Summary
Viene introdotto un biosensore ottico privo di etichetta per il rilevamento di batteri rapidi. Il biosensore è basato su poroso nanostrutturato Si, che è stato progettato per catturare direttamente le cellule dei batteri bersaglio sulla sua superficie. Usiamo anticorpi monoclonali, immobilizzati sul trasduttore poroso, come le sonde di cattura. I nostri studi dimostrano l'applicabilità di questi biosensori per il rilevamento di concentrazioni batteriche basse in pochi minuti, senza trasformazione campione prima (come lisi cellulare).
Abstract
Un biosensore ottico privo di etichetta basato su un poroso nanostrutturato Si è progettato per acquisizione rapida e rilevamento di batteri Escherichia coli K12, come modello microrganismo. Il biosensore deduce legame diretto delle cellule dei batteri bersaglio sulla sua superficie, mentre non è necessario alcun pretrattamento (ad esempio mediante lisi cellulare) del campione studiato. Un film sottile mesoporosi Si è utilizzato come elemento trasduttore ottico del biosensore. Sotto illuminazione a luce bianca, lo strato poroso mostra ben risolti, i modelli frange Fabry-Perot nel suo spettro di riflessione. L'applicazione di una trasformata veloce di Fourier (FFT) per i risultati dei dati di riflettività in un unico picco. Variazioni dell'intensità del picco FFT sono monitorati. Così, batteri bersaglio catturare sulla superficie biosensore, attraverso interazioni anticorpo-antigene, induce cambiamenti misurabili nell'intensità dei picchi FFT, consentendo un osservazione 'tempo reale' di attaccamento batteri.
nt "> Il film di Si mesoporosi, fabbricato da un processo di anodizzazione elettrochimica, è coniugato con anticorpi monoclonali, specifici per i batteri bersaglio. L'immobilizzazione, immunoactivity e specificità degli anticorpi sono confermati da esperimenti di marcatura fluorescente. Dopo il biosensore è esposto al batteri bersaglio, le cellule sono direttamente catturati sulla superficie porosa Si anticorpi modificati. Questi eventi di cattura specifici producono variazioni di intensità del film sottile spettro interferenza ottico del biosensore. Abbiamo dimostrato che questi biosensori possono rilevare relativamente basse concentrazioni batteriche (rilevamento limite di 10 4 cellule / ml) in meno di un'ora.Introduction
Precoce ed accurata identificazione di batteri patogeni è estremamente importante per la sicurezza degli alimenti e l'acqua, il monitoraggio ambientale e diagnostica 1 point-of-care. Come le tecniche di microbiologia tradizionali sono molto tempo, laborioso, e non hanno la capacità di rilevare i microrganismi in "real-time" o al di fuori dell'ambiente di laboratorio, biosensori stanno evolvendo per rispondere a queste sfide 2-5.
Negli ultimi anni, poroso Si (PSI) è emerso come una piattaforma promettente per la progettazione di sensori e biosensori 6-20. Negli ultimi dieci anni sono stati pubblicati numerosi studi in materia di sensori e biosensori ottici basati psi 21,22. Lo strato nanostrutturati PSi è tipicamente fabbricata elettrochimica anodica incisione da un singolo cristallo di wafer di silicio. I nanomateriali PSi risultanti presentano molte caratteristiche vantaggiose, come la grande superficie e volume libero, poro misure che possono essere controllati e sintonizzabile optiproprietà cal 10,16. Le proprietà ottiche dello strato Psi, quali fotoluminescenza 8,11 e luce bianca a base di riflettanza-interferometria 7,19, sono fortemente influenzati dalle condizioni ambientali. Cattura di giudizi analiti molecole / destinazione entro i risultati strato poroso in una variazione dell'indice di rifrazione medio del film, osservato come una modulazione nello spettro di fotoluminescenza o come uno spostamento della lunghezza d'onda nello spettro di riflettività 10.
Anche se la grande innovazione nella tecnologia PSi biosensore ottico, ci sono solo pochi rapporti sulle piattaforme basate PSI-per i batteri rilevamento 6,8,20,23-29. Inoltre, la maggior parte di questi studi proof-of-concept hanno dimostrato di rilevamento "indiretta" dei batteri. Così, generalmente prima lisi delle cellule è necessario per estrarre i frammenti di proteine / DNA mirati, caratteristici per i batteri studiati 29. Il nostro approccio è quello di acquisire direttamente i batteri bersagliocellule su il biosensore psi. Pertanto, gli anticorpi monoclonali, che sono specifici per i batteri bersaglio, sono immobilizzati sulla superficie porosa. Il legame di cellule di batteri, tramite interazioni anticorpo-antigene, sulla superficie del biosensore indurre variazioni di ampiezza (intensità) dello spettro di riflettività 24-26.
