Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

كشف البصري Published: November 20, 2013 doi: 10.3791/50805
Automatic Translation
*1, *2, 1,3
1Department of Biotechnology and Food Engineering, Technion - Israel Institute of Technology, 2The Inter-Departmental Program of Biotechnology, Technion - Israel Institute of Technology, 3The Russell Berrie Nanotechnology Institute, Technion - Israel Institute of Technology
* These authors contributed equally

Summary

هو عرض وجهاز الاستشعار البيولوجي البصرية خالية من التسمية للكشف عن البكتيريا السريع. يستند جهاز الاستشعار البيولوجي على سي مسامية ذات البنية النانومترية، الذي تم تصميمه لالتقاط مباشرة الخلايا البكتيريا المستهدفة على سطحه. نستخدم الأجسام المضادة وحيدة النسيلة، يجمد على محول التي يسهل اختراقها، وتحقيقات الالتقاط. وتبين الدراسات لدينا انطباق هذه أجهزة الاستشعار للكشف عن تركيزات منخفضة البكتيرية في غضون دقائق مع عدم وجود تجهيز العينات قبل (مثل تحلل الخلية).

Abstract

تم تصميم جهاز الاستشعار البيولوجي البصرية خالية من التسمية على أساس المسامية ذات البنية النانومترية سي لالتقاط السريع والكشف عن البكتيريا القولونية K12، والكائنات الحية الدقيقة الطراز. يعتمد جهاز الاستشعار البيولوجي على الربط المباشر للخلايا البكتيريا المستهدفة على سطحه، في حين لم يكن يحتاج إلى المعالجة (مثلا عن طريق تحلل الخلية) من العينة التي شملتها الدراسة. ويستخدم سي رقيقة mesoporous كعنصر محول البصري للجهاز الاستشعار البيولوجي. تحت الضوء إضاءة بيضاء، يعرض طبقة مسامية حلها جيدا أنماط هامش فابري بيرو في الطيف انعكاسية لها. تطبيق تحويل فورييه السريع (الاتحاد الفرنسي للتنس) إلى نتائج البيانات الانعكاسية في ذروة واحدة. ويتم رصد التغيرات في كثافة الذروة الاتحاد الفرنسي للتنس. وبالتالي، والتقاط البكتيريا المستهدفة على سطح جهاز الاستشعار البيولوجي، من خلال التفاعلات مستضد الضد، يؤدي الى تغييرات قابلة للقياس في شدة قمم الاتحاد الفرنسي للتنس، والسماح ل"الوقت الحقيقي" مراقبة المرفق البكتيريا.

الإقليم الشمالي "> الفيلم سي mesoporous، ملفقة من قبل عملية طلى بأكسيد الألومنيوم الكهروكيميائية، ومترافق مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ومحددة للبكتيريا المستهدفة. وأكد الشلل، immunoactivity وخصوصية الأجسام المضادة من خلال التجارب وضع العلامات الفلورية. مرة واحدة يتعرض لها جهاز الاستشعار البيولوجي لل البكتيريا المستهدفة، ويتم التقاط الخلايا مباشرة على مسامية السطح سي تعديل الأجسام المضادة، وهذه الأحداث التقاط محددة تؤدي إلى تغيرات كثافة في الأغشية الرقيقة التدخل البصرية الطيف من جهاز الاستشعار البيولوجي. علينا أن نظهر أن هذه أجهزة الاستشعار يمكن الكشف عن البكتيريا تركيزات منخفضة نسبيا (كشف الحد من 10 4 خلية / مل) في أقل من ساعة.

Introduction

الكشف المبكر والدقيق للالبكتيريا المسببة للأمراض من المهم للغاية لسلامة الأغذية والمياه، والرصد البيئي، ونقطة من الرعاية التشخيص 1. عن تقنيات علم الأحياء المجهرية التقليدية هي مضيعة للوقت، شاقة، وتفتقر إلى القدرة على الكشف عن الكائنات الحية الدقيقة في "الوقت الحقيقي" أو خارج بيئة معملية، أجهزة الاستشعار تتطور لمواجهة هذه التحديات 2-5.

