Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

זיהוי אופטי של Published: November 20, 2013 doi: 10.3791/50805
Automatic Translation
*1, *2, 1,3
1Department of Biotechnology and Food Engineering, Technion - Israel Institute of Technology, 2The Inter-Departmental Program of Biotechnology, Technion - Israel Institute of Technology, 3The Russell Berrie Nanotechnology Institute, Technion - Israel Institute of Technology
* These authors contributed equally

Summary

Biosensor אופטי ללא תווית לזיהוי חיידקים מהירים הוא הציג. Biosensor מבוסס על Si הנקבובי nanostructured, שנועד ללכוד באופן ישיר את תאי חיידקי היעד על פני השטח שלו. אנו משתמשים בנוגדנים חד שבטיים, משותקים על המתמר הנקבובי, כמו הבדיקות ללכוד. המחקרים שלנו מראים את הישימות של biosensors אלה לצורך זיהוי של ריכוזי חיידקים נמוכים תוך דקות ללא עיבוד לפני מדגם (כגון תמוגה תא).

Abstract

Biosensor אופטי ללא תווית המבוסס על Si הנקבובי nanostructured מיועד ללכידה וזיהוי מהירים של חיידקי Escherichia coli K12, כמיקרואורגניזם מודל. Biosensor מסתמך על כריכה ישירה של תאי חיידקי היעד על פני השטח שלו, בעוד שאף טיפול מקדים (למשל על ידי תמוגה תא) של המדגם למד נדרשת. סרט דק Si mesoporous משמש כאלמנט מתמר האופטי של biosensor. תחת תאורת אור לבנה, השכבה נקבובית מציגה דפוסי שוליים פברי פרו-נפתרו היטב בספקטרום רפלקטיביות שלה. החלת Fast Fourier Transform (FFT) לתוצאות נתוני רפלקטיביות בשיא אחד. שינויים בעוצמת שיא FFT נמצאים תחת פיקוח. לפיכך, חיידקי היעד ללכוד על גבי משטח biosensor, דרך אינטראקציות נוגדן אנטיגן, גורם לשינויים מדידים באינטנסיביות של פסגות FFT, המאפשרים תצפית "בזמן אמת" של קובץ מצורף חיידקים.

NT "> סרט Si mesoporous, מיוצר על ידי תהליך anodization אלקטרוכימיים, הוא מצומדת עם נוגדנים חד שבטיים, ספציפיים לחיידקי היעד. חוסר התנועה, immunoactivity והספציפיות של הנוגדנים אושר על ידי ניסויי תיוג ניאון. רגע biosensor חשוף ל חיידקי יעד, התאים שנתפסו ישירות על גבי משטח Si הנקבובי-הותאם נוגדן. אירועי לכידה ספציפיים אלה לגרום לשינויים בעוצמה בספקטרום ההפרעות אופטיות סרט דק של biosensor. אנו מדגימים כי biosensors אלה יכולים לזהות ריכוזי חיידקים נמוכים יחסית (זיהוי מגבלה של 10 4 תאים / מיליליטר) בפחות משעה.

Introduction

מוקדם ומדויק זיהוי של חיידקים פתוגניים הוא חשוב ביותר עבור מזון ובטיחות מים, ניטור סביבתי, ואבחון נקודה של טיפול 1. כמו טכניקות מיקרוביולוגיה מסורתיות הן זמן רב, מייגע, ואין להם את היכולת לזהות מיקרואורגניזמים ב" בזמן אמת ", או מחוץ לסביבת המעבדה, biosensors מתפתח כדי לעמוד באתגרים אלה 2-5.

בשנים האחרונות, סי נקבובית (PSI) התפתחה כפלטפורמה מבטיחה לעיצוב של חיישנים וbiosensors 6-20. בעשור האחרון מחקרים רבים בנוגע לחיישנים אופטיים המבוסס על PSI וbiosensors פורסמו 21,22. שכבת PSI nanostructured היא מפוברק בדרך כלל על ידי תחריט anodic אלקטרוכימיים מSi רקיק יחיד גביש. ננו PSI כתוצאה תערוכה רבים מאפייני יתרון, כגון פנים גדול ונפח חופשי, להתעמק בגדלים שניתן לשלוט וopti מתכונןמאפייני קאל 10,16. התכונות אופטיות של שכבת PSI, כגון photoluminescence 8,11 ואינטרפרומטריה מבוססת החזרה אור הלבן 7,19, מושפעות במידה רבה על ידי תנאים סביבתיים. לכידתו של analytes מולקולות / יעד אורחים בתוך תוצאות השכבה נקבוביות בשינוי במקדם השבירה הממוצעת של הסרט, כפי שנצפה אפנון בספקטרום photoluminescence או כשינוי באורך גל בספקטרום רפלקטיביות 10.

