya da altında geliştirme vücudun bazı kısımlarında veya gelişimsel ilerlemesinin bir dizi sergilemiştir Bununla birlikte, bu tür bir gelişme (Tablo 1) kültürlü embriyoların yalnızca% 30-40 gözlenmiştir Bütün embriyo.
Yanı sıra gelişme yukarıdaki farklılıklardan, önemli bir differe görülmektedir embriyolar aynı kültür şişesi içinde kültüre edildi geliştirme ım. Diğer embriyo (Şekil 4A ve 4A ') ile karşılaştırıldığında kokültür de, iyi gelişmiş embriyo (Şekil 4B ve 4B') embriyonik gelişiminin tüm yönleriyle daha iyi bir büyüme sergiledi. Başlıca farklılıklar, genel vücut büyüklüğü ve baş boyutu ve bazen kalp ve aza gelişiminde gözlenmiştir. Kokültür gelen iyi gelişmiş embriyo rahimde gelişen embriyolar morfolojik olarak karşılaştırılabilir iken, kokültür diğer embriyo, her zaman iyi gelişmiş embriyo kıyasla daha az gelişmiş olduğu ortaya çıkmıştır. Alt kültürleri olarak (N = 33) 'nin geri kalan ortak kültürü hem de embriyo hemen hemen benzer bir gelişme gösterdi gelişme fark Bu tür, (N = 27), alt kültürleri olarak% 45 olarak gözlenmiştir.
e 1 "fo: İçerik-width =" "fo: src =" 5in / files/ftp_upload/50803/50803fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50803/50803fig1.jpg "/>
Anne fareden izole embriyolar ile Şekil 1.. Fare embriyo kültür protokolü Adımlar. (A) Gravid rahim. Rahim segmental diseksiyonu sonra desiduada ayrılmış sağlam yumurta sarısının ile (B) Embriyolar. (C) Embriyolar yumurta sarısının gelen eksterioze. (D) Rolling şişe kültür 37 ° C'de Cihaz ve% 95 O 2/5 fare embriyoları kültüre için% CO 2 ile birlikte. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
<kültür br /> Şekil 2. embriyolar utero gelişiminde çoğaltmak. E10.5 (A), E11.0 (B) ve E12.0 (C) utero geliştirme. 18 saat (D) ve 40 saat (E) sonra kültür geliştirilmesi. (E) Ölçek çubuğu tüm paneller için geçerlidir. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Kültür Şekil 3. Embriyonik gelişim. Embriyo E11.0 DPC kültürde (A). Development (B, C, D) de rahimde gelişti. (BKültüründe iyi embriyonik gelişim) Temsil. Toplam embriyoların yaklaşık% 58 utero gelişen embriyolarda için sergi karşılaştırılabilir gelişimini kültüre. Kültür ara gelişme (C) Temsil. Embriyoların yaklaşık% 28 gösteri orta gelişimini kültüre. Kültür yoksul embriyonik gelişim (D) Temsil. Yaklaşık% 14 embriyo kültürü zayıf gelişim gösterirler. (D) Ölçek çubuğu tüm paneller için geçerlidir. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. Kokültürü (A başında fare embriyo kokültürü sisteminde. Embriyolar gelişimsel farklılıkları B). Embriyonik gelişme ko-kültürü 16 saat (A ', B') sonra. Kokültür (A ')' de embriyo biri ortak kültürü içinde (diğer embriyo B) göre daha küçük boyutlu görünür ". (B ') Ölçek çubuğu tüm paneller için geçerlidir. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
| 16-18 saat boyunca kültürlenmiştir toplam embriyolar | 16-18 saat sonra, kültüre Development | 38-40 saat boyunca kültürlenmiştir toplam embriyolar | 38-40 saat sonra, kültüre Development | |||
| Iyi | Ara | Yoksul | Iyi | Yoksul | ||
| 112 | 65 | 31 | 16 | 12 | 4 | 8 |
Fare embriyo kültür sisteminde embriyo Tablo 1.. Development. 16-18 saat veya 38-40 saat kültürlendi ya da embriyolar. 16-18 saat, 65 (% 58) rahimde embriyo gelişmekte olan embriyo ile karşılaştırılabilir bir gelişme sergilemiştir için kültürlendi toplam 112 embriyo arasında, 31 (28%) ara-ürün göstermiştir ve 16 (% 14) kötü bir gelişme göstermiştir. 