في السنوات الأخيرة، التي يسهل اختراقها سي (PSI) برز كمنصة اعدة لتصميم أجهزة الاستشعار وأجهزة الاستشعار 6-20. على مدى العقد الماضي ونشرت العديد من الدراسات حول أجهزة الاستشعار وأجهزة الاستشعار البصرية القائمة على المبادرة 21،22. ملفقة طبقة ذات البنية النانومترية PSI عادة عن طريق الكهروكيميائية النقش انوديك من واحدة من الكريستال رقاقة سيليكون. المواد النانوية الناتجة PSI يحمل العديد من الخصائص من المفيد، مثل سطح كبير وحجم الحرة، المسام الأحجام التي يمكن السيطرة عليها والانضباطي الأمثلخصائص كال 10،16. الخصائص البصرية للطبقة PSI، مثل معان ضوئي 8،11 والضوء الأبيض القائم على الانعكاس التداخل 7،19، تتأثر بشدة الظروف البيئية. القبض على ضيف التحاليل الجزيئات / الهدف ضمن نتائج طبقة مسامية في تغيير في متوسط ​​معامل الانكسار من الفيلم، يحتفل به بوصفه التشكيل في الطيف معان ضوئي أو تحولا في الطيف الموجي انعكاسية 10.

على الرغم من أن الابتكار واسعة في PSI التكنولوجيا biosensor البصرية، لا يوجد سوى عدد قليل من التقارير على منصات القائم على المبادرة للبكتيريا الكشف 6،8،20،23-29. بالإضافة إلى ذلك، فإن معظم هذه الدراسات إثبات صحة مفهوم أثبتت "غير المباشرة" الكشف عن البكتيريا. وبالتالي، هناك حاجة تحلل قبل عام من الخلايا لاستخراج شظايا بروتين / الحمض النووي المستهدف، سمة للبكتيريا درس 29. نهجنا هو الاستيلاء على البكتيريا المستهدفة مباشرةالخلايا على جهاز الاستشعار البيولوجي PSI. لذلك، يتم يجمد الاجسام المضادة، والتي هي محددة لاستهداف البكتيريا، على سطح مسامية. ملزمة للخلايا البكتيريا، عبر تفاعلات الضد مستضد، على سطح جهاز الاستشعار البيولوجي تحدث تغييرات في السعة (كثافة) من الطيف الانعكاسية 24-26.

في هذا العمل، ونحن التقرير على بناء وجهاز الاستشعار البيولوجي القائم على المبادرة البصرية وإظهار تطبيقه كمنصة biosensing خالية من التسمية للكشف عن الإشريكية القولونية (E. كولاي) K12 البكتيريا (تستخدم الكائنات الحية الدقيقة نموذج)، ورصد الإشارات الضوئية هو الضوء الذي ينعكس من البنية النانوية PSI بسبب فابري بيرو التدخل رقيقة (الشكل 1A). ترتبط التغييرات في ضوء السعة / كثافة لتجميد محددة من خلايا البكتيريا المستهدفة على سطح جهاز الاستشعار البيولوجي، مما يسمح للكشف السريع وتقدير من البكتيريا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد المؤكسدة المسامية شافي 2

  1. رقائق حفر سي (جانب واحد مصقول على <100> الوجه ومخدر بشكل كبير، ف نوع، 0.0008 Ω · سم) في 03:01 (ت / ت) حل HF مائي والإيثانول المطلق لمدة 30 ثانية في تيار مستمر الكثافة من 385 مللي أمبير / سم 2. يرجى ملاحظة أن HF هو سائل ضارة للغاية، وأنه ينبغي التعامل معها بعناية فائقة.
  2. شطف السطح من مسامية سي (PSI) الفيلم الناتج مع الايثانول المطلق عدة مرات؛ تجف الأفلام تحت غاز النيتروجين الجاف.
  3. أكسدة العينات PSI محفورا طازجة في فرن أنبوب في 800 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في الهواء المحيط (وضع العينة في الفرن في درجة حرارة الغرفة، حرارة الفرن إلى 800 درجة مئوية، ويترك في الفرن لمدة 1 ساعة، وإيقاف فرن وإزالة عينات من الفرن في درجة حرارة الغرفة فقط).

