Summary
迅速な細菌検出用ラベルフリー光学バイオセンサーを導入する。バイオセンサーは、直接的にその表面上に標的細菌の細胞を捕捉するように設計されているナノ多孔質Siに基づいている。私たちは、捕捉プローブとして、多孔質のトランスデューサに固定化モノクローナル抗体を使用しています。我々の研究は、（例えば、細胞溶解など）なし優先検体処理に数分以内に、低濃度の細菌の検出のためのこれらのバイオセンサーの適用可能性を実証する。
Abstract
ナノ多孔質Siに基づくラベルフリー光学バイオセンサーは、モデル微生物として、 大腸菌 K12細菌の迅速な捕捉および検出のために設計されています。研究された試料の前処理なし（細胞溶解などにより ） が必要とされないながら、バイオセンサーは、その表面に標的細菌細胞の直接結合に依存しています。メソポーラスSi薄膜は、バイオセンサの光変換素子として使用される。白色光照明の下では、多孔質層は、その反射率スペクトルでよく解像ファブリ·ペロー干渉縞を表示する。高速フーリエ変換は、単一のピーク反射率データの結果に変換（FFT）を適用する。 FFTピークの強度の変化が監視される。したがって、標的細菌がバイオセンサー表面上に捕獲抗体 - 抗原相互作用を介して、細菌付着の「リアルタイム」の観察を可能にする、FFTのピークの強度における測定可能な変化を誘導する。
ntの ">電気化学的陽極酸化法により製造されたメソポーラスSi膜は、標的細菌に特異的なモノクローナル抗体とコンジュゲートされている。抗体の固定化、免疫活性および特異性を、蛍光標識実験により確認されている。バイオセンサーが曝露されると標的細菌は、細胞を直接抗体修飾多孔Si表面上に捕捉され、これらの特異的捕捉のイベントは、バイオセンサーの薄膜光干渉スペクトルの強度変化をもたらす。我々は、これらのバイオセンサ（検出比較的低い細菌濃度を検出することができることを実証時間未満で10 4細胞/ ml）の上限。Introduction
病原菌の早期かつ正確な識別は、食品や水の安全性、環境モニタリング、およびポイントオブケア診断の1のために極めて重要である。伝統的な微生物学技術は時間がかかり、面倒であり、「リアルタイム」で微生物を検出する能力を欠いているか、実験室環境の外ように、バイオセンサーは、これらの課題2-5を満たすように進化している。
近年では、多孔質Si（PSI）は、センサーやバイオセンサー6月20日の設計のための有望なプラットフォームとして浮上している。過去十年間PSI-ベースの光学センサーやバイオセンサーに関する多くの研究は、21,22を発表した。ナノ構造のPSi層は、典型的には単結晶Siウェハからの電気化学陽極エッチングにより作製される。ナノ材料は、このような大規模な表面と、自由体積など多くの有利な特性を示し、その結果、PSI制御され、調整可能な最適可能な孔の大きさCALの特性10,16。このような光ルミネ8,11と白の光の反射率に基づく干渉7,19などのPSI層の光学特性は、強く、環境条件の影響を受けている。フォトルミネッセンススペクトルの変調として又は反射率スペクトル10の波長シフトとして観察されたフィルムの平均屈折率の変化、多孔質層における結果内でゲスト分子/標的分析物の捕捉。
PSiは、光バイオセンサー技術の広大な革新が、細菌検出6,8,20,23-29ためのPSI-ベースのプラットフォームでのみ報告は少ない。さらに、これらの概念実証研究のほとんどは、「間接的」細菌検出を実証した。したがって、細胞の溶解は、一般的に従来検討細菌に特徴的な29、標的タンパク質/ DNA断片を抽出するために必要とされる。我々のアプローチを直接標的細菌を捕捉することであるのPSIバイオセンサーへの細胞。したがって、細菌を標的とする特異的であるモノクローナル抗体は、多孔質表面上に固定化される。抗体-抗原相互作用を介して、細菌細胞の結合は、バイオセンサーの表面に反射率スペクトル24-26の振幅（強度）の変化を誘導する。
本研究では、光PSI-ベースのバイオセンサーの構築に報告し、 大腸菌の検出（モデル微生物として使用される）（ 大腸菌 ）K12菌用のラベルフリーバイオセンシングプラットフォームとしての用途を示しています。監視対象光信号は、光によるファブリペロー薄膜干渉（ 図1A）へのPSiナノ構造からの反射である。光振幅/強度の変化は、細菌の迅速な検出および定量を可能にする、バイオセンサー表面上に標的細菌細胞の特異的な固定化に相関している。
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Protocol
1。酸化された多孔性のSiO 2の調製
- 定電流で30秒間水性HFおよび無水エタノールの3:1（v / v）の溶液中でエッチングSiウエハ（片面が<100>面に研磨し、高濃度にドープされたp型、0.0008Ω·cm）で385ミリアンペア/ cm 2の密度。 HFは腐食性の高い液体であり、それは、細心の注意を払って処理する必要がありますのでご注意ください。
- 無水エタノールで得られた多孔質Siの（PSI）膜の表面を数回すすぎ、乾燥窒素ガス下でフィルムを乾燥させる。
- （オフにし、1時間、炉内に残して、800℃まで炉を加熱し、室温で炉内にサンプルを置き、周囲の空気中で1時間、800℃で管状炉中の新たエッチングのPSIサンプルを酸化炉のみ室温で炉からサンプルを削除します）。
2。 PSIO 2足場の生体機能化
- 酸化したPSi（PSIをインキュベートメル中で1時間（トリ-3）95％のO 2）のサンプル（MPTS）溶液（トルエン中108 mm）である。
- トルエン、メタノール、アセトンでシラン処理PSIO 2サンプルをすすぎ、乾燥窒素ガス下で乾燥させます。
- 100 mMのPEO-ヨードアセチルビオチン溶液を1ミリリットル中に30分間シラン変性PSIO 2サンプルをインキュベートする。
- 0.1Mのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液で数回、ビオチン処理PSIO 2サンプルを洗浄します。
- 100μg/ mlのストレプトアビジン（SA）の溶液1ミリリットル中に30分間ビオチン修飾PSIO 2サンプルをインキュベートする。
- 0.1MのPBS溶液で数回、SA処理PSIO 2サンプルを洗浄します。
- 100μg/ mlのビオチン化Eの1ミリリットル中に30分間その結果、SA-修正PSIO 2サンプルをインキュベート大腸菌モノクローナル抗体（免疫グロブリンG、IgG）の溶液または100μg/ mlのビオチン化ウサギIgGで（モノクローナル抗体のモデルとして）。
3。蛍光標識し、蛍光顕微鏡
- 15μg/ mlのフルオレセイン（FITC）でIgGを修飾された表面をインキュベート40分間抗ウサギIgGをタグ付け15μg/ mlのフルオレセイン（FITC）でコントロールとして抗マウスIgGタグ付き。
- 0.1MのPBS溶液で数回変更されたサンプルを洗浄します。
- 蛍光顕微鏡下でサンプルを調べる。
4。細菌培養物
- Eを養う大腸菌 K12（1Lの脱イオン水で培地組成：NaClを5gの酵母エキス5g、及びトリプトン10g）をルリアベルターニ（LB）培地5mlで10mlチューブ中の細菌。細菌は一晩37℃で振とう培養する
- 波長600nmでの光学密度（OD）を読み取ることにより、細菌濃度を監視します。 LB培地で一晩増殖させた後、細菌濃度を決定するために分光光度計を用いてOD 600を読む。細胞の数は悲惨ですOD 600の測定値（1 OD 600 = 10 8個/ ml）にCTLY比例。
5。細菌検出
- カスタムメイドのプレキシグラスフローセル中のIgGで修飾されたPSIO 2できちんとPSIO 2（対照として）サンプルを置きます。サンプルの反射率は、全ての測定中に同じ場所で測定されることを確実にするために、フローセルを修正します。
- Eでサンプルをインキュベート大腸菌 K12懸濁液（10 4細胞/ ml）を、室温で30分間インキュベートした。その後、30分間のW / V食塩水0.85％でセルをフラッシュすることによって、細菌懸濁物を除去します。
- 実験を通して反射率データの変化を監視する。全ての光学測定は、周囲の水性中で実施される必要がある。先に説明したように25,26スペクトルは、CCDスペクトロメーターを用いて収集し、高速フーリエ変換（FFT）を適用することによって分析されるべきである。
- 上の細菌の存在を確認バイオセンサ表面は、すぐにバイオセンシング実験後の直立光顕微鏡下での試料の観察による。
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Representative Results
プロトコルのテキストセクションに記載したように酸化されたPSi（PSIO 2）膜が調製される。 図1Bは、熱酸化後に得られたPSi膜の高分解能走査電子顕微鏡写真を示す。 PSIO 2層は30〜500nmの範囲の直径を有する明確に定義された円筒状の細孔によって特徴付けられる。
モノクローナル抗体（IgG）の分子は、ビオチン-SAシステムと結合された十分に確立されたシラン化技術を用いてPSIO 2の表面上にグ ラフトされている。詳細な合成スキームを図2に概説されている。まず、熱酸化表面がチオールシラン化表面（ 図2c）、その結果、MPTSによりシラン化されている。次のステップでは、活性化された表面は、ビオチン-SA架橋を介してビオチン修飾表面へのSAタンパク質の結合に続いて、SH-反応性ビオチンリンカー分子（ 図2d）とインキュベートする
PSIO 2表面への抗体の結合を、蛍光顕微鏡下で表面の観察に続いて蛍光標識によって確認される。また、蛍光研究は、私たちは、蛍光対照として抗ウサギIgGおよび抗マウスIgGを標識した結合により表面に固定化抗体（ウサギIgG）の活性および抗原特異性を特徴づけることを可能にする。 図3はこれらの実験の結果を要約。
細菌バイオセンシングを実証するために、我々は、特定のE.を使用している大腸菌のIgGの代わりに、モデルのIgG（ウサギIgG）。再び、このアプローチは、PSIO 2 nanostrからの反射光の振幅（強度）の変化を監視することであるucture。センシング実験の間、バイオセンサは、サンプルの反射率は、全ての測定の際に同じ場所で測定されることを保証するためにフローセルに固定されている。全実験を、ウエットな環境で行われ、試料の反射率スペクトルを連続的に監視される。バイオセンサーはE.にさらされている緩衝液は、（未結合細菌を除去するために）バイオセンサ表面を洗浄するために使用された後30分間、 大腸菌 K12懸濁液（10 4細胞/ ml）。 Eの導入の前と後のバイオセンサーのFFTスペクトラム大腸菌 （10 4細胞/ ml）を図4a（上）に示されている。このように、Eに暴露した後軽微な変更（FFT強度の0.5％未満の減少）は非修飾PSIO 2面（ 図4b、上）について観察されている間、大腸菌細菌（およびその後のリンス工程）7±1％の強度低下が記録される。また、O中PSIO 2表面上に捕捉された細胞の存在を確認するためのrDerない細胞が観察されないが、バイオセンサーは、直ちにバイオセンシング実験終了。 図4a（下）ディスプレイは、バイオセンサー表面上の細菌細胞を固定化した後、光学顕微鏡下で観察される変更されていないサーフェス（コントロール）上で、 図4b（下）を参照してください。
図1高速フーリエ変換を、以下の典型的なファブリ·ペローPSIO 2ナノ構造（左）および対応するスペクトルの（A）典型的な反射率スペクトル（右）。得られた単一ピークの位置と大きさが監視される。 （B）は断面高分解能走査電子顕微鏡写真（秒385ミリアンペア/ cmで30秒間エッチングしPSIO 2層（）の二次電子）。
図2の合成工程の略図は、抗体とPSIO 2表面をbiofunctionalizeために続いて、（a）陽極電気化学エッチングは単結晶SiウェハからのPSi層を作製するために使用される。 （B）を新たにエッチングされたサンプルは、その後、熱的に800℃で酸化され、 （c）は PSIO 2表面は、最初に遊離チオール基面（活性化PSIO 2膜）を作成するためにMPTSと反応させる。 （D）ビオチン化表面を生成するために、PEO-ヨードアセチルビオチンとの活性化フィルムのインキュベーション。ビオチン化Sの（E）インキュベーションSAにurface。 （F）、ビオチン化抗体を用いた改質表面のインキュベーションは。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
図3：固定化されたIgGの活性および抗原特異性を確認するための蛍光標識実験の結果。サンプルは一定の露光時間で、蛍光顕微鏡下で観察する。 （A）完全生物結合、PSIO 2 +ビオチン+ MPTS + SA +ビオチン化ウサギIgGおよびFITC-抗ウサギIgG（B）FITC-抗マウスIgGとの対照実験（C）対照実験なしのIgG、PSIO 2 + MPTS +ビオチン+ SAおよびFITC-抗ウサギIgG。
注：これらの回路図はillustratです唯一のIgGの結合のようイオンの目的はまた、細孔の内部で発生します。
図4。E.大腸菌バイオ実験と実験後直ちにバイオセンサーの光学顕微鏡像を対応するバイオセンサーを、10 4細胞/ mlのE.と共にインキュベートする大腸菌懸濁液。キー：（a）は、IgGを修正PSIO 2、（b）は、きちんとした（未修正）PSIO 2。
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Discussion
PSIO 2ナノ構造（ファブリペロー薄膜）に基づくラベルフリー光学免疫センサーは、製造されており、細菌検出用バイオセンサーとしての適用可能性が確認された。
修正とトラブルシューティング
免疫センサの設計の主要な関心事の一つは、バイオセンサの感度31,32の低下につながる可能性固体基板上に堆積及びパターニング中の望ましくないコンフォメーション変化を受けるための抗体の感受性である。この問題を最小限に抑えるために、PSIO 2表面への抗体の結合は、ビオチン-SAブリッジを介して達成される。 SAとビオチンは、一般に、それらの高い結合親和性（K dが約10 -13 M）に多くの生物工学用途で使用されている。ビオチン-SAリンクは、バイオセンサーの開発10,32,33,34で実践受容体固定化のための最も一般的な化学的性質の一つである。固定化抗体の接近は、固体表面とのIgG 31,35間の柔軟な結合を提供するビオチン-SAの反応によって調節することができる。このように、PSIO 2は 、最初のナノ構造上にビオチン化抗体の結合を可能にするためにビオチン/ SAにbiofunctionalizedている。
技術の限界
このバイオセンシング方式の主な制限は、細菌捕捉要素として使用する抗体に起因する。他の免疫センサーであるように、我々は、利用可能な抗体、使用される抗体の特異性とその安定性36を持っている標的の検出に限定されている。使用する抗体の種類は、特定のアプリケーション、可能な限り、モノクローナル抗体が好ましいによって異なります。しかし、モノクローナル抗体が提供する高度な特異性にもかかわらず、1,000細胞/ mlの下の全細菌細胞の検出は、依然として課題である35。さらに、これらの抗体の産生に関与する高いコストが考慮されるべきである。
別の制限は、腐食性/水性環境中の酸化のPSiトランスデューサの化学的安定性と関連している。長時間（数時間）を行う際PSIO 2安定性は依然として、PSiの薄膜に比べて優れているものの、フロー実験のベースラインドリフトは14,15,21,24を観察することができる。さらに、そのナノ構造体の機械的不安定性を防止するために、（6-8の範囲内で）、中性pHを回避するために好まれている。
細菌で汚染されている実際の食物または水のサンプルを扱う場合は、当然、適切な前処理工程は、従来検知ステップに考慮しなければならない。前処理は、研究試料の特定の特性に応じて設計されるべきである。例えば、分散、濾過、pH調整のBAとして調製手順ランス等が考えられる。しかし、これらの前処理技術は、この作業の範囲を超えています。
既存の方法に関して、重要性
今日まで、検出および細菌汚染の同定は、主に、古典的な微生物培養技術、または生化学キット、ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）のような微生物の急速な技術に依存し、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）2,3アッセイ。これらの方法は時間がかかり、実現不可能2,4,5まま ''従って、結果を得るために、水および食品安全性のリアルタイム''評価を数日を要する、面倒である。本研究では、これらの技術の欠点を克服するためのPSiベースのバイオセンサーの能力を実証する。本発明のバイオセンサーは、そのオペアンプの変化を監視することにより、直接細胞''''捕捉アプローチを介して細菌の単純かつ比較的高感度な検出を可能にするtical干渉スペクトル。私たちの予備的な結果は、10 4細胞/ mlのEの低い検出限界を表示大腸菌数分の迅速な応答時間。比較のために、現在の最先端の表面プラズモン共鳴（SPR）バイオセンサーの検出限界は10 2〜10 6細胞/ mlの37〜40の範囲である。応答時間の点で、細菌曝露に我々のバイオセンサの応答は、SPR技術に匹敵する。したがって、このバイオセンシング方式の主な長所は、アッセイの単純さと標的細菌の「リアルタイム」の識別を可能にする迅速な検出である。
将来の応用
いくつかのアプローチが、現在、全体ではなく抗体の抗体断片を使用し、抗体濃度及び姿勢の最適化を含むバイオセンサーの検出限界および感度を改善するために探索されている。さらに、我々はがちの可能性を研究している代替捕獲プローブとしてamers。結論として、ここで紹介する作品は、様々な微生物の多くのバイオセンシングアプリケーションに変換することができ、一般的なバイオセンシングプラットフォームを提供します。
プロトコルの中の重要なステップ
バイオセンサーの最適なパフォーマンスを達成するためには、（蛍光標識および蛍光顕微鏡、プロトコルテキストセクション3を参照）PSIO 2足場の生体機能化を確認するために非常に重要である。蛍光研究は、表面（PSIO 2）私たちは、変換器に対する抗体の付着を確認できるようにすると、蛍光対照として抗ウサギIgGおよび抗マウスIgGを標識した結合によって、活性や付着した抗体の抗原特異性を特徴づけるために。
また、光読出で誤った結果を排除するためには、適切にexposu以下のバイオセンサ表面をリンスすることが不可欠である（非特異的に結合し、表面上に存在している細菌細胞を除去するための）標的細菌への再ニートPSIO 2で対照実験を実施する。対照実験の重要性（細菌が検出、プロトコルテキスト内のセクション5を参照）バイオセンサ表面上の非特異的な細菌の吸着除去にある。
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Disclosures
著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。
Acknowledgments
この作品は、イスラエル科学財団（助成番号1118から1108と認可番号1146から1112年）と、みんなのクロール記念研究基金によってサポートされていました。 ESは感謝ラッセルBerrieのナノテクノロジー研究所の財政支援を認めるものです。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Si wafer | Siltronix Corp. | Highly-B-doped, p-type, 0.0008 Ω-cm resistivity, <100> oriented | |
| Aqueous HF (48%) | Merck | 101513 | |
| Ethanol absolute | Merck | 818760 | |
| PBS buffer solution (pH 7.4) | prepared by dissolving 50 mM Na2HPO4, 17 mM NaH2PO4, and 68 mM NaCl in Milli-Q water (18.2 MΩ) | ||
| Saline 0.85% w/v | prepared by dissolving 0.85 g NaCl in 100 ml Milli-Q water (18.2 MΩ) | ||
| 95% (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane (MPTS) | Sigma Aldrich Chemicals | 175617 | |
| PEO-iodoacetyl biotin | Sigma Aldrich Chemicals | B2059 | |
| Streptavidin (SA) | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 016-000-114 | |
| Fluorescein (DTAF)-streptavidin | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 016-010-084 | |
| Biotinylated-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 011-060-003 | |
| Fluorescently tagged anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 111-095-003 | |
| Fluorescently tagged anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 115-095-003 | |
| Biotinylated E. coli antibody | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 1007 | |
| E. coli (K-12) | was generously supplied by Prof. Sima Yaron, Technion |
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