39-40 saat boyunca kültüre toplam 12 embriyoların, sadece 4 (~% 35) embriyolar ise kalan gösterdi zayıf gelişme iyi bir gelişme gösterdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Orta gebelik aşama fare embriyoları, 37 ° C'de% 95 O 2/5 bir haddeleme şişe kültür cihazı içinde% CO2 atmosferinde bir serum içermeyen kültür ortamı içinde kültürlendi Embriyo gelişme ex utero rahim kültürün tamamlanmasından (Şekil 1) için ötenazi farelerden izole edilir zaman, işlem sırasında her adımında birden fazla faktöre bağımlı idi. Gelişimini etkileyen en önemli faktör kültürü başlatmak için alınan zaman oldu. En çok dikkat gerektiren işlem sırasında diğer kritik noktalar gibi sağlam sarısı rahim kese ve yolk kesesi embriyoların eksteriorizasyon embriyoların ayrılması gibi adımları içerir. Kemirgenler diskoid plasenta gibi, rahim segmental diseksiyonu plasenta desidua biraz köşelerde zarar görmüş olsa bile embriyo kan akımı zarar vermedi. Aslında bu ei küçük bir açıklık yaptıkünt forseps bir çift hafifçe açık rahim ve bozulmamış sarısı kesesi embriyo kolay izolasyonunu sağlayan plasenta desiduadan gözyaşı eklenebilir hangi aracılığıyla orada biter. Bununla birlikte, yumurta sarısı kesesinden embriyoların eksteriorizasyon bir sonraki adım yolk kesesi en büyük kan damarlarına herhangi bir zarar potansiyel kültürdeki embriyo gelişimini etkisi olacağı önemlidir. Embriyolar yumurta kesesinde damar Bozulmamışlık muhafaza sarısı kesesi eksterioze zaman doğru embriyonik gelişimi desteklenmiştir. E10 embriyonik aşama ötesinde fare embriyoları 1, 15, 18, 19 kültürlenmiştir zaman önceki çalışmalar, yumurta sarısının açılmasını göstermiştir. Buna göre, dejeneratif değişimler gözlendi ve E10.5 embriyolar sağlam yumurta sarısının ile kültüre edildiğinde embriyoların kültürü dönemini hayatta kalamazdı. Biz embriyoların Eksteriorizasyon etkili besin a kolaylaştıracak varsayıyorumyolk kesesi ile damar içinde sürekliliğini korurken dokular vasıtasıyla bsorption. Kültüründe Bu embriyolar yumurta sarısının olmaksızın kültür edilen embriyolara kıyasla embriyonik gövde parçaları etkili kalp atışı ve kan dolaşımını sergiledi.
Kültür ortamında embriyoların bakımı doğru bunlar kültürünün zaman rahim izole edilir zaman 37 ° C'ye ısıtıldı hemen kültüründe daha sonra gelişmesi için yeteneklerini sürdürmek için en uygun bir ortam sağlar olacaktır. Bu, aynı zamanda ortam içinde antibiyotiklerin varlığını kirlenmesini önler ve kültürüne PBS / DMEM çok küçük miktarlarının dahil edilmesini önler. Kullandığımız adres önceden belirlenmiş bir ortam Wawersik et al. 20'de tarif edilen diğer kurulmuş tanımlanmış ortam, 21 (veriler gösterilmemiştir) ile karşılaştırıldığında üstün embriyo gelişimini sağladı. Embriyonik gelişim farkı esas olarak olabilirBu tür KnockOut Serum Replacement (KSR) ve N-2 Ek, olarak tanımlanan bir ortam içinde tek bileşenlere. N-2 Ek post-mitotik nöronların büyümesi ve ekspresyonunu desteklemek için gösterilmiştir birlikte, KSR 22 fetal sığır serumu, 23 için doğrudan yerine olduğu gösterilmiştir. KSR farklılaşmamış pluripotent kök hücrelerin büyümesini hem de 23-25 yetkin kararlı ve tohum çizgisi olduğu gösterilmiştir, insan ve fare embriyonik kök hücreleri desteklemek için kültürler kullanılmıştır. Ayrı olarak kültür ortamından, kültür şişesi içindeki oksijen konsantrasyonu, embriyo gelişiminde önemli bir rol oynar. Embriyolar geleneksel bir inkübatör% 5 CO 2 koşullarını hayatta kalamazdı. Daha önce 5,9 önerilen diğer oksijen konsantrasyonları ve farklı akış oranlarına test olsa da,% 95 O, sabit bir akış oranında 2/5% CO 2'nin kullanımı kültürdeki embriyoların hayatta kalma korumuştur. Dönme sırasındakültür şişeleri embriyolar aynı koşullar altında ancak kültür şişeleri herhangi bir rotasyonu ile kültüre edildiği zaman görünür bir kalp atışı ile embriyoların Ölenler sonuçlandı gereklidir. Biz, haddeleme şişe kültürü düzeneğinde sabit dönüş (35 rpm) serbest ortam içindeki embriyoların süspansiyon ve aynı zamanda geliştirilmiş embriyonik dokular arasında besin ve oksijen emilimini etkin olduğunu varsayalım. Genel vücut ve baş boyutu, morfoloji, iyi odacıklı oluşumu, beyin veziküller ve oküler geliştirme açısından kültüründe bu embriyoların büyüme rahimde embriyo geliştirme ile karşılaştırılabilir olmuştur. Bizim ellerde, biz Moore-Scott ve ark. 15 oranında gözlenmiştir embriyonik gelişimini çoğaltmak mümkün