2. Biofunctionalization من PSiO 2 السقالات

  1. احتضان لبسي المؤكسد (PSIO 2) عينة لمدة 1 ساعة في mercaptopropyl (trimethoxysilane-3) 95٪ (MPTS) حل (108 ملي في التولوين).
  2. شطف PSiO 2 عينة المعالجة سيلاني مع التولوين، والميثانول، والأسيتون؛ الجافة تحت غاز النيتروجين الجاف.
  3. احتضان PSiO 2 عينة تعديل سيلاني لمدة 30 دقيقة في 1 مل من 100 ملي PEO-iodoacetyl حل البيوتين.
  4. شطف PSiO 2 عينة تعامل مع البيوتين 0.1 M الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) حل عدة مرات.
  5. احتضان PSiO 2 عينة تعديل البيوتين لمدة 30 دقيقة في 1 مل من 100 ميكروغرام / مل streptavidin (SA) حل.
  6. شطف SA المعاملة PSiO 2 عينة مع 0.1 M PBS الحل عدة مرات.
  7. احتضان SA-تعديل PSiO 2 عينة مما أدى لمدة 30 دقيقة في 1 مل من 100 ميكروغرام / مل البيروكسيديز E. القولونية وحيدة النسيلة الأجسام المضادة (الغلوبولين المناعي G، مفتش) حل أو مع 100 ميكروغرام / مل مفتش البيروكسيديز أرنب (كنموذج للالأجسام المضادة وحيدة النسيلة).

3. الفلورسنت وصفها ومضان المجهري

  1. احتضان السطوح تعديل مفتش مع 15 ميكروغرام / مل فلوريسئين (FITC) الموسومة المضادة أرنب مفتش لمدة 40 دقيقة ومع 15 ميكروغرام / مل فلوريسئين (FITC) الموسومة المضادة مفتش الماوس كمجموعة تحكم.
  2. شطف عينات تعديل مع 0.1 M PBS الحل عدة مرات.
  3. فحص العينات تحت المجهر مضان.

4. الثقافة البكتيريا

  1. زراعة E. البكتيريا القولونية K12 في أنبوب 10 مل مع 5 مل من لوريا BERTANI (LB) متوسطة (تكوين المتوسطة في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات: 5 غرام من كلوريد الصوديوم، 5 غرامات من خلاصة الخميرة، و 10 غرام من تريبتون). احتضان البكتيريا الهز بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  2. رصد تركيز البكتيريا من خلال قراءة الكثافة الضوئية (OD) في طول موجة من 600 نانومتر. بعد نمو بين عشية وضحاها في LB المتوسطة، وقراءة OD 600 باستخدام الطيف لتحديد تركيز البكتيريا. عدد الخلايا هو وخيمةctly النسبي للمقاييس OD 600 (1 OD 600 = 10 8 خلية / مل).

5. البكتيريا الاستشعار

  1. وضع PSiO تعديل مفتش-2 وأنيق PSiO 2 (كما في السيطرة) عينات في زنزانة تدفق زجاجي حسب الطلب. إصلاح الخلية التدفق لضمان أن يتم قياس العينة انعكاسية في نفس المكان خلال جميع القياسات.
  2. احتضان العينات مع E. القولونية K12 التعليق (10 4 خلية / مل) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم إزالة البكتيريا عن طريق التعليق بيغ الخلية مع 0.85٪ ث / ت محلول ملحي لمدة 30 دقيقة.
  3. رصد التغيرات في البيانات الانعكاسية في كافة مراحل التجربة. تحتاج جميع القياسات البصرية التي يتعين الاضطلاع بها في مائي المحيطة بها. وينبغي جمع الأطياف باستخدام مطياف CCD وتحليلها عن طريق تطبيق تحويل فورييه السريع (الاتحاد الفرنسي للتنس)، كما هو موضح سابقا 25،26.
  4. تأكد من وجود البكتيريا علىسطح جهاز الاستشعار البيولوجي، من خلال مراقبة العينات تحت المجهر ضوء تستقيم فورا بعد التجربة biosensing.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وتعد المبادرة المؤكسد (PSiO 2) الأفلام كما هو موضح في المقطع نص البروتوكول. يبين الشكل 1B عالية الدقة مجهرية الإلكترون المسح من الناتج الفيلم PSI بعد الأكسدة الحرارية. وتتميز طبقة PSiO 2 بواسطة المسام أسطواني واضحة المعالم التي يبلغ قطرها في حدود 30-80 نانومتر.

والمطعمة الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (مفتش) الجزيئات على أسطح PSiO 2 باستخدام تكنولوجيا silanization راسخة إلى جانب وجود نظام البيوتين-SA. ويرد مخطط تفصيلي التوليف في الشكل 2. الأولى، يتم silanized سطح أكسدة حراريا من قبل MPTS، مما أدى إلى سطح silanized ثيول (الشكل 2C). في الخطوة التالية، وحضنت سطح تفعيلها مع-SH رد الفعل جزيئات البيوتين رابط (الشكل 2D)، تليها المرفقات من SA البروتينات على سطح المعدلة البيوتين البيوتين-SA عبر الجسور (الشكل 2E). الخطوة النهائية في functionalization من سطح جهاز الاستشعار البيولوجي ينطوي على bioconjugation من الاجسام المضادة البيروكسيديز إلى (2F الشكل) SA.

