Summary
Un biocapteur optique sans étiquette pour la détection de bactéries rapides est introduit. Le biocapteur est basé sur un silicium poreux nanostructuré, qui est conçu pour capter directement les cellules des bactéries cibles sur sa surface. Nous utilisons des anticorps monoclonaux, immobilisés sur le transducteur poreux, comme les sondes de capture. Nos études démontrent l'applicabilité de ces biocapteurs pour la détection de concentrations bactériennes faibles en quelques minutes sans traitement préalable de l'échantillon (telle que la lyse cellulaire).
Abstract
Un biocapteur optique sans étiquette basée sur une nanostructure poreuse de Si est conçu pour la saisie rapide et la détection de bactéries Escherichia coli K12, comme un micro-organisme du modèle. Le biocapteur repose sur la liaison directe des cellules des bactéries cibles sur sa surface, tandis qu'aucun traitement préalable (par exemple par lyse cellulaire) de l'échantillon étudié est nécessaire. Un film mince de Si mésoporeux est utilisé comme élément de capteur optique du biocapteur. Sous éclairage en lumière blanche, la couche poreuse affiche motifs de franges de Fabry-Pérot bien résolus dans le spectre de réflectivité. En appliquant une transformée de Fourier rapide (FFT) pour les résultats des données de réflectivité dans un seul pic. Les variations de l'intensité du pic FFT sont surveillés. Ainsi, les bactéries cibles capturer sur la surface du biocapteur, par des interactions anticorps-antigène, induit des changements mesurables dans l'intensité des pics de la FFT, permettant une observation «en temps réel» de l'attachement de bactéries.
nt "> Le film de Si mésoporeux, fabriqué par un procédé d'anodisation électrochimique, est conjugué avec des anticorps monoclonaux, spécifiques de la bactérie cible. L'immobilisation, immunoactivité et la spécificité des anticorps sont confirmées par des expériences de marquage par fluorescence. Une fois que le capteur biologique est exposée à l' bactéries cibles, les cellules sont directement capturés sur la surface de Si poreux anticorps modifié. Ces événements de capture spécifiques entraînent des changements d'intensité dans le film mince spectre du biocapteur optique interférentiel. Nous démontrons que ces biocapteurs peuvent détecter des concentrations relativement faibles de bactéries (détection limite de 10 4 cellules / ml) en moins d'une heure.Introduction
Précoce et précise l'identification des bactéries pathogènes est extrêmement important pour la sécurité alimentaire et de l'eau, surveillance de l'environnement, et le point-of-care diagnostic 1. Les techniques traditionnelles de microbiologie sont longues, laborieuses, et n'ont pas la capacité de détecter des micro-organismes en "temps réel" ou à l'extérieur de l'environnement de laboratoire, les biocapteurs évoluent pour répondre à ces défis 2-5.
Au cours des dernières années, le Si poreux (PSI) a émergé comme une plate-forme prometteuse pour la conception de capteurs et biocapteurs 6-20. Cours de la dernière décennie, de nombreuses études concernant les capteurs et biocapteurs optiques à base de PSI-ont été publiés 21,22. La couche nanostructurée PSi est typiquement fabriqué par gravure électrochimique anodique à partir d'un monocristal de Si plaquette. Les nanomatériaux PSi obtenus présentent de nombreuses caractéristiques avantageuses, comme une grande surface et le volume libre, tailles de pores qui peuvent être contrôlés et accordable optipropriétés cal 10,16. Les propriétés optiques de la couche de PSi, comme photoluminescence 8,11 et lumière blanche interférométrie à base de réflectance 7,19, sont fortement influencées par les conditions environnementales. Capture d'analytes voyageurs molécules / cible à l'intérieur des résultats de couches poreuses à une variation de l'indice de réfraction moyen de la pellicule, comme une modulation observée dans le spectre de photoluminescence ou sous forme de décalage de longueur d'onde dans le spectre de réflectivité 10.
Bien que la grande innovation dans la technologie des biocapteurs optiques PSi, il n'y a que peu de rapports sur les plates-formes à base de PSI-pour la détection de bactéries 6,8,20,23-29. En outre, la plupart de ces études de preuve de concept ont démontré «indirecte» de détection des bactéries. Ainsi, en général, avant la lyse des cellules est nécessaire pour extraire les fragments de protéine / ADN ciblés, caractéristiques de la bactérie étudiée 29. Notre approche consiste à saisir directement les bactéries ciblescellules sur le biocapteur psi. Par conséquent, les anticorps monoclonaux, qui sont spécifiques à une cible, les bactéries, sont immobilisés sur la surface poreuse. La liaison de cellules de bactéries, par l'intermédiaire d'interactions anticorps-antigène, à la surface du biocapteur induire des changements dans l'amplitude (intensité) du spectre de réflectivité de 24 à 26.