Kültüründe embriyolar çok sayıda faktöre (ve Tablo 1 Şekil 3) bağlı olarak büyüme ve gelişme morfolojik bir dizi sergiledi. Tanımlı kültürü altında% 28 orta gösterdi ve% 14 zayıf bir gelişme göstermiştir ederken kullanılan koşullar, 16-18 saat süre ile kültüre embriyolar, embriyo yaklaşık% 58 in utero gelişen embriyolar gözlenen ile karşılaştırılabilir bir gelişme göstermiştir. 38-40 saat kültürün uzantısı daha kültürlü toplam embriyoların sadece% 30-40 karşılaştırılabilir gelişme göstermek için yeteneği azalmıştır. Embriyoların zaman uzun süre boyunca kültürlenir zaman yanı sıra potansiyel olarak embriyonik gelişme ex utero etkileyen doğal faktörler, belirli bir dereceye kadar kontrol edilebilir birçok dış faktörlerin önemli bir rol oynayabilir. Kontrol edilebilir Böyle bir potansiyel faktör kültürün başlamasından rahim embriyoların izolasyonu alınan zamandır. Bu ilk izole edilmiş embriyolar tüm embriyolar kültür şişesi içine gidip% 95 O 2/5% CO2 almak gibi sonunda izole embriyolara kıyasla kültürü çanağı içinde daha az oksijene maruz kaldığı yorumlanabiliraynı zamanda. Ancak segmental diseksiyon sonra plasenta bırakılır kanda mevcut oksijen Uzun bir süre için destek olmayabilir ve bu nedenle kültür ekipman ve düzeneğin en fare ötenazi önce kullanılmak üzere hazır kadar ayarlanmalıdır. Biz genellikle fare ötenazi edildi zaman 25-30 dakika içinde kültürü içine embriyolar olsun. Embriyolar Zeevi önerildiği gibi bir defada bir işlenecek olsaydı kültürü başlatmak için bu kısa süre mümkün olmazdı, M. et al. 18 embriyo bireysel olarak işlenmiş olduğunda, embriyo gruptur mümkün değildir ve her embriyo olmalıdır hücre gruplarının sayısı sayılmıştır. Bu prosedür, exteriorize yolk kesesi, her embriyo izole etmek için en az 5-6 dakika sürer somitler saymak ve kültür şişesine transfer olur. Genellikle bizim CD-1 farelerinden olsun 10-12 embriyo, bir çöp boyutu için, tüm süreci c içine almak için son birkaç embriyo için 60-72 dakika alacağınıulture. Bu oldukça uzun bir süre ve biz embriyolar eksterioze ve sol PBS ve kültüre ne zaman gecikmiş yavaşlatmak ve durdurmak için neredeyse kalp atışlarını görülmektedir. Bir diğer potansiyel faktör prosedürü sırasında embriyoların işleme veya yanlış olabilir. Taşıma sırasında, kolayca algılanmaz embriyo veya yumurta kesesinde vücut veya kan damarlarının bir kısmını bir kaza sonucu hasar neden olabilir. Hatta iyi gelişmiş bir embriyo bazen yetersiz kan akımını gösteren bacak tomurcukları ve kuyruk gibi uçlarda altında gelişme bir tür gösterir gözlendi gibi bu beden veya bazen bütün embriyonun bu kısmının gelişimini etkileyebilir. Bu işlem sırasında tehlikeye veya hasarlı görünen bu tür embriyoların atmak daha iyidir. Genellikle işlem sırasında karşılaşılan diğer sorun sağlam yumurta sarısının ile embriyoların bazıları rahim segmental diseksiyonu üzerine desiduada dan aniden dışarı pervane oldu. Bu bazen mo sonuçlanıryolk kesesi ile damarsal bozulmadan kalmasına rağmen plasenta ayrılması noktasında kan kaybını yeniden. Bu, kan kaybı nedeniyle ayrılması sırasında embriyonik gövde içinde tutulan kan az miktarda embriyo daha sonra gelişmesini etkileyebilir.