يتم تأكيد الحجز على الأجسام المضادة للسطح PSiO 2 قبل وضع العلامات الفلورية تليها مراقبة سطح تحت المجهر مضان. بالإضافة إلى ذلك، الدراسات مضان تسمح لنا لتوصيف النشاط وخصوصية مستضدي من الأجسام المضادة يجمد السطح (أرنب مفتش) من خلال ربط الموسومة fluorescently مفتش المضادة للأرنب ومكافحة فأر مفتش كمجموعة تحكم. الشكل 3 يلخص نتائج هذه التجارب .

من أجل إظهار البكتيريا biosensing نحن قد استخدمت E. محددة القولونية مفتش بدلا من مفتش نموذج (أرنب مفتش). مرة أخرى، فإن هذا النهج هو لرصد التغيرات في السعة (كثافة) من الضوء المنعكس من nanostr PSiO 2ucture. خلال تجارب الاستشعار عن بعد، يتم إصلاح أجهزة الاستشعار في زنزانة تدفق من أجل ضمان أن يتم قياس العينة انعكاسية في نفس المكان خلال جميع القياسات. يتم تنفيذ التجربة بأكملها في بيئة رطبة ويتم رصد العينة انعكاسية الطيف بشكل مستمر. يتعرض أجهزة الاستشعار لE. القولونية K12 التعليق (4 10 خلية / مل) لمدة 30 دقيقة، وبعد ذلك يتم استخدام حل العازلة لغسل سطح جهاز الاستشعار البيولوجي (لإزالة البكتيريا غير مرتبط). A الطيف الاتحاد الفرنسي للتنس للجهاز الاستشعار البيولوجي قبل وبعد إدخال E. البكتيريا القولونية هو مبين (10 4 خلية / مل) في الشكل 4A (أعلى). وهكذا، بعد التعرض لE. كولاي البكتيريا (والخطوة اللاحقة الشطف) انخفاضا شدة 7 ± 1٪ ويسجل، في حين لوحظت تغييرات ضئيلة (انخفاض أقل من 0.5٪ في كثافة الاتحاد الفرنسي للتنس) لمعدلة PSiO 2 السطح (الشكل 4B، أعلى). علاوة على ذلك، في سrder لتأكيد وجود الخلايا والقبض على سطح PSiO 2، ويلاحظ أن أجهزة الاستشعار تحت المجهر الخفيفة على الفور بعد الانتهاء من التجربة biosensing. 4A الشكل (القاع) يعرض يجمد خلايا البكتيريا على سطح جهاز الاستشعار البيولوجي، في حين لم يلاحظ أي الخلايا على الأسطح غير معدلة (السيطرة)، وانظر الشكل 4B (القاع).

الشكل 1
الشكل 1 (أ) نموذجي الطيف انعكاسية نموذجي فابري بيرو PSiO 2 البنية النانوية (يسار) والطيف المقابلة بعد تحويل فورييه السريع (يمين). تتم مراقبة الموقف وضخامة ذروة واحدة الناتجة عن ذلك. (ب) مستعرضة عالية الدقة مجهرية الإلكترون المسح (ثانيةالإلكترونات ondary) من طبقة PSiO 2 (محفورا لمدة 30 ثانية في 385 مللي أمبير / سم 2).

الرقم 2
يليه الرقم 2. تمثيل تخطيطي من الخطوات لتجميع biofunctionalize سطح PSiO 2 مع الأجسام المضادة (أ) يتم استخدام حفر الكهروكيميائية انوديك لتحضير طبقة رطل من واحدة من الكريستال رقاقة سيليكون. (ب) ثم تتأكسد العينة محفورا طازجة حراريا في 800 درجة مئوية. (ج) وكان رد فعل سطح PSiO 2 في البداية مع MPTS الحرة لخلق سطح مجموعة ثيول (تفعيل PSiO 2 فيلم). (د) الحضانة من الفيلم تفعيلها مع PEO-iodoacetyl البيوتين لتوليد سطح البيروكسيديز. (ه) الحضانة من ليالي البيروكسيديزurface مع SA. (و) الحضانة من سطح تعديلها مع الأجسام المضادة البيروكسيديز. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الرقم 3
الشكل 3. نتائج التجارب مضان وضع العلامات للتأكد من النشاط وخصوصية مستضدي من مفتش يجمد. ولوحظت العينات تحت المجهر الفلورسنت في وقت التعرض المستمر. (A) bioconjugation كاملة، PSiO 2 + + MPTS البيوتين + + SA-المعقدة البيروكسيديز أرنب مفتش وFITC المضادة أرنب مفتش؛ (ب) التجربة التحكم مع FITC المضادة مفتش الماوس، (ج) تجربة السيطرة، لا مفتش، PSiO 2 + + MPTS البيوتين + SA وFITC المضادة أرنب مفتش.

ملاحظة: هذه الخطط هي لillustratأغراض أيون فقط كما الاقتران من مفتش كما يحدث داخل المسام.

الرقم 4
الشكل 4. E. القولونية التجارب biosensing وصور المجهر الضوئي المقابلة من أجهزة الاستشعار على الفور بعد التجارب. يتم تحضين مع أجهزة الاستشعار 10 4 خلية / مل E. تعليق القولونية. مفتاح: (أ) مفتش المعدلة PSiO 2، (ب) أنيق (معدلة) PSiO 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هي ملفقة وimmunosensor البصرية تسمية خالية، استنادا إلى البنية النانوية PSiO 2 (فيلم فابري بيرو رقيقة)، وتأكيد انطباق إمكاناتها بوصفها جهاز الاستشعار البيولوجي للكشف عن البكتيريا.

التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها

واحدة من الاهتمامات الرئيسية عند تصميم immunosensor هو قابلية الأجسام المضادة للتغيرات غير مرغوب فيها التشكل خلال ترسب والزخرفة على الركيزة الصلبة، مما قد يؤدي إلى انخفاض في حساسية جهاز الاستشعار البيولوجي 31،32. للحد من هذه المشكلة، ويتم إنجاز اقتران من الأجسام المضادة للسطح PSiO من 2 إلى البيوتين-SA الجسور. وتستخدم SA والبيوتين عادة في العديد من التطبيقات البيوتكنولوجية بسبب تقارب العالية ملزمة (K د ~ 10 -13 م). الرابط البيوتين-SA هي واحدة من كيمياء الأكثر شيوعا لمستقبلات الشلل تمارس في تطوير جهاز الاستشعار البيولوجي 10،32،33،34. إمكانية الوصول إلى الأجسام المضادة يجمد يمكن أن ينظم من قبل البيوتين-SA رد الفعل الذي يوفر الربط مرنة بين سطح صلب والجماعات الحكومية الدولية 31،35. وبالتالي، فإن PSiO 2 وbiofunctionalized الأولى مع البيوتين / SA للسماح للاقتران الأضداد البيروكسيديز على البنية النانوية.

القيود المفروضة على تقنية

وتعزى القيود الرئيسية لهذا المخطط biosensing إلى الأجسام المضادة استخدام كعنصر التقاط البكتيريا. كما هو الحال مع immunosensors أخرى، ونحن تقتصر على الكشف عن الأهداف التي لديها أجسام مضادة المتاحة، وخصوصية الأجسام المضادة المستخدمة واستقرارها 36. نوع من الأجسام المضادة لاستخدامها يعتمد على التطبيق وكلما محددة ويفضل الاجسام المضادة ممكن. حتى الآن، وعلى الرغم من درجة عالية من الدقة التي توفر الاجسام المضادة، والكشف عن البكتيريا الخلايا بأكملها أدناه 1،000 خلية / مل لا تزال تمثل تحديا35. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن تؤخذ في التكلفة الباهظة في إنتاج هذه الأجسام المضادة في الاعتبار.

ويرتبط الحد آخر مع الاستقرار الكيميائي للمحول PSI المؤكسدة في بيئات تآكل / مائي. وعلى الرغم من استقرار PSiO 2 متفوقة بالمقارنة مع الأفلام PSI رقيقة، لا يزال عند إجراء طويلة (عدة ساعات) التجارب تدفق الانجرافات خط الأساس يمكن ملاحظة 14،15،21،24. علاوة على ذلك، يفضل أن تغلب على الحموضة محايد (في حدود 6-8) من أجل منع عدم الاستقرار الميكانيكي للالبنية النانوية.

بالطبع أن عند التعامل مع الطعام أو الماء عينات حقيقية، والتي تكون ملوثة بالبكتيريا، عملية المعالجة المناسبة لابد من النظر إلى الخطوة السابقة الاستشعار عن بعد. وينبغي تصميم والمعالجة وفق الخصائص المحددة للعينة المدروسة. على سبيل المثال، إجراءات إعداد مثل التشتت، والترشيح، ودرجة الحموضة باانس، وما إلى ذلك، يمكن النظر. ومع ذلك، هذه التقنيات المعالجة هي خارج نطاق هذا العمل.