In questo lavoro, si segnala la costruzione di un biosensore basato PSI-ottica e dimostrare la sua applicazione come una piattaforma di biosensori privo di etichetta per la ricerca di Escherichia coli (E. coli), batteri K12 (utilizzati come modello microrganismo). L'monitorato segnale ottico è la luce riflessa dalla nanostruttura PSi causa di Fabry-Perot interferenze film sottile (Figura 1A). Cambiamenti nella luce ampiezza / intensità sono correlati alla specifica immobilizzazione delle cellule dei batteri bersaglio sulla superficie biosensore, consente il rilevamento rapido e quantificazione dei batteri.
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Protocol
1. Preparazione di Oxidized poroso SiO 2
- Etch wafer di silicio (singolo lato lucido in <100> viso e pesantemente drogato, di tipo p, 0.0008 Ω · cm) in una soluzione 03:01 (v / v) di HF acquosa ed etanolo assoluto per 30 secondi a una corrente costante densità di 385 mA / cm 2. Si prega di notare che la HF è un liquido altamente corrosivo e deve essere maneggiato con estrema cura.
- Risciacquare la superficie del risultante Si (PSI) pellicola porosa con etanolo assoluto più volte; asciugare i film sotto un gas di azoto secco.
- Ossidare i campioni PSi appena incise in un forno tubolare a 800 ° C per 1 ora in aria ambiente (posizionare il campione nel forno a temperatura ambiente, riscaldare il forno a 800 ° C, lasciare in forno per 1 ora, spegnere il forno e togliere i campioni dal forno solo a temperatura ambiente).
2. Biofunzionalizzazione di PSIO 2 Ponteggi
- Incubare un PSi ossidato (PSiO 2) campione per 1 ora in mercaptopropil (95% (MPTS) soluzione trimetossisilano-3) (108 mM in toluene).
- Risciacquare il PSIO 2 campione silano-trattato con toluene, metanolo e acetone; secco sotto un gas di azoto secco.
- Incubare la PSIO 2 campione silano modificato per 30 min in 1 ml di 100 mM di soluzione biotina PEO-iodoacetyl.
- Sciacquare il PSIO 2 campione di biotina-trattati con 0,1 M tampone fosfato soluzione (PBS) diverse volte.
- Incubare la PSIO 2 campione biotina-modificato per 30 min in 1 ml di soluzione di streptavidina ml 100 pg / (SA).
- Sciacquare il PSIO 2 del campione SA-trattato con soluzione 0,1 M PBS diverse volte.
- Incubare la SA-modificato PSIO 2 campione risultante per 30 minuti in 1 ml di 100 pg / ml biotinilato E. soluzione di anticorpo monoclonale coli (Immunoglobulina G, IgG) o con IgG 100 pg / ml biotinilato-coniglio (come modello per un anticorpo monoclonale).
3. Etichettatura fluorescente e microscopia a fluorescenza
- Incubare le superfici IgG modificati con 15 ug / ml di fluoresceina (FITC) codificata anti IgG di coniglio per 40 min e con 15 ug / ml di fluoresceina (FITC) codificata IgG anti-topo come controllo.
- Sciacquare i campioni modificati con 0,1 M PBS soluzione più volte.
- Esaminare i campioni al microscopio a fluorescenza.
4. Cultura Batteri
- Coltivare E. batteri coli K12 in una provetta da 10 ml con 5 ml di Luria Bertani (LB) medio (tessitura media in 1 L di acqua deionizzata: 5 g di NaCl, 5 g di estratto di lievito, e 10 g di triptone). Incubare i batteri durante la notte agitazione a 37 ° C.
- Controllare la concentrazione di batteri dalla lettura della densità ottica (DO) a una lunghezza d'onda di 600 nm. Dopo la crescita durante la notte in mezzo LB, leggere la OD 600 utilizzando uno spettrofotometro per determinare la concentrazione batterica. Il numero di cellule è terribilectly proporzionale ai OD 600 misure (1 OD 600 = 10 8 cellule / ml).
5. Batteri Sensing
- Posizionare il PSIO IgG modificato 2 e ordinata PSIO 2 (come controllo) campioni in una cella di flusso plexiglas su misura. Fissare la cella di flusso per garantire che la riflettività campione viene misurato nella stessa posizione durante tutte le misurazioni.
- Incubare i campioni con E. sospensione coli K12 (10 4 cellule / ml) per 30 min a temperatura ambiente. Quindi rimuovere la sospensione batteri svuotando la cella con 0,85% w / v soluzione salina per 30 minuti.
- Monitorare i cambiamenti nei dati di riflettività in tutto l'esperimento. Tutte le misurazioni ottiche devono essere effettuate in un acquoso circostante. Spettri debbono essere raccolti utilizzando uno spettrometro CCD e analizzato applicando trasformata veloce di Fourier (FFT), come precedentemente descritto 25,26.
- Confermare la presenza dei batteri sullasuperficie biosensore, dall'osservazione dei campioni sotto un microscopio ottico verticale subito dopo l'esperimento biosensori.
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Representative Results
PSi ossidato (2) PSIO film sono preparati come descritto nella sezione Text protocollo. Figura 1B mostra una ad alta risoluzione al microscopio elettronico a scansione della pellicola PSi risultante dopo ossidazione termica. Lo strato PSIO 2 è caratterizzata da pori cilindrici ben definiti con un diametro nell'intervallo di 30-80 nm.
L'anticorpo monoclonale (IgG) molecole si innestano sulle PSIO 2 superfici utilizzando una tecnologia silanizzazione consolidata accoppiato con un sistema biotina-SA. Lo schema dettagliato sintesi è descritta nella figura 2. In primo luogo, la superficie ossidata termicamente è silanizzato da MPTS, risultante in una superficie tiolo-silanizzata (figura 2c). Nella fase successiva, la superficie attiva viene incubato con un SH-reattiva molecole biotina linker (figura 2d), seguita da attacco delle proteine SA alla superficie biotina-modificato tramite biotina-SA ponti
Il fissaggio degli anticorpi alla superficie PSIO 2 è confermata dalla marcatura fluorescente seguita dalla osservazione della superficie sotto un microscopio a fluorescenza. Inoltre, studi di fluorescenza permettono di caratterizzare l'attività e specificità antigenica degli anticorpi superficiali immobilizzato (IgG di coniglio) dal legame di fluorescenza etichettato anti-IgG di coniglio anti-IgG di topo come controllo. Figura 3 riassume i risultati di questi esperimenti .
Al fine di dimostrare batteri biosensori abbiamo utilizzato una specifica E. coli IgG invece del modello IgG (IgG di coniglio). Ancora una volta, l'approccio è quello di monitorare le variazioni di ampiezza (intensità) della luce riflessa dal PSIO 2 nanostrUTTURA. Durante gli esperimenti di rilevamento, i biosensori sono fissati in una cella di flusso, al fine di assicurare che la riflettività campione viene misurato nella stessa posizione durante tutte le misurazioni. L'intero esperimento viene condotto in ambiente umido e lo spettro di riflettività campione viene continuamente monitorata. I biosensori sono esposti a E. sospensione coli K12 (10 4 cellule / ml) per 30 min, dopo di che una soluzione tampone viene impiegato per lavare la superficie biosensore (per la rimozione dei batteri senza legami). Uno spettro FFT del biosensore prima e dopo l'introduzione della E. coli (10 4 cellule / ml) è mostrata in Figura 4a (in alto). Così, dopo esposizione a E. coli batteri (e successiva fase di risciacquo) una diminuzione dell'intensità del 7 ± 1% vengono registrati, mentre le variazioni insignificanti (diminuzione inferiore allo 0,5% dell'intensità FFT) si osservano per la non modificato PSIO 2 di superficie (Fig. 4b, in alto). Inoltre, in order per confermare la presenza di cellule catturate sulla superficie PSIO 2, i biosensori sono osservate al microscopio ottico subito dopo il completamento dell'esperimento biosensori. Figura 4a (basso) visualizza immobilizzate cellule batteriche sulla superficie biosensore, mentre non si osservano cellule sulle superfici non modificati (controllo); vedere Figura 4b (in basso).
Figura 1. (A) spettro riflettività tipica di un tipico Fabry-Perot PSIO 2 nanostruttura (sinistra) e lo spettro corrispondente seguente una trasformata veloce di Fourier (destra). La posizione e la grandezza del risultante unico picco sono monitorati. (B) una sezione trasversale ad alta risoluzione microscopio elettronico a scansione (secelettroni secondaria superiore) di una PSIO 2 strati (inciso per 30 secondi a 385 mA / cm 2).
Figura 2. Rappresentazione schematica delle fasi di sintesi seguita per biofunctionalize superficie PSIO 2 con anticorpi. (A) L'etch elettrochimica anodica viene utilizzato per preparare uno strato PSi da un singolo cristallo di wafer di silicio. (B) Il campione appena inciso viene poi ossidato termicamente a 800 ° C. (C) La superficie PSIO 2 viene inizialmente fatto reagire con MPTS per creare libera superficiale gruppo tiolo (attivato PSIO 2 film). (D) incubazione del film attivata con PEO-iodoacetyl biotina per generare superficie biotinilato. (E) L'incubazione delle s biotinilatiurface con SA. (F) L'incubazione della superficie modificata con anticorpi biotinilati. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 3. Risultati di esperimenti di etichettatura fluorescenza per confermare l'attività e specificità antigenica delle IgG immobilizzato. I campioni vengono osservati al microscopio a fluorescenza in un tempo di esposizione costante. (A) bioconjugation completo, PSIO 2 + MPTS + biotina + SA + biotinilato-coniglio IgG e IgG di coniglio FITC anti-; (B) esperimento di controllo con FITC anti IgG di topo, (C) esperimento di controllo, senza IgG, PSIO 2 + MPTS + biotina + SA e IgG di coniglio anti-FITC.
Nota: Questi schemi sono per illustratscopi ioni solo la coniugazione di IgG si verifica anche all'interno dei pori.
Figura 4. E. esperimenti biosensori coli e corrispondenti immagini al microscopio ottico dei biosensori subito dopo gli esperimenti. Gli biosensori sono incubate con 10 4 cellule / ml E. sospensioni coli. Legenda: (a) IgG modificato PSIO 2, (b), pulito (non modificato) PSIO 2.
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Discussion
Un immunosensor ottico privo di etichetta, basato su un PSIO 2 nanostruttura (un film sottile Fabry-Perot) è fabbricato, e il suo potenziale applicabilità come un biosensore per la rilevazione batteri è confermato.
Modifiche e risoluzione dei problemi
Uno dei principali problemi durante la progettazione di immunosensor è la suscettibilità di anticorpi a subire cambiamenti di conformazione indesiderati durante la deposizione e patterning sul substrato solido, che può portare ad una diminuzione della sensibilità biosensore 31,32. Per minimizzare questo problema, coniugazione degli anticorpi alla superficie PSIO 2 si realizza attraverso biotina-SA ponti. SA e biotina sono comunemente utilizzati in molte applicazioni biotecnologiche causa della loro elevata affinità di legame (Kd ~ 10 -13 M). Il legame biotina-SA è uno dei chimici più comuni per immobilizzazione recettore praticato nello sviluppo biosensore 10,32,33,34. L'accessibilità degli anticorpi immobilizzati può essere regolata mediante la reazione biotina-SA che fornisce un collegamento flessibile tra la superficie solida e l'IgG 31,35. Così, il PSIO 2 viene prima biofunctionalized con biotina / SA per permettere la coniugazione di anticorpi biotinilati sulla nanostruttura.
Limiti della tecnica
I principali limiti di questo schema biosensori sono attribuiti agli anticorpi utilizzare come elemento di cattura batteri. Come è con altri immunosensori, ci si limita ad la rivelazione di bersagli che hanno anticorpi disponibili, la specificità degli anticorpi utilizzati e la loro stabilità 36. Il tipo di anticorpi da utilizzare dipende dalla specifica applicazione e quando possibile anticorpi monoclonali sono preferiti. Tuttavia, nonostante l'elevato grado di specificità che gli anticorpi monoclonali forniscono, la rilevazione di batteri interi celle sottostanti 1.000 cellule / ml è ancora una sfida35. Inoltre, l'elevato costo nella produzione di questi anticorpi dovrebbe essere presa in considerazione.
Un'altra limitazione è associato con la stabilità chimica del trasduttore PSi ossidato in ambienti corrosivi / acquosi. Anche se, la stabilità PSIO 2 è superiore rispetto a film sottili Psi, ancora nella conduzione lungo (alcune ore) esperimenti di flusso derive di base possono essere osservati 14,15,21,24. Inoltre, è favorito per aggirare pH neutro (nell'intervallo 6-8) per evitare instabilità meccanica della nanostruttura.
Naturalmente che quando si tratta di campioni di alimenti o acqua reali, che sono contaminati con batteri, un processo di pretrattamento appropriato deve essere considerato prima della fase di rilevamento. Il pretrattamento deve essere progettato in conformità alle caratteristiche specifiche del campione studiato. Ad esempio, le procedure di preparazione quali la dispersione, filtrazione, pH balance, ecc, potrebbe essere considerato. Tuttavia, queste tecniche di pretrattamento sono oltre la portata di questo lavoro.
Significatività rispetto ai metodi esistenti
Ad oggi, l'individuazione e l'identificazione di contaminazioni batteriche si basano principalmente su tecniche di microbiologia coltura classiche o in rapida tecniche di microbiologia, come kit biochimici, ELISA (saggio di immunoassorbimento enzyme-linked), e la PCR (polymerase chain reaction) saggi di 2,3. Questi metodi sono laboriosi, e che richiede tempo richiede diversi giorni per ottenere risultati, quindi'' valutazione in tempo reale'' di acqua e sicurezza alimentare rimanere 2,4,5 irrealizzabile. In questo lavoro, dimostriamo la capacità di biosensori basati psi per superare gli inconvenienti di queste tecniche. Il presente biosensore permette una rilevazione semplice e relativamente sensibili di batteri attraverso un approccio'' diretto cellula cattura'', monitorando i cambiamenti nella sua optici spettro interferenze. I nostri risultati preliminari mostrano un limite di rilevazione minimo di 10 a 4 celle / ml E. coli e un tempo di risposta rapido di vari minuti. Per confronto, il limite di rilevamento di corrente risonanza plasmonica superficiale state-of-the-art (SPR) biosensori è nell'intervallo di 10 2 -10 6 cellule / ml 37-40. In termini di tempo di risposta, la nostra risposta biosensori all'esposizione batteri è paragonabile a quella delle tecniche SPR. Così, i punti di forza di questo schema biosensori sono la semplicità del dosaggio e rilevazione rapida consentendo l'identificazione "tempo reale" dei batteri bersaglio.
Le applicazioni future
Diversi approcci sono attualmente allo studio per migliorare il limite di rilevamento e la sensibilità del biosensore, compresa l'ottimizzazione della concentrazione di anticorpi e orientamento, utilizzare i frammenti di anticorpi invece di anticorpi interi. Inoltre, stiamo studiando la possibilità di aptamers come sonde di cattura alternativi. In conclusione, il lavoro qui presentato fornisce una piattaforma biosensing generico che può essere tradotto in molte applicazioni di biosensori una varietà di microrganismi.
Fasi critiche all'interno del protocollo
Per ottenere prestazioni ottimali del biosensore, è molto importante per confermare la biofunzionalizzazione delle PSIO 2 scaffold (vedere la sezione 3 del testo protocollo, Etichette fluorescenti e microscopia a fluorescenza). Gli studi di fluorescenza ci permettono di confermare l'attacco degli anticorpi al trasduttore (PSIO 2) di superficie e di caratterizzare l'attività e specificità antigenica degli anticorpi allegate, legandosi di fluorescenza tagged IgG anti-coniglio e IgG anti-topo come controllo .
Inoltre, al fine di eliminare i falsi risultati nella lettura ottica, è indispensabile risciacquare adeguatamente la superficie del biosensore seguente esposire ai batteri di destinazione (per la rimozione di cellule batteriche che sono non specificamente legati o risiedono in superficie) e di condurre esperimenti di controllo con ordinata PSIO 2. L'importanza dell'esperimento controllo è per l'eliminazione di adsorbimento non specifico batteri sulla superficie biosensore (vedere la sezione 5 nel testo protocollo, batteri Sensing).
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Disclosures
Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Science Foundation Israele (concessione n ° 1118-1108 e concessione n ° 1146/12) e il Minna Kroll Memorial Fund Research. ES riconosce con gratitudine il sostegno finanziario del Russell Berrie Nanotechnology Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Si wafer | Siltronix Corp. | Highly-B-doped, p-type, 0.0008 Ω-cm resistivity, <100> oriented | |
| Aqueous HF (48%) | Merck | 101513 | |
| Ethanol absolute | Merck | 818760 | |
| PBS buffer solution (pH 7.4) | prepared by dissolving 50 mM Na2HPO4, 17 mM NaH2PO4, and 68 mM NaCl in Milli-Q water (18.2 MΩ) | ||
| Saline 0.85% w/v | prepared by dissolving 0.85 g NaCl in 100 ml Milli-Q water (18.2 MΩ) | ||
| 95% (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane (MPTS) | Sigma Aldrich Chemicals | 175617 | |
| PEO-iodoacetyl biotin | Sigma Aldrich Chemicals | B2059 | |
| Streptavidin (SA) | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 016-000-114 | |
| Fluorescein (DTAF)-streptavidin | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 016-010-084 | |
| Biotinylated-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 011-060-003 | |
| Fluorescently tagged anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 111-095-003 | |
| Fluorescently tagged anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 115-095-003 | |
| Biotinylated E. coli antibody | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 1007 | |
| E. coli (K-12) | was generously supplied by Prof. Sima Yaron, Technion |
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