Yanı sıra, yukarıdaki faktörlerden kültür başlangıç zamanında embriyonun aşamasında gibi bazı koşullar kültürdeki gelişimini etkilemiştir. Biz başarılı bir şekilde kültür orta-gebelik fare embriyoları 16-40 saat boyunca 28-37 s arasında değişmekte ve gelişme bazı farklılıklar gözlenmektedir aşamaları ile başlayan. 34-36 s aşamada embriyolar daha sonraki aşamalarında kültürlendi embriyo kültür koşullarına uyum bir artış gösteren 30-33 s aşamasında embriyoların göre kültür içinde daha iyi bir gelişme sergilemiştir. Kültür sırasında gözlenen diğer şaşırtıcı bir gerçek, iki ya da daha çok embriyo kültüre edildi embriyo gelişimi (Şekil 4). Coculture resultecocultures% 45 diğer embriyo göre embriyoların birinde gelişiminde önemli bir iyileşme d. Aynı rahim embriyolar morfolojik ve somite sayısında benzer olsa da, doğal olarak hiçbir iki embriyo gelişiminin aynı aşamasında olabilir ve bu ortak kültürü de diğer kıyasla embriyoların birinde gelişimsel farklılığın nedenlerinden biri olabilir sistemi.
Böylece göstermektedir ki 37 ° C sergi büyümesi ve morfolojik gelişme karşılaştırılabilir en% 95 O 2/5% bir silindir şişe kültürü cihazında CO2 atmosferinde bir serumsuz ortam içinde orta gebelik aşama fare embriyo kültürlenmiştir ex utero o rahimde gelişen embriyolar gözlenen. Biz fare embriyo kültür sisteminin bu yöntem erken embriyonik organogeneziste önemli sinyal etkileşimleri çalışmak için tüm embriyoları kullanmak gerek laboratuvarlar için yararlı olacağına inanıyorum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz herhangi bir rakip mali çıkarlarını yok.
Acknowledgments
Biz kültür tekniği ile onların yararlı tavsiye için Dr Julie Gordon ve Dr Nancy Manley teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Çocuk Glokom Vakfı ve Sharon-Stewart Aniridi Araştırma Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KnockOut DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| N-2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock: 100x |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma | A9418-50G | Stock: 100% |
| Antibiotic - Antimycotic Solution | Cellgro | 30-004-Cl | Stock: Penicillin (10,000 IU/ml); Streptomycin (10,000 µg/ml; Amphotericin (250 µg/ml) |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| Precision Incubator Unit | B.T.C. Engineering Milton Cambridge England | Id.No. 840-374 | |
| Glass Bottles for Rotating Unit | B.T.C. Engineering | ||
| Silicone Rubber Cork | B.T.C. Engineering | ||
| 95% O2/5% CO2 Cylinder | AirGas Inc. | ||
| Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Stemi SV6 Microscope | Zeiss | ||
| CO2 Water Jacketed Incubator | Forma Scientific | Model: 3110 | |
| Culture Hood | Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2 | Model: Nu-425-600 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | IsoTemp205 | |
| Weigh Balance | Mettler Toledo | AG285 | |
| Centrifuge Tube, 50 ml | Corning | 430291 | |
| Light Operating Scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Operating Sharp-Blunt Scissors | Roboz | RS-6812 | |
| Microdissecting Forceps, 4 in | Roboz | RS-5211 | |
| Microdissecting Forceps - Hudson (cWALD), 4-3/4 in | Roboz | RS-5237 | |
| Microdissecting Tweezers (5/45) | Roboz | RS-5005 | Modified - Sharp ends were made blunt |
| Microdissecting Tweezers (5) | Roboz | RS-5060 | Modified - Sharp ends were made blunt |
| Microdissecting Tweezers (55) | Roboz | RS-5063 | Modified - Sharp ends were made blunt |
| Instrument Tray | Roboz | RT-1401S | |
| Instrument Tray Lid | Roboz | RT-1401L | |
| Petri Dish-100 mm | Fisher Scientific | 087571Z | |
| Petri Dish-60 mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Petri Dish-35 mm | Fisher Scientific | 0875711YZ | |
| Filter System ( 0.22 µm Cellulose Acetate)-150 ml | Corning | 431153 | |
| Filter System (0.22 µm Cellulose Acetate)-250 ml | Corning | 430756 | |
| Filter System (0.22 µm Cellulose Acetate)-500 ml | Corning | 430758 | |
| Pipet-aid Pipettor | Drummond Scientific Co. | D57849 | |
| Serological Pipette-10 ml | VWR | 89130-898 | |
| Disposable Serological Pipette-25 ml | Corning | 4251 | |
| Transfer Pipette - 7.7 ml | Thermo Scientific | 202-20S |
References
- Behesti, H., Holt, J. K., Sowden, J. C. The level of BMP4 signaling is critical for the regulation of distinct T-box gene expression domains and growth along the dorso-ventral axis of the optic cup. BMC Dev. Biol. 6, 62 (2006).
- Gray, J., Ross, M. E. Neural tube closure in mouse whole embryo culture. J. Vis. Exp. , (2011).
- Tam, P. P. Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation. Int. J. Dev. Biol. 42, 895-902 (1998).
- Miura, S., Mishina, Y. Whole-embryo culture of E5.5 mouse embryos: development to the gastrulation stage. Genesis. 37, 38-43 (2003).
- Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
- Yokoo, T., et al. Human mesenchymal stem cells in rodent whole-embryo culture are reprogrammed to contribute to kidney tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3296-3300 (2005).
- Sadler, T. W. Culture of early somite mouse embryos during organogenesis. J. Embryol. Exp. Morphol. 49, 17-25 (1979).
- Kitchin, K. T., Ebron, M. T. Further development of rodent whole embryo culture: solvent toxicity and water insoluble compound delivery system. Toxicology. 30, 45-57 (1984).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev. Growth Different. 50, 485-497 (2008).
- Cuthbertson, R. A., Beck, F. Postimplantation whole embryo culture: a new method for studying ocular development. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 31, 1653-1656 (1990).
- New, D. A. Development of explanted rat embryos in circulating medium. J. Embryol. Exp. Morphol. 17, 513-525 (1967).
- Chung, K. C., Park, J. H., Kim, C. H., Ahn, Y. S. Tumor necrosis factor-alpha and phorbol 12-myristate 13-acetate differentially modulate cytotoxic effect of nitric oxide generated by serum deprivation in neuronal PC12 cells. J. Neurochem. 72, 1482-1488 (1999).
- Sasaoka, T., et al. Evidence for a functional role of Shc proteins in mitogenic signaling induced by insulin, insulin-like growth factor-1, and epidermal growth factor. J. Biol. Chem. 269, 13689-13694 (1994).
- Chotani, M. A., Mitra, S., Eid, A. H., Han, S. A., Flavahan, N. A. Distinct cAMP signaling pathways differentially regulate alpha2C-adrenoceptor expression: role in serum induction in human arteriolar smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, 69-76 (2005).
- Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos. Genesis. 35, 164-168 (2003).
- Gordon, J., Moore, B. A., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Serum-Free Culture of Mid-gestation Mouse Embryos: A Tool for the Study of Endoderm-Derived Organs. Methods Mol. Biol. 1092, 183-194 (2014).
- New, D. A., Cockroft, D. L. A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase. Experientia. 35, 138-140 (1979).
- Cockroft, D. L. Development in culture of rat foetuses explanted at 12.5 and 13.5 days of gestation. J. Embryol. Exp. Morphol. 29, 473-483 (1973).
- Zeeb, M., et al. Pharmacological manipulation of blood and lymphatic vascularization in ex vivo-cultured mouse embryos. Nat. Protoc. 7, 1970-1982 (2012).
- Wawersik, S., et al. BMP7 acts in murine lens placode development. Dev. Biol. 207, 176-188 (1999).
- Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens. Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).
- Greenfield, J. P., et al. Estrogen lowers Alzheimer beta-amyloid generation by stimulating trans-Golgi network vesicle biogenesis. J. Biol. Chem. 277, 12128-12136 (2002).
- Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39, 100-104 (2004).
- Kim, J. B., et al. Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4. Nature. 461, 649-643 (2009).
- Totonchi, M., et al. Feeder- and serum-free establishment and expansion of human induced pluripotent stem cells. Int. J. Dev. Biol. 54, 877-886 (2010).