أهمية فيما يتعلق بأساليب القائمة

حتى الآن، وكشف وتحديد التلوث الجرثومي تعتمد أساسا على تقنيات علم الأحياء المجهرية زراعة الكلاسيكية أو على التقنيات السريعة في علم الأحياء المجهرية، مثل مجموعات البيوكيميائية، ELISA (انزيم مرتبط الفحص المناعي)، وPCR (تفاعل البلمرة) المقايسات 2،3. هذه الأساليب هي شاقة، ومضيعة للوقت تتطلب عدة أيام للحصول على نتائج، وبالتالي'' في الوقت الحقيقي لتقييم'' المياه وسلامة الأغذية لا تزال غير مجدية 2،4،5. في العمل الحالي، علينا أن نظهر قدرة هذه الأجهزة على أساس المبادرة إلى التغلب على عيوب هذه التقنيات. وجهاز الاستشعار البيولوجي الحالي يسمح لكشف بسيطة وحساسة نسبيا من البكتيريا عبر نهج'' مباشرة'' الخلية القبض، من خلال رصد التغيرات في المرجع لتلك الواقعة على الدولة التدخل الطيف. لدينا عرض النتائج الأولية حد اكتشاف انخفاض 10 4 خلية / مل E. القولونية وزمن استجابة سريع لعدة دقائق. للمقارنة، والحد من الكشف الحالي للدولة من بين الفن مأكل سطح الرنين (SPR) أجهزة الاستشعار هو في حدود 10 -10 2 6 خلية / مل 37-40. من حيث زمن الاستجابة، وأجهزة الاستشعار ردنا على التعرض البكتيريا هي مماثلة لتلك التقنيات SPR. وبالتالي، فإن نقاط القوة الرئيسية لهذا المخطط biosensing هي بساطة الفحص والكشف السريع مما يتيح ل "الوقت الحقيقي" التعرف على البكتيريا المستهدفة.

التطبيقات المستقبلية

ويجري حاليا استكشاف العديد من الطرق لتحسين حد الكشف وحساسية جهاز الاستشعار البيولوجي، بما في ذلك الاستفادة المثلى من تركيز الأجسام المضادة والتوجه، استخدم شظايا الأجسام المضادة بدلا من الأجسام المضادة كله. بالإضافة إلى ذلك، نحن ندرس إمكانات ملائمةamers وتحقيقات التقاط البديلة. في الختام، فإن العمل المقدمة هنا يوفر منبرا biosensing العامة التي يمكن ترجمتها إلى العديد من التطبيقات biosensing من مجموعة متنوعة من الكائنات الحية الدقيقة.

الخطوات الحاسمة في البروتوكول

من أجل تحقيق الأداء الأمثل للجهاز الاستشعار البيولوجي، من المهم للغاية للتأكد من biofunctionalization من السقالات PSiO 2 (انظر القسم 3 في النص البروتوكول، الفلورسنت وصفها والإسفار الميكروسكوب). الدراسات مضان تسمح لنا لتأكيد الحجز على أجسام مضادة للمحول (PSiO 2) السطح، وتميز النشاط وخصوصية مستضدي من الأجسام المضادة المرفقة، من خلال ربط الموسومة fluorescently مفتش المضادة للأرنب ومكافحة فأر مفتش كعنصر تحكم .

علاوة على ذلك، من أجل القضاء على نتائج خاطئة في قراءات البصرية، فمن الضروري لشطف صحيح سطح جهاز الاستشعار البيولوجي exposu التاليةإعادة للبكتيريا المستهدفة (لإزالة خلايا البكتيريا التي لا بد nonspecifically أو الموجودة على السطح) وإجراء التجارب التحكم مع مرتبة PSiO 2. أهمية التجربة السيطرة هو للقضاء على البكتيريا غير محددة الامتزاز على سطح جهاز الاستشعار البيولوجي (انظر القسم 5 في نص البروتوكول، البكتيريا الاستشعار عن بعد).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم اسرائيل (منحة رقم 1118-1108 ومنحة رقم 1146/12) وصندوق البحوث التذكارية كرول مينا. ES بامتنان بدعم مالي من معهد روسيل Berrie تقنية النانو.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Si wafer Siltronix Corp. Highly-B-doped, p-type, 0.0008 Ω-cm resistivity, <100> oriented
Aqueous HF (48%) Merck 101513
Ethanol absolute Merck 818760
PBS buffer solution (pH 7.4) prepared by dissolving 50 mM Na2HPO4, 17 mM NaH2PO4, and 68 mM NaCl in Milli-Q water (18.2 MΩ)
Saline 0.85% w/v prepared by dissolving 0.85 g NaCl in 100 ml Milli-Q water (18.2 MΩ)
95% (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane (MPTS) Sigma Aldrich Chemicals 175617
PEO-iodoacetyl biotin Sigma Aldrich Chemicals B2059
Streptavidin (SA) Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 016-000-114
Fluorescein (DTAF)-streptavidin Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 016-010-084
Biotinylated-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 011-060-003
Fluorescently tagged anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 111-095-003
Fluorescently tagged anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 115-095-003
Biotinylated E. coli antibody Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 1007
E. coli (K-12) was generously supplied by Prof. Sima Yaron, Technion