למרות החדשנות העצומה בתחום טכנולוגית biosensor האופטי PSI, יש רק כמה דיווחים על פלטפורמות מבוססות PSI לגילוי חיידקים 6,8,20,23-29. בנוסף, רוב מחקרי הוכחה של קונספט אלה הוכיחו זיהוי "עקיף" חיידקים. לכן, בדרך כלל תמוגה המוקדמת של התאים נדרשת כדי לחלץ את שברי החלבון / DNA הממוקד, אופייניים לחיידקים למדו 29. הגישה שלנו היא ללכוד ישירות חיידקי היעדתאים על גבי biosensor PSI. לפיכך, נוגדנים חד שבטיים, שהם ספציפיים כדי למקד חיידקים, הם משותקים על פני השטח הנקבובי. כריכה של תאי חיידקים, דרך אינטראקציות נוגדן אנטיגן, על פני השטח של biosensor לגרום לשינויים באמפליטודה (עוצמה) של ספקטרום רפלקטיביות 24-26.

בעבודה זו, אנו מדווחים על הבנייה של biosensor מבוסס PSI אופטי ולהדגים היישום שלה כפלטפורמת biosensing ללא תווית לזיהוי של Escherichia coli (E. coli) חיידקי K12 (המשמשים כמודל מיקרואורגניזם). פיקוח אות אופטי הוא האור מוחזר מnanostructure psi עקב ההפרעה פברי פרו-סרט דק (איור 1 א). שינויים במשרעת / עוצמת האור מתואמים לקיבוע מסוים של תאי חיידקי היעד על גבי משטח biosensor, המאפשרים איתור וכימות של החיידקים מהירים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת החמצון הנקבובי SiO 2

  1. הוופלים לחרוט סי (צד אחד מלוטש ב< 100> פנים ומסוממים בכבדות, מסוג p, 0.0008 Ω · ס"מ) בתמיסה 03:01 (V / V) של HF מימיים ואתנול מוחלט ל30 שניות בזרם קבוע צפיפות של 385 mA / 2 סנטימטר. שים לב שHF הוא נוזל מאכל מאוד, וזה צריך להיות מטופל בזהירות רבה.
  2. יש לשטוף את פני השטח של סרט סי (PSI) הנקבובי וכתוצאה מכך עם אתנול מוחלט מספר פעמים; לייבש את הסרטים תחת גז חנקן יבש.
  3. חמצן דגימות PSI הטרי החרוטות בתנור צינור ב800 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 באוויר הסביבה (למקם את המדגם בתנור בטמפרטורת חדר, לחמם את התנור ל800 מעלות צלזיוס, להשאיר בתנור במשך שעה 1, כבה את תנור ולהסיר את הדגימות מהתנור רק בטמפרטורת חדר).

2. Biofunctionalization של 2 פיגומים PSiO

  1. דגירה PSI חמצון (PSIO 2 מדגם) במשך שעה 1 בmercaptopropyl (פתרון trimethoxysilane-3) 95% (MPTS) (108 מ"מ בטולואן).
  2. יש לשטוף את מדגם PSiO 2 שטופלו silane עם טולואן, מתנול, אצטון ו; יבש מתחת לגז חנקן יבש.
  3. דגירה מדגם PSiO 2-הותאם silane ל30 דקות ב 1 מיליליטר של 100 פתרון ביוטין PEO-iodoacetyl מ"מ.
  4. יש לשטוף את מדגם PSiO 2 שטופלו ביוטין עם 0.1 פוספט M שנאגרו פתרון (PBS) מספר פעמים.
  5. דגירה מדגם PSiO 2-הותאם ביוטין ל30 דקות ב 1 מיליליטר של מיקרוגרם / מיליליטר streptavidin פתרון 100 (SA).
  6. יש לשטוף את המדגם שטופל ב-SA PSiO 2 עם 0.1 פתרון M PBS מספר פעמים.
  7. דגירה PSiO 2 מדגם הותאם-SA וכתוצאה מכך ל30 דקות ב 1 מיליליטר של 100 מיקרוגרם / ה biotinylated מיליליטר פתרון נוגדן חד שבטי coli (אימונוגלובולין G, IgG) או עם 100 מיקרוגרם / IgG biotinylated ארנב מיליליטר (כמודל לנוגדנים חד שבטיים).