Dans ce travail, nous rapportons sur la construction d'un biocapteur à base de PSI-optique et de démontrer son application comme les biocapteurs plate-forme sans étiquette pour la détection d'Escherichia coli (E. coli) K12 (utilisées comme un micro-organisme modèle). L'surveillés le signal optique est de la lumière réfléchie à partir de la nanostructure PSi raison de Fabry-Pérot mince film interférence (Figure 1A). Les variations de l'amplitude / intensité de la lumière sont corrélés à l'immobilisation spécifique des cellules des bactéries cibles sur la surface du biocapteur, permettant une détection rapide et une quantification des bactéries.
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Protocol
Une. Préparation du oxydé poreux SiO 2
- Plaquettes Etch Si (un seul côté brillant sur la <100> visage et fortement dopée, de type p, 0,0008 Ω · cm) dans une solution 3:1 (v / v) de solution aqueuse de HF et d'éthanol absolu pendant 30 secondes à un courant constant densité de 385 mA / cm 2. S'il vous plaît noter que HF est un liquide très corrosif, et il doit être manipulé avec un soin extrême.
- Rincer la surface du Si poreux (PSi) film résultant avec de l'éthanol absolu à plusieurs reprises; sécher les films sous un gaz d'azote sec.
- Oxyder les échantillons PSi fraîchement gravé dans un four tubulaire à 800 ° C pendant 1 h dans l'air ambiant (placer l'échantillon dans le four à la température ambiante, chauffer le four à 800 ° C, laisser dans le four pendant 1 heure, éteignez le la chaudière et retirer les échantillons du four seulement à la température ambiante).
2. Biofonctionnalisation de Psio 2 échafaudages
- Incuber un PSi oxydé (PSIO 2) l'échantillon pendant 1 heure dans mercaptopropyl (95% (MPTS) solution de triméthoxysilane-3) (108 mM dans du toluène).
- Rincer le Psio 2 échantillon traité au silane avec du toluène, le méthanol et l'acétone; sec sous un gaz d'azote sec.
- Incuber la Psio 2 échantillon de silane modifié pendant 30 min dans 1 ml de solution 100 mM PEO-iodoacétyle biotine.
- Rincer le Psio 2 Extrait biotine traités avec 0,1 M de tampon phosphate salin (PBS) de solution à plusieurs reprises.
- Incuber l'échantillon 2 Psio biotine modifiée pendant 30 min dans 1 ml de pg / ml de streptavidine (SA) solution 100.
- Rincer le SA-traité Psio 2 échantillon avec une solution 0,1 M PBS plusieurs fois.
- Incuber l'échantillon SA-modifié Psio 2 résultant pendant 30 min dans 1 ml de 100 pg / ml biotinylé E. Anticorps monoclonal coli (immunoglobuline G, IgG) ou avec une solution de 100 ug / ml d'IgG de lapin biotinylé (comme un modèle pour un anticorps monoclonal).
3. Marquage fluorescent et microscopie de fluorescence
- Incuber les surfaces IgG modifiés avec 15 ug / ml de fluorescéine (FITC) marqué d'anti IgG de lapin pendant 40 min et à 15 ug / ml de fluorescéine (FITC) marqué IgG anti-souris comme témoin.
- Rincer les échantillons modifiés avec 0,1 M de solution PBS à plusieurs reprises.
- Examiner les échantillons sous un microscope à fluorescence.
4. Culture de bactéries
- Cultiver E. bactéries coli K12 dans un tube de 10 ml avec 5 ml de milieu Luria Bertani (LB) (moyenne composition dans 1 litre d'eau désionisée: 5 g de NaCl, 5 g d'extrait de levure et 10 g de tryptone). Incuber les bactéries secouant la nuit à 37 ° C.
- Surveiller la concentration des bactéries par la lecture de la densité optique (DO) à une longueur d'onde de 600 nm. Après croissance pendant une nuit dans du milieu LB, lire la DO600 en utilisant un spectrophotomètre pour déterminer la concentration bactérienne. Le nombre de cellules est désastreusecte proportionnelles aux mesures (OD 600 DO 600 = 1 10 8 cellules / ml).
5. Les bactéries de détection
- Placez le Psio IgG-2 modifié et soigné Psio 2 (comme le contrôle) des échantillons dans une cellule d'écoulement en plexiglas sur mesure. Fixer la cellule d'écoulement pour s'assurer que l'échantillon réflectivité est mesurée au même endroit au cours de toutes les mesures.
- Incuber les échantillons avec E. coli K12 suspension (10 4 cellules / ml) pendant 30 min à température ambiante. Ensuite, retirer la suspension de bactéries par rinçage de la cellule avec 0,85% p / solution saline v pendant 30 min.
- Surveiller les changements dans les données de réflectivité dans l'ensemble de l'expérience. Toutes les mesures optiques doivent être effectués dans un milieu aqueux environnant. Spectra devrait être recueilli en utilisant un spectromètre CCD et analysée par application d'une transformée de Fourier rapide (FFT), comme décrit précédemment 25,26.
- Confirmer la présence de la bactérie sur lasurface du biocapteur, par l'observation des échantillons sous un microscope optique verticale immédiatement après l'expérience de biocapteurs.
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Representative Results
PSi oxydée (2) Psio films sont préparés comme décrit dans la section du texte protocole. Figure 1B montre une micrographie électronique à balayage à haute résolution de la pellicule de PSi obtenu après oxydation thermique. La couche Psio 2 est caractérisé par des pores cylindriques bien définis ayant un diamètre dans la gamme de 30 à 80 nm.
L'anticorps monoclonal (IgG) molécules sont greffées sur les Psio deux surfaces à l'aide d'une technologie de silanisation bien établie couplé à un système biotine-SA. Le schéma de synthèse est décrit en détail dans la figure 2. Tout d'abord, la surface oxydée thermiquement est silanisée par MPTS, résultant en une surface de thiol-silanisée (figure 2c). Dans l'étape suivante, la surface activée est incubée avec un SH-réactif biotine molécules linker (figure 2d), suivie par la fixation de protéines à la surface SA de la biotine modifiée par l'intermédiaire de ponts biotine-SA
La fixation des anticorps sur la surface Psio 2 est confirmée par un marquage fluorescent, suivie par l'observation de la surface sous un microscope à fluorescence. En outre, les études de fluorescence permettent de caractériser l'activité et de la spécificité antigénique des anticorps de surface immobilisé (IgG de lapin) par la liaison de fluorescence étiquetée IgG anti-lapin et anti-IgG de souris comme témoin. Figure 3 résume les résultats de ces expériences .
Afin de démontrer les bactéries biocapteurs, nous avons utilisé un E. spécifique coli IgG à la place de l'IgG de modèle (IgG de lapin). Encore une fois, l'approche consiste à suivre l'évolution de l'amplitude (intensité) de la lumière réfléchie à partir de la Psio 2 nanostructure. Lors des expériences de détection, les biocapteurs sont fixés dans une cellule d'écoulement afin d'assurer que l'échantillon est la réflectivité mesurée à la même place pendant toutes les mesures. L'expérience entière est réalisée dans un environnement humide et le spectre de réflectivité de l'échantillon est surveillée en continu. Les biocapteurs sont exposées à E. coli K12 suspension (10 4 cellules / ml) pendant 30 min, après quoi, une solution tampon est utilisée pour le lavage de la surface du biocapteur (pour l'élimination des bactéries seules). Un spectre FFT du biocapteur avant et après l'introduction de l'E. colibacilles (10 4 cellules / ml) est représenté sur la figure 4a (en haut). Ainsi, après l'exposition à E. coli bactéries (et étape de rinçage ultérieur) une diminution de l'intensité de 7 ± 1% est enregistrée, tandis que les changements insignifiants (moins de 0,5% de diminution de l'intensité de la FFT) sont observées pour le non modifiée Psio 2 surface (figure 4b, en haut). En outre, dans de l'order pour confirmer la présence de cellules capturées sur la surface Psio 2, les biocapteurs sont observées sous un microscope optique immédiatement après la fin de l'expérience de biodétection. figure 4a (bas) affiche immobilisées cellules de bactéries sur la surface du biocapteur, tandis qu'aucune des cellules sont observées sur les surfaces non modifiées (de contrôle); voir la figure 4b (en bas).
Figure 1. (A) spectre de réflectivité typique d'un type Fabry-Pérot Psio 2 nanostructure (à gauche) et le spectre correspondant suite à une transformée de Fourier rapide (à droite). La position et l'ampleur du seul pic résultant sont surveillés. (B) Une micrographie électronique à balayage à haute résolution en coupe transversale (secdaire électrons) d'une couche Psio 2 (gravé pendant 30 secondes à 385 mA / cm 2).
Figure 2. Représentation schématique des étapes de synthèse suivie de biofunctionalize la surface Psio 2 avec des anticorps. (A) Une gravure électrochimique anodique est utilisée pour préparer une couche de PSi à partir d'un monocristal de Si plaquette. (B) L'échantillon fraîchement gravé est alors oxydé thermiquement à 800 ° C. (C) La surface Psio 2 est d'abord mis à réagir avec MPTS pour créer gratuitement surface de groupement thiol (activé Psio 2 du film). (D) incubation du film activé avec POE-iodoacétyle biotine pour générer surface biotinylé. (E) incubation des s biotinylésurface avec SA. (F) l'incubation de la surface modifiée avec des anticorps biotinylés. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 3. Résultats des expériences de marquage par fluorescence pour confirmer l'activité et la spécificité antigénique de l'IgG immobilisée. Les échantillons sont observés au microscope à fluorescence à un temps d'exposition constant. (A) bioconjugaison complète, Psio 2 + MPTS + biotine + SA + biotinylé lapin IgG et FITC-anti-lapin IgG; (B) expérience de contrôle avec FITC-anti-IgG de souris; (C) expérience de contrôle, sans IgG, Psio 2 + + MPTS biotine + SA et FITC-anti IgG de lapin.
Note: Ces schémas sont pour illustratdes fins d'ions seulement que la conjugaison d'IgG se produit également à l'intérieur des pores.
Figure 4. E. coli expériences de biocapteurs et des images au microscope optique correspondantes des biocapteurs immédiatement après les expériences. Les biocapteurs sont incubées avec 10 4 cellules / ml E. suspensions coli. Légende: (a) IgG modifié Psio 2, (b) propre (non modifié) Psio 2.
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Discussion
Un immunocapteur optique sans étiquette, sur la base d'un Psio 2 nanostructure (un film mince de Fabry-Pérot) est fabriqué, et son application potentielle comme un biocapteur pour la détection de bactéries est confirmée.
Modifications et dépannage
L'une des préoccupations majeures lors de la conception d'un immunocapteur est la sensibilité des anticorps à subir des changements de conformation non souhaitées pendant le dépôt et la structuration sur le substrat solide, ce qui peut conduire à une diminution de la sensibilité du biocapteur 31,32. Pour minimiser ce problème, la conjugaison des anticorps à la surface Psio 2 est réalisé par des ponts biotine-SA. SA et la biotine sont couramment utilisés dans de nombreuses applications biotechnologiques, en raison de leur forte affinité de liaison (Kd ~ 10 -13 M). La liaison de la biotine-SA est l'une des compositions chimiques les plus courants pour l'immobilisation du récepteur pratiqué dans le développement de biocapteurs 10,32,33,34. L'accessibilité des anticorps immobilisés peut être régulée par la réaction biotine-SA qui assure une liaison souple entre la surface solide et l'IgG 31,35. Ainsi, la Psio 2 est d'abord biofonctionnalisé avec de la biotine / SA pour permettre la conjugaison d'anticorps biotinylés sur la nanostructure.
Limites de la technique
Les principales limites de ce système de biocapteurs sont attribués aux anticorps de l'utilisation que l'élément bactéries de capture. Comme avec les autres est immunocapteurs, nous sommes limités à la détection de cibles qui ont des anticorps disponibles, la spécificité des anticorps utilisés et de leur stabilité 36. Le type d'anticorps doit être utilisé dépend de l'application et à chaque fois que des anticorps monoclonaux spécifiques possibles sont préférés. Pourtant, malgré le haut degré de spécificité que les anticorps monoclonaux permettent la détection de cellules bactériennes entières dessous de 1000 cellules / ml est toujours un défi35. De plus, le coût élevé impliqué dans la production de ces anticorps doit être pris en considération.
Une autre limitation est associée à une stabilité chimique du transducteur de PSi oxydé dans des environnements corrosifs / aqueuses. Bien que la stabilité Psio 2 est supérieure en comparaison à des films minces PSi, toujours lors de la conduite de long (plusieurs heures) des expériences d'écoulement dérives de référence peuvent être observées 14,15,21,24. De plus, elle est favorisée pour contourner pH neutre (de l'ordre de 8.6), afin d'éviter une instabilité mécanique de la nanostructure.
Bien sûr, que lorsqu'il s'agit d'échantillons d'aliments ou d'eau réels, qui sont contaminés par des bactéries, un processus de pré-traitement approprié doit être considérée avant l'étape de détection. Le prétraitement doit être conçu conformément aux caractéristiques spécifiques de l'échantillon étudié. Par exemple, les procédures de préparation comme la dispersion, la filtration, le pH balance, etc, pourrait être envisagée. Cependant, ces techniques de prétraitement sont au-delà de la portée de ce travail.
Importance par rapport aux méthodes existantes
À ce jour, la détection et l'identification des contaminations bactériennes reposent essentiellement sur des techniques de microbiologie de culture classiques ou sur les techniques rapides de microbiologie, tels que des kits biochimiques, ELISA (dosage immuno-enzymatique), et la PCR (réaction en chaîne de la polymérase) dosages 2,3. Ces méthodes sont laborieuses, de temps et nécessitent plusieurs jours pour obtenir des résultats, ainsi'' temps réel'' évaluation de l'eau et la sécurité alimentaire reste 2,4,5 irréalisable. Dans le présent travail, nous démontrons la capacité de biocapteurs à base de PSI pour surmonter les inconvénients de ces techniques. La présente biocapteur permet une détection simple et relativement sensibles de bactéries via une approche'' directe'' cellule capture, par le suivi des changements dans son optique spectre d'interférence. Nos résultats préliminaires montrent une faible limite de détection de 10 4 cellules / ml E. coli et un temps de réponse rapide de plusieurs minutes. A titre de comparaison, la limite de détection de la résonance état actuel de l'art plasmonique de surface (SPR) biocapteurs est de l'ordre de 10 2 -10 6 cellules / ml 37-40. En termes de temps de réponse, notre réponse de biocapteurs à l'exposition des bactéries est comparable à celle des techniques SPR. Ainsi, les principaux points forts de ce programme de biocapteurs sont la simplicité de l'analyse et de détection rapide permettant l'identification "en temps réel" des bactéries cibles.
Les applications futures
Plusieurs approches sont actuellement explorées pour améliorer la limite de détection et la sensibilité du capteur biologique, notamment l'optimisation de la concentration et l'orientation des anticorps, en utilisant des fragments d'anticorps plutôt que des anticorps entiers. De plus, nous étudions la possibilité d'aptamers que des sondes de capture alternatives. En conclusion, le travail présenté ici fournit une plate-forme de biodétection générique qui peut être traduit pour de nombreuses applications de biocapteurs d'une variété de micro-organismes.
Les étapes critiques dans le protocole
Pour obtenir des performances optimales du biocapteur, il est très important de confirmer la biofonctionnalisation des Psio 2 échafaudages (voir l'article 3 dans le texte du protocole, Marquage fluorescent et microscopie de fluorescence). Les études de fluorescence permettent de confirmer la fixation des anticorps sur le transducteur (Psio 2) de surface et de caractériser l'activité et la spécificité antigénique des anticorps fixés, par la liaison de fluorescence taggés IgG anti-lapin et IgG anti-souris comme témoin .
De plus, afin d'éliminer des résultats erronés dans la lecture optique, il est essentiel de bien rincer la surface du biocapteur suivant exposure pour les bactéries cibles (pour l'élimination des cellules bactériennes qui sont liés de manière non spécifique ou résident sur la surface) et de mener des expériences de contrôle avec soignée Psio 2. L'importance de l'expérience de contrôle est pour l'élimination de la non spécifique adsorption de bactéries sur la surface du biocapteur (voir l'article 5 dans le texte du protocole, les bactéries de détection).
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Disclosures
Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Fondation sciences Israël (subvention n ° 1118-1108 et n ° subvention 1146-1112) et le Fonds de recherche Memorial Kroll Minna. ES reconnaît avec gratitude le soutien financier de la Berrie Nanotechnology Institute Russell.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Si wafer | Siltronix Corp. | Highly-B-doped, p-type, 0.0008 Ω-cm resistivity, <100> oriented | |
| Aqueous HF (48%) | Merck | 101513 | |
| Ethanol absolute | Merck | 818760 | |
| PBS buffer solution (pH 7.4) | prepared by dissolving 50 mM Na2HPO4, 17 mM NaH2PO4, and 68 mM NaCl in Milli-Q water (18.2 MΩ) | ||
| Saline 0.85% w/v | prepared by dissolving 0.85 g NaCl in 100 ml Milli-Q water (18.2 MΩ) | ||
| 95% (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane (MPTS) | Sigma Aldrich Chemicals | 175617 | |
| PEO-iodoacetyl biotin | Sigma Aldrich Chemicals | B2059 | |
| Streptavidin (SA) | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 016-000-114 | |
| Fluorescein (DTAF)-streptavidin | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 016-010-084 | |
| Biotinylated-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 011-060-003 | |
| Fluorescently tagged anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 111-095-003 | |
| Fluorescently tagged anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 115-095-003 | |
| Biotinylated E. coli antibody | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 1007 | |
| E. coli (K-12) | was generously supplied by Prof. Sima Yaron, Technion |
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