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Velusamy, V., et al. An overview of foodborne pathogen detection: In the perspective of biosensors. Biotechnol. Adv. 28 (2), 232-23 (2010).
  2. Food Microbiol.: Fundamentals and Front. Doyle, M. P., Beuchat, L. R., Montville, T. J. 2, ASM Press. Washington. (2001).
  3. Radke, S. M., Alocilja, E. C. A microfabricated biosensor for detecting foodborne bioterrorism agents. IEEE Sens. J. 5 (4), 744 (2005).
  4. Glynn, B., et al. Current and emerging molecular diagnostic technologies applicable to bacterial food safety. Int. J. of Dairy Technol. 59 (2), 126 (2006).
  5. Leonard, P., et al. Advances in biosensors for detection of pathogens in food and water. Enzyme Microb. Technol. 32 (1), 3 (2003).
  6. Alvarez, S. D., et al. Using a porous silicon photonic crystal for bacterial cell-based biosensing. Physica Status Solidi a-Applications and Materials Science. 204 (5), 1439 (2007).
  7. Archer, M., et al. Electrical porous silicon microarray for DNA hybridization detection. Micro- and Nanosystems. 782, 385 (2004).
  8. Chan, S., Horner, S. R., Fauchet, P. M., Miller, B. L. Identification of Gram Negative Bacteria Using Nanoscale Silicon Microcavities. J. Am. Chem. Soc. 123, 11797 (2001).
  9. Dancil, K. -P. S., Greiner, D. P., Sailor, M. J. Development of a Porous Silicon Based Biosensor. Canham, L. T., Sailor, M. J., Tanaka, K., Tsai, C. C. Proceedings of the Mat. Res. Soc. Symp, Boston, MA, 536, 557-562 (1999).
  10. D'Auria, S., et al. Nanostructured silicon-based biosensors for the selective identification of analytes of social interest. J Phys - Condens Matter. 18 (33), S2019 (2006).
  11. de Leon, S. B., et al. Neurons culturing and biophotonic sensing using porous silicon. Appl Phys Lett. 84 (22), 4361 (2004).
  12. Janshoff, A., et al. Macroporous p-type silicon Fabry-Perot layers. Fabrication, characterization, and applications in biosensing. J. Am. Chem. Soc. 120 (46), 12108 (1998).
  13. Orosco, M. M., Pacholski, C., Miskelly, G. M., Sailor, M. J. Protein-coated porous silicon photonic crystals for amplified optical detection of protease activity. Adv. Mater. 18, 1393 (2006).
  14. Pacholski, C., et al. Biosensing using porous silicon double-layer interferometers: reflective interferometric Fourier transform spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 127 (33), 11636 (2005).
  15. Pacholski, C., et al. Reflective Interferometric Fourier Transform Spectroscopy: A Self-Compensating Label-Free Immunosensor Using Double-layers of Porous SiO2. J. Am. Chem. Soc. 128, 4250 (2006).
  16. Sailor, M. J., Link, J. R. Smart Dust: nanostructured devices in a grain of sand. Chem. Comm. , 1375 (2005).
  17. Schwartz, M. P., Alvarez, S. D., Sailor, M. J. Porous SiO2 interferometric biosensor for quantitative determination of protein interactions: Binding of protein a to immunoglobulins derived from different species. Anal. Chem. 79 (1), 327 (2007).
  18. Schwartz, M. ichaelP., et al. The smart petri dish: A nanostructured photonic crystal for real-time monitoring of living cells. Langmuir. 22, 7084 (2006).
  19. Stewart, M. P., Buriak, J. M. Chemical and biological applications of porous silicon technology. Adv. Mater. 12 (12), 859 (2000).
  20. Zhang, D., Alocilja, E. C. Characterization of nanoporous silicon-based DNA biosensor for the detection of Salmonella enteritidis. IEEE Sens J. 8 (5-6), 775 (2008).
  21. Bonanno, L. M., Segal, E. Nanostructured porous silicon-polymer-based hybrids: from biosensing to drug delivery. Nanomedicine. 6 (10), 1755 (2011).
  22. Jane, A., Dronov, R., Hodges, A., Voelcker, N. H. Porous silicon biosensors on the advance. Trends Biotechnol. 27 (4), 230 (2009).
  23. Li, S., Huang, J., Cai, L. A porous silicon optical microcavity for sensitive bacteria detection. Nanotechnology. 22 (42), 425502 (2011).
  24. Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Segal, E. Nano Bio-Technology for Biomedical and Diagnostics Research. Zahavy, E., Ordentlich, A., Yitzhaki, S., Shafferman, A. 733, Springer. Netherlands. (2012).
  25. Massad-Ivanir, N., et al. Engineering Nanostructured Porous SiO2 Surfaces for Bacteria Detection via "Direct Cell Capture". Anal. Chem. 83 (9), 3282-32 (2011).
  26. Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Zeidman, T., Segal, E. Construction and characterization of porous SiO2/hydrogel hybrids as optical biosensors for rapid detection of bacteria. Adv Funct Mater. 20 (14), 2269-22 (2010).
  27. Mathew, F. P., Alocilja, E. C. Porous silicon-based biosensor for pathogen detection. Biosens. Bioelectron. 20 (8), 1656 (2005).
  28. Ouyang, H., Archer, M., Fauchet, P. M. Frontiers in Surface Nanophotonics. 133, 49 (2007).
  29. Ouyang, H., DeLouise, L. A., Miller, B. L., Fauchet, P. M. Label-free quantitative detection of protein using macroporous silicon photonic bandgap biosensors. Anal. Chem. 79 (4), 1502-15 (2007).
  30. Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. , 1st, Academic Press. (1996).
  31. Piervincenzi, R. T., Reichert, W. M., Hellinga, H. W. Genetic engineering of a single-chain antibody fragment for surface immobilization in an optical biosensor. Biosensors and Bioelectronics. 13 (3-4), 305 (1998).
  32. Saerens, D., Huang, L., Bonroy, K., Muyldermans, S. Antibody Fragments as Probe in Biosensor Development. Sensors. 8 (8), 4669 (2008).
  33. Shtenberg, G., et al. Picking up the Pieces: A Generic Porous Si Biosensor for Probing the Proteolytic Products of Enzymes. Anal. Chem. 85 (3), 1951 (2013).
  34. Bonanno, L. M., DeLouise, L. A. Steric Crowding Effects on Target Detection in an Affinity Biosensor. Langmuir. 23 (10), 5817 (2007).
  35. Banada, P. P., Bhunia, A. K. Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. Mohammed, E., Zourob, S., Turner, A. P. F. , Springer. 567 (2008).
  36. Poma, A., Whitcombe, M., Piletsky, S. Designing receptores for the next generation of biosensors. Whitcombe, M. J., Piletsky, S. A. , Springer. 105 (2013).
  37. Dudak, F. C., Boyaci, I. H. Development of an immunosensor based on surface plasmon resonance for enumeration of Escherichia coli in water samples. Food Res. Int. 40 (7), 803 (2007).
  38. Dudak, F. C., Boyaci, I. H. Rapid and label-free bacteria detection by surface plasmon resonance (SPR) biosensors. Biotechn J. 4 (7), 1003 (2009).
  39. Skottrup, P. D., Nicolaisen, M., Justesen, A. F. Towards on-site pathogen detection using antibody-based sensors. Biosens. Bioelectron. 24 (3), 339 (2008).
  40. Taylor, A. D., Ladd, J., Homola, J., Jiang, S. Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. , Springer. 83 (2008).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 81، والكيمياء التحليلية، ومواد السيليكون، علم الأحياء المجهرية، المواد البصرية، المسامية سي، biosensor البصرية، والكشف عن البكتيريا، وخالية من التسمية جهاز الاستشعار البيولوجي، البنية النانوية،
كشف البصري<em&gt; E. القولونية</em&gt; البكتيريا عن طريق أجهزة الاستشعار السيليكون Mesoporous
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G.,… More

Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Segal, E. Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors. J. Vis. Exp. (81), e50805, doi:10.3791/50805 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter