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Bioengineering

Detección óptica de Published: November 20, 2013 doi: 10.3791/50805
Automatic Translation
*1, *2, 1,3
1Department of Biotechnology and Food Engineering, Technion - Israel Institute of Technology, 2The Inter-Departmental Program of Biotechnology, Technion - Israel Institute of Technology, 3The Russell Berrie Nanotechnology Institute, Technion - Israel Institute of Technology
* These authors contributed equally

Summary

Se introduce un biosensor óptico libre de marca para la detección de bacterias rápidos. El biosensor se basa en una Si poroso nanoestructurado, que está diseñado para capturar directamente las células de las bacterias diana sobre su superficie. Utilizamos anticuerpos monoclonales, inmovilizados sobre el transductor porosa, como las sondas de captura. Nuestros estudios demuestran la aplicabilidad de estos biosensores para la detección de concentraciones bacterianas bajas dentro de minutos sin procesamiento de la muestra antes (tales como la lisis celular).

Abstract

Un biosensor óptico libre de etiquetas basado en un nanoestructurado Si poroso está diseñado para la captura rápida y la detección de bacterias de Escherichia coli K12, como un modelo de microorganismo. El biosensor se basa en la unión directa de las células de las bacterias diana sobre su superficie, mientras que no se requiere ningún tratamiento previo (por ejemplo, mediante la lisis celular) de la muestra estudiada. Una película delgada de Si mesoporoso se utiliza como el elemento transductor óptico del biosensor. Bajo iluminación de luz blanca, la capa porosa muestra patrones de franjas de Fabry-Perot bien resueltas en su espectro de reflectividad. La aplicación de una transformada rápida de Fourier (FFT) a los resultados de datos de reflectividad en un solo pico. Los cambios en la intensidad del pico de FFT son monitoreados. Por lo tanto, bacterias diana capturan sobre la superficie del biosensor, a través de interacciones anticuerpo-antígeno, induce cambios mensurables en la intensidad de los picos de FFT, lo que permite una observación "tiempo real" de unión bacterias.

NT "> La película mesoporosa de Si, fabricado por un proceso de anodización electroquímica, se conjuga con anticuerpos monoclonales, específicos para las bacterias diana. La inmovilización, actividad inmunológica y especificidad de los anticuerpos son confirmados por experimentos de marcaje fluorescente. Una vez que el biosensor está expuesto a la bacterias diana, las células son capturados directamente sobre la superficie porosa de Si-anticuerpo modificado. Estos eventos de captura específicas resultan en cambios de intensidad en el espectro de interferencia óptica de película delgada del biosensor. Se demuestra que estos biosensores pueden detectar concentraciones de bacterias relativamente bajas (detección límite de 10 4 células / ml) en menos de una hora.

Introduction

Temprana y precisa identificación de bacterias patógenas es extremadamente importante para la alimentación y la seguridad del agua, monitoreo ambiental, y el punto de atención de diagnóstico 1. Como las técnicas tradicionales de microbiología son lentos, laboriosos, y carecen de la capacidad para detectar microorganismos en "tiempo real" o fuera del entorno de laboratorio, los biosensores están evolucionando para responder a estos desafíos 2-5.

En los últimos años, Si poroso (PSI) se ha convertido en una plataforma prometedora para el diseño de sensores y biosensores 6-20. Durante la última década numerosos estudios sobre los sensores y biosensores ópticos basados ​​en la ISP fueron publicados 21,22. La capa PSi nanoestructurado se fabrica típicamente por grabado electroquímico anódica a partir de un solo cristal de la oblea de Si. Los nanomateriales PSi resultantes exhiben muchas características ventajosas, como la gran superficie y volumen libre, tamaños de poro que se pueden controlar y opti sintonizablepropiedades cal 10,16. Las propiedades ópticas de la capa PSi, como fotoluminiscencia 8,11 y la luz blanca a base de reflectancia interferometría 7,19, están fuertemente influenciadas por las condiciones ambientales. Captura de los huéspedes analitos moléculas / objetivo dentro de los resultados capa porosa en un cambio en el índice de refracción promedio de la película, observado como una modulación en el espectro de fotoluminiscencia o como un cambio de longitud de onda en el espectro de reflectividad 10.

Aunque la gran innovación en tecnología de biosensor óptico PSi, sólo hay pocos informes sobre plataformas basadas en psi para la detección de bacterias 6,8,20,23-29. Además, la mayoría de estos estudios de prueba de concepto han demostrado "indirecta" de detección de bacterias. Por lo tanto, se requiere la lisis generalmente antes de las células para extraer los fragmentos de proteína / ADN dirigidos, característicos de las bacterias estudiadas 29. Nuestro enfoque es capturar directamente las bacterias dianacélulas sobre el biosensor psi. En consecuencia, los anticuerpos monoclonales, que son específicos para las bacterias diana, se inmovilizan sobre la superficie porosa. La unión de células de las bacterias, a través de interacciones anticuerpo-antígeno, sobre la superficie del biosensor inducir cambios en la amplitud (intensidad) de la espectro de reflectividad 24-26.

En este trabajo, nos informe sobre la construcción de un biosensor basado en PSi óptica y demostrar su aplicación como una plataforma de biosensores sin etiqueta para la detección de Escherichia coli (E. coli) K12 (utilizado como modelo de microorganismos). El monitoreado señal óptica es la luz reflejada desde el nanoestructura PSi debido a Fabry-Perot de interferencia de película delgada (Figura 1A). Los cambios en la luz de amplitud / intensidad se correlacionan a la inmovilización específica de las células de las bacterias diana sobre la superficie del biosensor, lo que permite la rápida detección y cuantificación de las bacterias.

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Protocol

1. Preparación de oxidado poroso de SiO 2

  1. Obleas de Si Etch (de un solo lado pulido en el <100> cara y fuertemente dopado, de tipo p, 0,0008 Ω · cm) en una solución de HF acuoso y etanol absoluto durante 30 seg 03:01 (v / v) a una corriente constante densidad de 385 mA / cm 2. Tenga en cuenta que la IC es un líquido altamente corrosivo y debe manejarse con sumo cuidado.
  2. Enjuague la superficie del Si (psi) película porosa resultante con etanol absoluto varias veces; secar las películas bajo un gas nitrógeno seco.
  3. Oxidar las muestras PSi recién grabados-en un horno tubular a 800 º C durante 1 hora en el aire ambiente (colocar la muestra en el horno a temperatura ambiente, caliente el horno a 800 ° C, deje en el horno durante 1 hora, apague la horno y retirar las muestras del horno sólo a temperatura ambiente).

2. Biofuncionalización de PSIO 2 Andamios

  1. Incubar una PSi oxidado (PSiO 2) de la muestra durante 1 hora en mercaptopropil (95% (MPTS) solución de trimetoxisilano-3) (108 mM en tolueno).
  2. Enjuague la muestra tratada con silano PSIO 2 con tolueno, metanol y acetona; seco bajo un gas nitrógeno seco.
  3. Incubar la muestra modificada con silano PSIO 2 durante 30 min en 1 ml de solución de biotina 100 mM de PEO-yodoacetilo.
  4. Enjuague la muestra tratada con biotina PSIO 2 con 0,1 M de tampón fosfato salino (PBS) varias veces.
  5. Incubar la muestra modificada biotina-PSIO 2 durante 30 min en 1 ml de 100 / g solución ml de estreptavidina (SA).
  6. Enjuague el PSIO 2 muestra tratada con SA con solución 0,1 M PBS varias veces.
  7. Incubar la modificado-SA PSIO 2 muestra resultante durante 30 min en 1 ml de 100 mg / ml de E. biotinilado anticuerpo monoclonal coli (Inmunoglobulina G, IgG) o solución con 100 g / ml de IgG biotinilado-conejo (como modelo para un anticuerpo monoclonal).

3. Marcaje fluorescente y microscopía de fluorescencia

  1. Incubar las superficies modificadas-IgG con 15 g / ml de fluoresceína (FITC) marcado contra IgG de conejo durante 40 minutos y con 15 g / ml de fluoresceína (FITC) etiquetados de IgG anti-ratón como control.
  2. Enjuague las muestras modificadas con solución 0,1 M PBS varias veces.
  3. Examine las muestras bajo un microscopio de fluorescencia.

4. Cultura de las bacterias

  1. Cultivar E. bacterias de E. coli K12 en un tubo de 10 ml con 5 ml de medio Luria Bertani (LB) (composición del medio en 1 L de agua desionizada: 5 g de NaCl, 5 g de extracto de levadura, y 10 g de triptona). Se incuban las bacterias agitación durante la noche a 37 ° C.
  2. Monitorear la concentración de bacterias mediante la lectura de la densidad óptica (DO) a una longitud de onda de 600 nm. Después de un crecimiento durante la noche en medio LB, leer la OD 600 utilizando un espectrofotómetro para determinar la concentración bacteriana. El número de células es gravectly proporcional a las OD 600 mediciones (1 OD 600 = 10 8 células / ml).

5. Las bacterias de detección

  1. Coloque el PSIO modificado-IgG 2 y ordenada PSIO 2 (como control) muestras en una celda de flujo de plexiglás a medida. Fijar la celda de flujo para asegurar que la reflectividad de la muestra se mide en el mismo lugar durante todas las mediciones.
  2. Incubar las muestras con E. coli K12 suspensión (10 4 células / ml) durante 30 min a temperatura ambiente. A continuación, retirar la suspensión de bacterias mediante el lavado de la célula con 0,85% w / v de solución salina durante 30 min.
  3. Monitorear los cambios en los datos de reflectividad de todo el experimento. Todas las mediciones ópticas necesitan ser llevado a cabo en un medio acuoso circundante. Los espectros deben ser recogida utilizando un espectrómetro de CCD y se analizó mediante la aplicación de transformada rápida de Fourier (FFT), como se describió previamente 25,26.
  4. Confirmar la presencia de las bacterias en lasuperficie del biosensor, mediante la observación de las muestras bajo un microscopio de luz en posición vertical inmediatamente después del experimento biosensores.

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Representative Results

PSi oxidado (PSIO 2) las películas se prepararon como se describe en la sección de texto del protocolo. Figura 1B muestra una alta resolución de micrografía electrónica de barrido de la película PSi resultante después de la oxidación térmica. La capa PSIO 2 se caracteriza por poros cilíndricos bien definidas con un diámetro en el intervalo de 30-80 nm.

El anticuerpo monoclonal (IgG) se injertan moléculas sobre las superficies PSIO 2 mediante el uso de una tecnología de silanización bien establecida junto con un sistema de biotina-SA. El esquema de síntesis detallada se describe en la Figura 2. En primer lugar, la superficie térmicamente oxidada se silanizada por MPTS, resultando en una superficie tiol-silanizada (Figura 2c). En el siguiente paso, la superficie activada se incuba con un-SH reactivo moléculas de enlace biotina (Figura 2D), seguido de la unión de las proteínas SA para la superficie modificada con biotina a través de biotina-SA puentes (Figura 2e). El paso final en la funcionalización de la superficie del biosensor implica la bioconjugación de anticuerpos monoclonales biotinilados para la SA (Figura 2f).

La unión de los anticuerpos a la superficie PSIO 2 se confirmó por medio del etiquetado fluorescente seguido por la observación de la superficie bajo un microscopio de fluorescencia. Además, estudios de fluorescencia permiten caracterizar la actividad y la especificidad antigénica de los anticuerpos inmovilizados en la superficie (IgG de conejo) mediante la unión de marcado con fluorescencia IgG anti-conejo y anti-IgG de ratón como control. La figura 3 resume los resultados de estos experimentos .

Con el fin de demostrar las bacterias biosensores hemos utilizado un E. específica IgG coli en lugar del modelo de IgG (IgG de conejo). Una vez más, el enfoque es para monitorear los cambios en la amplitud (intensidad) de la luz reflejada desde el nanostr PSIO 2ucture. Durante los experimentos de detección, los biosensores se fijan en una celda de flujo con el fin de asegurar que la reflectividad de la muestra se mide en el mismo lugar durante todas las mediciones. Todo el experimento se lleva a cabo en ambiente húmedo y el espectro de reflectividad de la muestra se controla continuamente. Los biosensores están expuestos a E. coli K12 suspensión (10 4 células / ml) durante 30 min, después de lo cual una solución tampón se utiliza para el lavado de la superficie del biosensor (para la eliminación de las bacterias no unidas). Un espectro de FFT del biosensor antes y después de la introducción de la E. bacterias coli (10 4 células / ml) se presentan en la Figura 4 bis (arriba). Por lo tanto, después de la exposición a E. coli bacterias (y etapa de aclarado posterior) una disminución de intensidad de 7 ± 1% se registra, mientras que se observan cambios insignificantes (disminución de menos de 0,5% en la intensidad de FFT) para la no modificada PSIO 2 de superficie (Figura 4B, parte superior). Por otra parte, en orDer para confirmar la presencia de células capturadas sobre la superficie PSIO 2, los biosensores se observan bajo un microscopio de luz inmediatamente después de la finalización del experimento biosensores. Figura 4a (inferior) muestra inmovilizaron células de las bacterias en la superficie del biosensor, mientras que no se observan células en las superficies no modificadas (control); véase la Figura 4b (parte inferior).

Figura 1
Figura 1. (A) espectro de reflectividad típica de un típico de Fabry-Perot PSIO 2 nanoestructura (izquierda) y el espectro correspondiente a raíz de una transformada rápida de Fourier (a la derecha). La posición y la magnitud del pico único resultante se supervisan. (B) Una alta resolución de micrografía electrónica de barrido de la sección transversal (SECelectrones secundarias) de una capa PSIO 2 (grabada durante 30 segundos a 385 mA / cm 2).

Figura 2
Figura 2. Representación esquemática de las etapas de síntesis siguió a biofunctionalize la superficie PSIO 2 con anticuerpos. (A) Un grabado electroquímico anódica se utiliza para preparar una capa PSi de un solo cristal de la oblea de Si. (B) La muestra recién grabada, entonces se oxida térmicamente a 800 ° C. (C) La superficie PSIO 2 se hace reaccionar inicialmente con MPTS para crear libre superficial grupo tiol (activado PSIO 2 película). (D) La incubación de la película activada con biotina de PEO-yodoacetil para generar superficie biotinilado. (E) La incubación de los s biotiniladosurface con SA. (F) La incubación de la superficie modificada con anticuerpos con biotina. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 3
Figura 3. Resultados de experimentos de marcaje de fluorescencia para confirmar la actividad y la especificidad antigénica de la IgG inmovilizado. Las muestras se observaron bajo un microscopio fluorescente a un tiempo de exposición constante. (A) bioconjugación completa, PSIO 2 + MPTS + biotina + SA +-conejo biotinilado de IgG-FITC y anti-IgG de conejo, (B) experimento de control con FITC anti-IgG de ratón; (C) experimento de control, sin IgG, PSIO 2 + MPTS + biotina + SA y FITC anti-IgG de conejo.

Nota: Estos esquemas son para illustratfines de iones sólo como conjugación de IgG también se produce en el interior de los poros.

Figura 4
Figura 4. E. experimentos biosensores coli y las imágenes de microscopio óptico correspondientes de los biosensores inmediatamente después de los experimentos. Los biosensores se incuban con 10 4 células / ml de E. suspensiones coli. Leyenda: (a) IgG modificada PSIO 2, (b) puro (sin modificar) PSIO 2.

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Discussion

Un inmunosensor óptica-etiqueta libre, basado en un PSIO 2 nanoestructura (una película delgada de Fabry-Perot) se fabrica, y su aplicabilidad potencial como un biosensor para la detección de bacterias se confirma.

Modificaciones y solución de problemas

Una de las principales preocupaciones cuando se diseña un inmunosensor es la susceptibilidad de los anticuerpos a someterse a cambios de conformación no deseados durante la deposición y el patrón sobre el sustrato sólido, que puede conducir a una disminución en la sensibilidad del biosensor 31,32. Para minimizar este problema, la conjugación de los anticuerpos a la superficie PSIO 2 se lleva a cabo a través de biotina-SA puentes. SA y biotina se utilizan comúnmente en muchas aplicaciones biotecnológicas, debido a su alta afinidad de unión (Kd ~ 10 -13 M). El enlace biotina-SA es una de las químicas más comunes para la inmovilización del receptor practicado en el desarrollo de biosensores 10,32,33,34. La accesibilidad de los anticuerpos inmovilizados se puede regular mediante la reacción de biotina-SA que proporciona una unión flexible entre la superficie sólida y la IgG 31,35. Por lo tanto, la PSIO 2 se biofuncionalizadas primero con biotina / SA para permitir la conjugación de anticuerpos biotinilados en la nanoestructura.

Limitaciones de la técnica

Las principales limitaciones de este esquema de biosensores se atribuyen a los anticuerpos de uso como el elemento de captura de las bacterias. Al igual que con otros inmunosensores, estamos limitados a la detección de blancos que tienen anticuerpos disponibles, la especificidad de los anticuerpos utilizados y su estabilidad 36. El tipo de anticuerpos que se utilizará depende de la aplicación específica y siempre que se prefieren posibles anticuerpos monoclonales. Sin embargo, a pesar del alto grado de especificidad que los anticuerpos monoclonales proporcionan, la detección de células enteras de bacterias por debajo de 1000 células / ml es todavía un reto35. Además, el alto costo involucrado en la producción de estos anticuerpos debe ser tomado en consideración.

Otra limitación está asociado con la estabilidad química del transductor PSi oxidado en ambientes corrosivos / acuosas. Aunque, la estabilidad PSIO 2 es superior en comparación a la ISP películas delgadas, aún cuando la realización de largo (varias horas) experimentos de flujo derivas de línea de base se pueden observar 14,15,21,24. Por otra parte, se ve favorecida a trabajar alrededor de pH neutro (en el rango de 6-8) con el fin de evitar la inestabilidad mecánica de la nanoestructura.

Por supuesto que cuando se trata de muestras de alimentos o de agua reales, que están contaminados con bacterias, un proceso de pretratamiento apropiado tiene que ser considerado antes de la etapa de detección. El tratamiento previo debe ser diseñado de acuerdo a las características específicas de la muestra estudiada. Por ejemplo, los procedimientos de preparación tales como la dispersión, filtración, BA pHlanza, etc, podría ser considerado. Sin embargo, estas técnicas de pretratamiento están más allá del alcance de este trabajo.

Importancia con respecto a los métodos existentes

Hasta la fecha, la detección y la identificación de contaminaciones bacterianas se basan principalmente en técnicas de cultivo microbiología clásica o en técnicas rápidas en microbiología, tales como kits bioquímicos, ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas), y PCR (reacción en cadena de la polimerasa) ensayos de 2,3. Estos métodos son laboriosos, que consume tiempo y requiere de varios días para obtener resultados, por lo que'' la evaluación en tiempo real'' de agua y la seguridad alimentaria permanecer 2,4,5 inviable. En el presente trabajo, se demuestra la capacidad de los biosensores basados ​​en la ISP para superar los inconvenientes de estas técnicas. El presente biosensor permite una detección simple y relativamente sensibles de bacterias a través de un enfoque'' directa de células de captura'', controlando los cambios en su opespectro de interferencia vertical. Nuestros resultados preliminares muestran un bajo límite de detección de 10 4 células / ml E. coli y un rápido tiempo de respuesta de varios minutos. Para la comparación, el límite de detección de resonancia de plasmón superficial estado actual de la técnica (SPR) biosensores está en el intervalo de 10 2 -10 6 células / ml 37-40. En términos de tiempo de respuesta, nuestra respuesta a la exposición a bacterias biosensores es comparable a la de las técnicas de SPR. Por lo tanto, los principales puntos fuertes de este esquema de biosensores son la simplicidad de la prueba y la detección rápida que permite la identificación "en tiempo real" de las bacterias diana.

Las aplicaciones futuras

Varios enfoques se están estudiando actualmente para mejorar el límite de detección y la sensibilidad del biosensor, incluyendo la optimización de la concentración y la orientación de anticuerpos, usar fragmentos de anticuerpos en lugar de anticuerpos completos. Además, estamos estudiando la posibilidad de aptamers como sondas de captura alternativos. En conclusión, el trabajo presentado aquí proporciona una plataforma de biosensores genérico que puede ser traducido a muchas aplicaciones de biosensores de una variedad de microorganismos.

Los pasos críticos dentro del protocolo

Con el fin de lograr un rendimiento óptimo del biosensor, es muy importante para confirmar la biofuncionalización de los PSIO 2 andamios (véase la sección 3 en el texto del protocolo, Fluorescente etiquetado y microscopía de fluorescencia). Los estudios de fluorescencia nos permiten confirmar la unión de los anticuerpos al transductor (PSIO 2) de superficie y para caracterizar la actividad y la especificidad antigénica de los anticuerpos unidos, por la unión de marcado con fluorescencia IgG anti-conejo y anti-IgG de ratón como control .

Por otra parte, con el fin de eliminar los resultados falsos en la lectura óptica, es esencial para enjuagar apropiadamente la superficie del biosensor siguiente exposure a las bacterias diana (para la eliminación de células de las bacterias que están unidas inespecíficamente o residen en la superficie) y para llevar a cabo experimentos de control con aseado PSIO 2. La importancia del experimento de control es la eliminación de la adsorción inespecífica bacterias en la superficie del biosensor (véase la sección 5 en el texto del protocolo, Bacteria Sintiendo).

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Disclosures

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias de Israel (subvención N º 1118/08 y la concesión N º 1146/12) y el Fondo de Investigación Conmemorativo Kroll Minna. ES agradece el apoyo financiero del Instituto de Nanotecnología Russell Berrie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Si wafer Siltronix Corp. Highly-B-doped, p-type, 0.0008 Ω-cm resistivity, <100> oriented
Aqueous HF (48%) Merck 101513
Ethanol absolute Merck 818760
PBS buffer solution (pH 7.4) prepared by dissolving 50 mM Na2HPO4, 17 mM NaH2PO4, and 68 mM NaCl in Milli-Q water (18.2 MΩ)
Saline 0.85% w/v prepared by dissolving 0.85 g NaCl in 100 ml Milli-Q water (18.2 MΩ)
95% (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane (MPTS) Sigma Aldrich Chemicals 175617
PEO-iodoacetyl biotin Sigma Aldrich Chemicals B2059
Streptavidin (SA) Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 016-000-114
Fluorescein (DTAF)-streptavidin Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 016-010-084
Biotinylated-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 011-060-003
Fluorescently tagged anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 111-095-003
Fluorescently tagged anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 115-095-003
Biotinylated E. coli antibody Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 1007
E. coli (K-12) was generously supplied by Prof. Sima Yaron, Technion

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Detección óptica de<em&gt; E. coli</em&gt; Bacterias por mesoporosos Silicon Biosensores
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Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G.,… More

Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Segal, E. Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors. J. Vis. Exp. (81), e50805, doi:10.3791/50805 (2013).

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