3. תיוג פלורסנט ומיקרוסקופ פלואורסצנטי

  1. דגירה המשטחים שונה-IgG עם 15 מיקרוגרם / מיליליטר והעמסת (FITC) מתויג ארנב IgG נגד ל40 דקות ועם 15 מיקרוגרם / מיליליטר והעמסת (FITC) מתויג IgG עכבר אנטי כביקורת.
  2. יש לשטוף את הדגימות שונה עם 0.1 פתרון M PBS מספר פעמים.
  3. לבחון את הדגימות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

4. תרבות חיידקים

  1. לטפח E. חיידקי coli K12 בצינור 10 מיליליטר עם 5 מיליליטר של לוריא Bertani בינוני (LB) (הרכב בינוני ב1 ליטר של מים deionized: 5 גרם של NaCl, 5 גרם של תמצית שמרים, ו10 גרם של tryptone). דגירה החיידקים רועדים לילה בשעה 37 ° C.
  2. לנטר את ריכוז חיידקים על ידי קריאת הצפיפות האופטית (OD) באורך גל של 600 ננומטר. לאחר צמיחת הלילה במדיום LB, קרא את OD 600 באמצעות ספקטרופוטומטר כדי לקבוע את ריכוז החיידקים. מספר התאים הוא קשהctly פרופורציונאלי לOD 600 מדידות (OD 1 600 = 10 8 תאים / מיליליטר).

5. חיידקי חישה

  1. הנח את PSiO הותאם-IgG 2 ומסודרים PSiO 2 (כמו השליטה) דגימות בתא זרימת פרספקס בהזמנה אישית. תקן את תא הזרימה כדי להבטיח שרפלקטיביות המדגם נמדדה באותה הנקודה במשך כל המדידות.
  2. דגירה הדגימות עם א ' ההשעיה coli K12 (10 4 תאים / מיליליטר) ל30 דקות בטמפרטורת חדר. ואז להסיר את ההשעיה חיידקים על ידי שטיפת התא עם 0.85% w / תמיסת מלח v ל30 דקות.
  3. לעקוב אחר השינויים בנתונים רפלקטיביות לאורך כל הניסוי. כל המדידות אופטיות צריכה להתבצע במימי שמסביב. ספקטרום צריך להיות שנאסף באמצעות ספקטרומטר CCD ונותח על ידי יישום Fast Fourier Transform (FFT), כפי שתואר 25,26 בעבר.
  4. לאשר את קיומו של החיידקים עלמשטח biosensor, על ידי תצפית של הדגימות תחת מיקרוסקופ אור זקופה מייד לאחר ניסוי biosensing.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

סרטי PSI חמצון (PSiO 2) מוכנים כפי שתוארו בסעיף טקסט הפרוטוקול. 1B איור מראה מיקרוסקופ אלקטרונים סורק ברזולוציה גבוהה של סרט PSI וכתוצאה מכך לאחר חמצון תרמי. PSiO 2 השכבה מאופיינת בנקבוביות גליליות מוגדרות היטב בקוטר בטווח של 30-80 ננומטר.

מולקולות הנוגדן חד שבטי (IgG) הם מורכבים על PSiO 2 משטחים באמצעות טכנולוגית silanization מבוססת היטב בשילוב עם מערכת ביוטין-SA. ערכת הסינתזה מפורטת מתוארת באיור 2. ראשית, על פני השטח חמצון תרמי הוא silanized ידי MPTS, וכתוצאה ממשטח silanized תיאול (איור 2 ג). בשלב הבא, את פני השטח הופעל הוא הודגרו עם מולקולות SH-reactive מקשר ביוטין (איור 2), ואחרי קובץ מצורף של חלבוני SA אל פני השטח, שונה ביוטין באמצעות גשרים ביוטין-SA (2E איור). השלב האחרון בfunctionalization של פני השטח biosensor כרוך bioconjugation של נוגדנים חד שבטיים biotinylated ל( 2f איור) SA.

ההתקשרות של הנוגדנים על פני השטח PSiO 2 אושר על ידי תיוג ניאון ואחרי התבוננות במשטח תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בנוסף, מחקרי הקרינה יאפשר לנו לאפיין את הפעילות וספציפיות אנטיגני של הנוגדנים משותקי פני השטח (ארנב IgG) על ידי קשירה של מתויג fluorescently IgG נגד ארנב ואנטי עכבר IgG כביקורת. איור 3 מסכם את התוצאות של ניסויים אלה .

כדי להמחיש biosensing חיידקים השתמשנו E. ספציפי coli IgG במקום IgG המודל (ארנב IgG). שוב, הגישה היא לעקוב אחר השינויים באמפליטודה (עוצמה) של האור מוחזר מnanostr PSiO 2ucture. במהלך ניסויי החישה, biosensors הם קבועים בתא זרימה על מנת להבטיח שרפלקטיביות המדגם נמדדה באותה הנקודה במשך כל המדידות. כל הניסוי מתבצע בסביבה רטובה ודגימת ספקטרום רפלקטיביות מנוטר באופן רציף. Biosensors נחשפים לE. ההשעיה coli K12 (10 4 תאים / מיליליטר) ל30 דקות, לאחר שפתרון חיץ משמש לשטיפת פני שטח biosensor (להסרת חיידקים פנויים). FFT ספקטרום של biosensor לפני ואחרי כניסתה של א ' חיידקי קולי (10 4 תאים / מיליליטר) מוצגים בתרשים 4 א (למעלה). לפיכך, החשיפה לE. הבאה חיידקי קולי (וצעד שטיפה לאחר מכן) ירידה בעוצמה של 7 ± 1% נרשמות, ואילו שינויים לא משמעותיים (ירידה של פחות מ 0.5% בעוצמת FFT) הם נצפו לPSiO 2 המשטח ללא שינוי (איור 4 ב, למעלה). יתר על כן, בorder כדי לאשר את קיומם של תאים שנתפסו על גבי משטח PSiO 2, biosensors הם נצפו תחת מיקרוסקופ אור מייד לאחר השלמת ניסוי biosensing. איור 4 א מציג (תחתון) משותק תאי חיידקים על פני השטח biosensor, בעוד שאין תאים הם נצפו על פני השטח ללא שינוי (ביקורת), וראה איור 4 ב (תחתון).

איור 1
איור 1. () ספקטרום אופייני של רפלקטיביות nanostructure טיפוסי פברי פרו-PSiO 2 (משמאל) והספקטרום המקביל הבא Fast Fourier Transform (מימין). המיקום וסדר הגודל של שיא אחד וכתוצאה מכך נמצאים תחת פיקוח. (ב) מיקרוסקופ אלקטרונים סורק ברזולוציה גבוהה חתך (שניותאלקטרונים ondary) של שכבת PSiO 2 (חרוטה עבור 30 שניות ב385 mA / 2 סנטימטר).

איור 2
איור 2. ייצוג סכמטי של שלבי הסינתזה אחריו כדי biofunctionalize משטח PSiO 2 עם נוגדנים. () לחרוט אלקטרוכימיים anodic משמש להכנת שכבת PSI מSi רקיק יחיד גביש. (ב) המדגם הטרי החרוט מכן חמצון תרמי ב800 ° C. (ג) PSiO 2 המשטח תחילה הגיב בMPTS כדי ליצור משטח קבוצת תיאול בחינם (PSiO 2 סרט יופעל). (ד) דגירה של הסרט מופעל עם ביוטין PEO-iodoacetyl כדי ליצור משטח biotinylated. דגירה (ה) של biotinylatedurface עם SA. (ו) דגירה של פני השטח שונה עם נוגדני biotinylated. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

איור 3
איור 3. תוצאות של ניסויי תיוג הקרינה כדי לאשר את הפעילות וספציפיות אנטיגני של IgG המשותק. הדגימות הם נצפו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בזמן חשיפה מתמיד. () Bioconjugation השלם, PSiO 2 + MPTS + ביוטין + SA + biotinylated ארנב-IgG וFITC אנטי ארנב IgG; (ב ') ניסוי שליטה עם FITC אנטי IgG עכבר; ניסוי בקרה (C), לא IgG, PSiO 2 + + MPTS יוטין + SA וFITC אנטי IgG ארנב.

הערה: שרטוטים אלה לillustratמטרות יון רק כנטייה של IgG מתרחשת גם בתוך הנקבוביות.

איור 4
איור 4. E. ניסויי biosensing coli ותמונות מיקרוסקופ אופטי מקביל biosensors מייד לאחר הניסויים. biosensors מודגרת עם 10 4 תאים / מיליליטר E. השעיות coli. מפתח: (א) IgG-הותאם PSiO 2, (ב) המסודר PSiO (ללא שינוי) 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Immunosensor אופטי ללא תווית, המבוסס על nanostructure PSiO 2 (סרט דק פברי פרו-) הוא מפוברק, ותחולתה הפוטנציאלית כbiosensor לגילוי חיידקים הוא אישרה.

שינויים ופתרון בעיות

אחד החששות הגדולים בעת תכנון immunosensor הוא הרגישות של נוגדנים לעבור שינויי קונפורמציה לא רצויים במהלך בתצהיר ודפוסים על גבי המצע המוצק, דבר שעלול להוביל לירידה ברגישות biosensor 31,32. כדי למזער את הבעיה, נטיה של הנוגדנים על פני השטח PSiO 2 נעשה באמצעות גשרים ביוטין-SA. SA וביוטין משמשים בדרך כלל ביישומים רבים בתחום הביוטכנולוגיה בשל זיקתם הגבוהה מחייבת (ד K ~ 10 -13 M). הקישור ביוטין-SA הוא אחד מהתהליכים הכימיים הנפוצים ביותר לחוסר תנועת קולטן התאמן בפיתוח biosensor 10,32,33,34. הנגישות של הנוגדנים משותקים יכולה להיות מוסדרת על ידי התגובה ביוטין-SA שמספקת הצמדה גמישה בין המשטח המוצק וIgGs 31,35. לפיכך, PSiO 2 biofunctionalized ראשון עם ביוטין / SA לאפשר נטיה של נוגדני biotinylated על nanostructure.

מגבלות של הטכניקה

המגבלות העיקריות של תכנית biosensing זו מיוחסות לנוגדני השימוש כאלמנט ללכוד חיידקים. כהוא עם immunosensors אחר, אנו מוגבלים לזיהוי של מטרות שיש נוגדנים זמינים, את הספציפיות של הנוגדנים המשמשים ויציבותם 36. הסוג של נוגדנים לשימוש תלוי ביישום הספציפי ובכל פעם נוגדנים חד שבטיים אפשריים עדיפים. עם זאת, למרות הרמה הגבוהה של ייחוד כי נוגדנים חד שבטיים לספק, זיהוי של תאי חיידקים כולה מתחת 1,000 תאים / מיליליטר הוא עדיין אתגר35. בנוסף, העלות הגבוהה הכרוכה בייצור של נוגדנים אלה צריכה להילקח בחשבון.

מגבלה נוספת קשורה ביציבות כימית של מתמר PSI מתחמצן בסביבות מימיות / מאכלת. אמנם, יציבות PSiO 2 היא מעולה בהשוואה לסרטים דקים PSI, עדיין בעת ביצוע ארוך (כמה שעות) אפשר לראות ערימות בסיס ניסויי זרימה 14,15,21,24. יתר על כן, זה הוא מועדף על מנת לעקוף את ה-pH הניטרלי (בטווח של 6-8) על מנת למנוע חוסר יציבות מכאנית של nanostructure.

כמובן שכאשר מדוברים בדגימות מזון או מים אמיתיים, שהם מזוהמים בחיידקים, תהליך טיפול מקדים מתאים יש לשקול לפני צעד החישה. לפני הטיפול צריך להיות מתוכנן בהתאם למאפיינים הספציפיים של מדגם למד. לדוגמא, הליכי הכנה כגון פיזור, סינון, ba-pHלאנס, וכו ', יכול להיחשב. עם זאת, טכניקות הטיפול המקדים אלה הן מעבר להיקף של עבודה זו.

משמעות ביחס לשיטות קיימות

נכון להיום, גילוי וזיהוי של זיהומים חיידקיים מסתמכים בעיקר על טכניקות culturing מיקרוביולוגיה קלאסיות או בטכניקות מהירה במיקרוביולוגיה, כגון ערכות ביוכימיים, ELISA (assay immunosorbent צמוד אנזים), וה-PCR (תגובת שרשרת פולימרז) מבחני 2,3. שיטות אלה הן מייגע, זמן רב דורשים כמה ימים עד לקבלת תוצאות, ובכך'' בזמן אמת הערכה'' מים ובטיחות מזון יישאר 2,4,5 ישים. בעבודה הנוכחית, אנחנו מדגימים את היכולת של biosensors מבוסס PSI כדי להתגבר על החסרונות של טכניקות אלה. Biosensor ההווה מאפשר זיהוי פשוט ורגיש יחסית של חיידקים באמצעות גישה הישירה התא'' לכידת'', על ידי מעקב אחר שינויים באופ שלהספקטרום ההפרעה tical. התוצאות הראשוניות שלנו להציג את גבול גילוי נמוך של 10 4 תאים / מיליליטר E. coli וזמן תגובה מהיר של מספר דקות. לשם השוואה, את גבול הגילוי של התהודה Plasmon המשטח הנוכחית מדינה-of-the-art biosensors (SPR) הוא בטווח של 10 2 -10 6 תאים / מיליליטר 37-40. במונחים של זמן תגובה, תגובת biosensors לחשיפת חיידקים דומה לזו של טכניקות SPR. לפיכך, את נקודות החוזק העיקריות של תכנית biosensing זה הם הפשטות של assay ואיתור מהיר המאפשר זיהוי "בזמן אמת" של חיידקי היעד.

יישומים עתידיים

כמה גישות כרגע נבדקות כדי לשפר את גבול הגילוי ורגישות של biosensor, כולל אופטימיזציה של ריכוז הנוגדנים ונטייה, השתמשו ברי נוגדנים במקום כל נוגדנים. בנוסף, אנו לומדים את הפוטנציאל של דירהamers כמו בדיקות ללכוד חלופיות. לסיכום, העבודה שהוצגה כאן מספקת פלטפורמת biosensing כללית שיכול להיות מתורגמת ליישומי biosensing רבים של מגוון רחב של מיקרואורגניזמים.

שלבים קריטיים בפרוטוקול

על מנת להשיג ביצועים אופטימליים של biosensor, חשוב מאוד על מנת לאשר את biofunctionalization של PSiO 2 פיגומים (ראה סעיף 3 בטקסט הפרוטוקול, תיוג פלורסנט ומיקרוסקופ פלואורסצנטי). מחקרי הקרינה יאפשר לנו לאשר את צירופה של הנוגדנים למתמר (PSiO 2) פני השטח ולאפיין את הפעילות וספציפיות אנטיגני של הנוגדנים המצורפים, באמצעות קשירה של מתויג fluorescently IgG נגד ארנב ואנטי עכבר IgG כביקורת .

יתר על כן, על מנת למנוע תוצאות שגויות בצג האופטי, זה חיוני כדי לשטוף את פני השטח של exposu הבא biosensor כראוימחדש לחיידקי היעד (להסרת של חיידקים בתאים הnonspecifically מאוגדים או מתגוררים על פני השטח) ולבצע ניסויי שליטה עם PSiO המסודר 2. חשיבותו של ניסוי הבקרה היא לחיסול של ספיחת חיידקים נוקבת על פני השטח biosensor (ראה סעיף 5 בטקסט הפרוטוקול, חיידקי חישה).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (מענק מס 1118-1108 ומענק מס 1146-1112) ומינה קרול זיכרון קרן המחקר. ES מכיר בהכרת תודה על התמיכה הכספית של ראסל ברי למכון.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Si wafer Siltronix Corp. Highly-B-doped, p-type, 0.0008 Ω-cm resistivity, <100> oriented
Aqueous HF (48%) Merck 101513
Ethanol absolute Merck 818760
PBS buffer solution (pH 7.4) prepared by dissolving 50 mM Na2HPO4, 17 mM NaH2PO4, and 68 mM NaCl in Milli-Q water (18.2 MΩ)
Saline 0.85% w/v prepared by dissolving 0.85 g NaCl in 100 ml Milli-Q water (18.2 MΩ)
95% (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane (MPTS) Sigma Aldrich Chemicals 175617
PEO-iodoacetyl biotin Sigma Aldrich Chemicals B2059
Streptavidin (SA) Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 016-000-114
Fluorescein (DTAF)-streptavidin Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 016-010-084
Biotinylated-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 011-060-003
Fluorescently tagged anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 111-095-003
Fluorescently tagged anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 115-095-003
Biotinylated E. coli antibody Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 1007
E. coli (K-12) was generously supplied by Prof. Sima Yaron, Technion

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Velusamy, V., et al. An overview of foodborne pathogen detection: In the perspective of biosensors. Biotechnol. Adv. 28 (2), 232-23 (2010).
  2. Food Microbiol.: Fundamentals and Front. Doyle, M. P., Beuchat, L. R., Montville, T. J. 2, ASM Press. Washington. (2001).
  3. Radke, S. M., Alocilja, E. C. A microfabricated biosensor for detecting foodborne bioterrorism agents. IEEE Sens. J. 5 (4), 744 (2005).
  4. Glynn, B., et al. Current and emerging molecular diagnostic technologies applicable to bacterial food safety. Int. J. of Dairy Technol. 59 (2), 126 (2006).
  5. Leonard, P., et al. Advances in biosensors for detection of pathogens in food and water. Enzyme Microb. Technol. 32 (1), 3 (2003).
  6. Alvarez, S. D., et al. Using a porous silicon photonic crystal for bacterial cell-based biosensing. Physica Status Solidi a-Applications and Materials Science. 204 (5), 1439 (2007).
  7. Archer, M., et al. Electrical porous silicon microarray for DNA hybridization detection. Micro- and Nanosystems. 782, 385 (2004).
  8. Chan, S., Horner, S. R., Fauchet, P. M., Miller, B. L. Identification of Gram Negative Bacteria Using Nanoscale Silicon Microcavities. J. Am. Chem. Soc. 123, 11797 (2001).
  9. Dancil, K. -P. S., Greiner, D. P., Sailor, M. J. Development of a Porous Silicon Based Biosensor. Canham, L. T., Sailor, M. J., Tanaka, K., Tsai, C. C. Proceedings of the Mat. Res. Soc. Symp, Boston, MA, 536, 557-562 (1999).
  10. D'Auria, S., et al. Nanostructured silicon-based biosensors for the selective identification of analytes of social interest. J Phys - Condens Matter. 18 (33), S2019 (2006).
  11. de Leon, S. B., et al. Neurons culturing and biophotonic sensing using porous silicon. Appl Phys Lett. 84 (22), 4361 (2004).
  12. Janshoff, A., et al. Macroporous p-type silicon Fabry-Perot layers. Fabrication, characterization, and applications in biosensing. J. Am. Chem. Soc. 120 (46), 12108 (1998).
  13. Orosco, M. M., Pacholski, C., Miskelly, G. M., Sailor, M. J. Protein-coated porous silicon photonic crystals for amplified optical detection of protease activity. Adv. Mater. 18, 1393 (2006).
  14. Pacholski, C., et al. Biosensing using porous silicon double-layer interferometers: reflective interferometric Fourier transform spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 127 (33), 11636 (2005).
  15. Pacholski, C., et al. Reflective Interferometric Fourier Transform Spectroscopy: A Self-Compensating Label-Free Immunosensor Using Double-layers of Porous SiO2. J. Am. Chem. Soc. 128, 4250 (2006).
  16. Sailor, M. J., Link, J. R. Smart Dust: nanostructured devices in a grain of sand. Chem. Comm. , 1375 (2005).
  17. Schwartz, M. P., Alvarez, S. D., Sailor, M. J. Porous SiO2 interferometric biosensor for quantitative determination of protein interactions: Binding of protein a to immunoglobulins derived from different species. Anal. Chem. 79 (1), 327 (2007).
  18. Schwartz, M. ichaelP., et al. The smart petri dish: A nanostructured photonic crystal for real-time monitoring of living cells. Langmuir. 22, 7084 (2006).
  19. Stewart, M. P., Buriak, J. M. Chemical and biological applications of porous silicon technology. Adv. Mater. 12 (12), 859 (2000).
  20. Zhang, D., Alocilja, E. C. Characterization of nanoporous silicon-based DNA biosensor for the detection of Salmonella enteritidis. IEEE Sens J. 8 (5-6), 775 (2008).
  21. Bonanno, L. M., Segal, E. Nanostructured porous silicon-polymer-based hybrids: from biosensing to drug delivery. Nanomedicine. 6 (10), 1755 (2011).
  22. Jane, A., Dronov, R., Hodges, A., Voelcker, N. H. Porous silicon biosensors on the advance. Trends Biotechnol. 27 (4), 230 (2009).
  23. Li, S., Huang, J., Cai, L. A porous silicon optical microcavity for sensitive bacteria detection. Nanotechnology. 22 (42), 425502 (2011).
  24. Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Segal, E. Nano Bio-Technology for Biomedical and Diagnostics Research. Zahavy, E., Ordentlich, A., Yitzhaki, S., Shafferman, A. 733, Springer. Netherlands. (2012).
  25. Massad-Ivanir, N., et al. Engineering Nanostructured Porous SiO2 Surfaces for Bacteria Detection via "Direct Cell Capture". Anal. Chem. 83 (9), 3282-32 (2011).
  26. Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Zeidman, T., Segal, E. Construction and characterization of porous SiO2/hydrogel hybrids as optical biosensors for rapid detection of bacteria. Adv Funct Mater. 20 (14), 2269-22 (2010).
  27. Mathew, F. P., Alocilja, E. C. Porous silicon-based biosensor for pathogen detection. Biosens. Bioelectron. 20 (8), 1656 (2005).
  28. Ouyang, H., Archer, M., Fauchet, P. M. Frontiers in Surface Nanophotonics. 133, 49 (2007).
  29. Ouyang, H., DeLouise, L. A., Miller, B. L., Fauchet, P. M. Label-free quantitative detection of protein using macroporous silicon photonic bandgap biosensors. Anal. Chem. 79 (4), 1502-15 (2007).
  30. Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. , 1st, Academic Press. (1996).
  31. Piervincenzi, R. T., Reichert, W. M., Hellinga, H. W. Genetic engineering of a single-chain antibody fragment for surface immobilization in an optical biosensor. Biosensors and Bioelectronics. 13 (3-4), 305 (1998).
  32. Saerens, D., Huang, L., Bonroy, K., Muyldermans, S. Antibody Fragments as Probe in Biosensor Development. Sensors. 8 (8), 4669 (2008).
  33. Shtenberg, G., et al. Picking up the Pieces: A Generic Porous Si Biosensor for Probing the Proteolytic Products of Enzymes. Anal. Chem. 85 (3), 1951 (2013).
  34. Bonanno, L. M., DeLouise, L. A. Steric Crowding Effects on Target Detection in an Affinity Biosensor. Langmuir. 23 (10), 5817 (2007).
  35. Banada, P. P., Bhunia, A. K. Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. Mohammed, E., Zourob, S., Turner, A. P. F. , Springer. 567 (2008).
  36. Poma, A., Whitcombe, M., Piletsky, S. Designing receptores for the next generation of biosensors. Whitcombe, M. J., Piletsky, S. A. , Springer. 105 (2013).
  37. Dudak, F. C., Boyaci, I. H. Development of an immunosensor based on surface plasmon resonance for enumeration of Escherichia coli in water samples. Food Res. Int. 40 (7), 803 (2007).
  38. Dudak, F. C., Boyaci, I. H. Rapid and label-free bacteria detection by surface plasmon resonance (SPR) biosensors. Biotechn J. 4 (7), 1003 (2009).
  39. Skottrup, P. D., Nicolaisen, M., Justesen, A. F. Towards on-site pathogen detection using antibody-based sensors. Biosens. Bioelectron. 24 (3), 339 (2008).
  40. Taylor, A. D., Ladd, J., Homola, J., Jiang, S. Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. , Springer. 83 (2008).

Tags

הנדסה ביוטכנולוגיה כימיה אנליטית חומרי סיליקון מיקרוביולוגיה חומרים אופטיים גיליון 81 הנקבובי Si biosensor האופטי זיהוי חיידקים biosensor ללא תווית nanostructure,
זיהוי אופטי של<em&gt; א coli</em&gt; חיידקים על ידי Biosensors הסיליקון Mesoporous
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G.,… More

Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Segal, E. Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors. J. Vis. Exp. (81), e50805, doi:10.3791/50805 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter