Summary
מאמר זה מתאר את היישום של מיקרוסקופיה האלקטרונית cryoanalytical למדידת כמותית של תוכן הכולל סידן והפצה ברזולוציה subcellular בדגימות ביולוגיות מוגדרות מבחינה פיזיולוגית.
Abstract
במאמר זה את הכלים, טכניקות, והכלים מתאימים למדידות כמותיות של תוכן יסודות תאיים באמצעות הטכניקה המכונה microanalysis אלקטרון הבדיקה (EPMA) מתוארים. סידן הוא Intramitochondrial דגש מיוחד בגלל התפקיד הקריטי שעומס יתר סידן המיטוכונדריה משחק במחלות ניווניות. השיטה מבוססת על הניתוח של קרני ה-X שנוצר במיקרוסקופ אלקטרונים (EM) על ידי אינטראקציה של אלומת אלקטרונים עם הדגימה. על מנת לשמור על הפצת יליד אלמנטי diffusible בדגימות מיקרוסקופית אלקטרונים, EPMA דורשת "cryofixation" של רקמה אחרי הכנת cryosections Ultrathin. הקפאה מהירה של תאים בתרבית או תרבויות הפרוסה organotypic מתבצעת על ידי הצעד ההקפאה באתאן הנוזלי או על ידי הקפאת טריקה נגד גוש מתכת קר, בהתאמה. Cryosections נומינלי 80 ננומטר העבה נחתכים יבש עם סכין יהלום בCA. -16076, C, רכוב על פחם / רשתות נחושת מצופה pioloform, וcryotransferred לcryo-EM באמצעות בעל cryospecimen מיוחד. לאחר סקר חזותי ומיפוי מיקום ב≤ -160 מעלות צלזיוס ומינון אלקטרונים נמוכים, cryosections קפוא התייבשות הם ב-100 מעלות צלזיוס במשך ~ 30 דקות מיובשים בהקפאה. תמונות ברמת אברון של cryosections המיובש נרשמות, גם במינון נמוך, באמצעות מצלמת CCD איטית סריקה ואזורי subcellular של העניין נבחר לניתוח. קרני ה-X הנפלטת מROIs ידי ממוקדת, אלקטרון בדיקה נייחת, בעוצמה גבוהה נאספות על ידי רנטגן באנרגיה נפיצה ספקטרומטר (edx), מעובד על ידי האלקטרוניקה קשורה, ומוצג כספקטרום ה-X, כלומר, עלילה של עוצמת קרני ה-X לעומת אנרגיה. תוכנה נוספות מאפשרת: 1) זיהוי של מרכיבים יסודיים על ידי האנרגיות שלהם "האופייניות" לשיא וטביעת אצבע; ו2) ניתוח כמוני על ידי מיצוי של אזורי שיא / רקע. מאמר זה מסכם בשתי דוגמאות הממחישות טיפוסייישומי EPMA, אחד שבו ניתוח סידן המיטוכונדריה סיפק תובנה קריטית לתוך מנגנונים של פגיעת יתר רעילה ועוד, שחשפו את הבסיס של התנגדות איסכמיה.
Introduction
יוני סידן הוא ללא ספק ישות תא איתות החשובה והמגוונים ביותר בביולוגיה, ששיחק תפקיד חיוני בתהליכים נורמלים מגוון כמו שידור סינפטי וביטוי גנים. מצד השני, סידן חשוב באותה מידה במוות של תאים. בפרט, הסרת הפיקוח סידן הוא גורם מפתח בפגיעה עצבית בשבץ מוחי, פרקינסון, אלצהיימר ומחלות ניווניות אחרות 3,5. לכן, חשוב באופן קריטי להבנת כמותית כמה סידן מופץ בתוך תאים, ואיך זה משתנה בעקבות גירויים פיסיולוגיים או pathophysiological. מטרה זו היא מסובכת בשל העובדה כי סידן מופץ באופן דינמי בין שתי מדינות פיזיות - חופשיות בפתרון או קשורה למצע - וכי ריכוזי סידן תאי לשנות פני כמה סדרי הגודל כתוצאה מגירוי.
אמנם יש מספר שיטות מתקדמות זמינות עבור הניתוח של free סידן תוך תאי, קביעת ריכוזי סידן הכולל בתאים תאיים מוגדרים מוגבלת באופן מציאותי לגישה אחת, כלומר, microanalysis אלקטרון הבדיקה (EPMA). EPMA היא טכניקה שזוגות ספקטרומטר X-ray למיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM). תותח האלקטרונים TEM מתמקד אלקטרון בדיקה נייחת, submicron באזור subcellular של ריבית וקרן ה-X האלמנט ספציפי הנפלטת כתוצאה מהפגזת אלקטרונים שנאספו ונותח (ראה אזכור 7, 4 לביקורות טכניות מפורטות). יתרונותיו של EPMA כוללים רזולוציה ברמת אברון אחת ורגישות submillimolar. בפועל, עם זאת, דורשת EPMA cryotechniques מיוחד ומכשור להכנת דגימה וניתוח. הנה, את הכלים, הטכניקות והמכשירים מתאימים למידות של סידן תוך שימוש בEPMA מתוארות. סידן הוא Intramitochondrial של i המיוחדתnterest על חשבון התפקיד הקריטי שמחזות עומס יתר סידן המיטוכונדריה במחלות ניווניות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הגישה המתוארת כאן פותחה תוך שימוש במכשירים ספציפיים, כלים ותוכנות. משום שמעבדות לא תהיה באמצעות ההתקנה ניסיונית את גישתו כללית במידת האפשר.
1. הקפאה מהירה
השיטה אנליטית ללהיות מתואר היא תלויה לחלוטין בגישות קריוגני ל: 1) "cryofixation" של תאים או רקמות באופן שמשמר את כמותית ההפצה של רכיבי רקמות diffusible ויסודות כימיים כפי שהיו בתאי חיים ברגע של הקפאה , ו 2) הכנת ultrathin cryosections מתאימה להדמיה וניתוח בTEM. טכניקות אלו מתוארות כאן בקצרה, אבל פרטים נחוצים כדי לשחזר נהלים אלה במעבדות אחרות הם מעבר להיקף של מאמר זה. קוראים מעוניינים מופנים למאמרים האחרונים מצוינים 9,14.
זהירות: סעיף זה מתאר את השימוש בסבון נוזליאתאן efied, שהוא דליק מאוד ונפיץ; יש לנקוט באמצעי זהירות מתאימה. גם מפעיל חייב להיות מוכר עם חנקן נוזלי (LN 2) אמצעי בטיחות, כולל מעיל מגן מעבדה, משקפיים, כפפות וcryoresistant. הערה: פה ולאורך כל דרך, כל הכלים (מלקחיים, וכו ') המשמשים לטיפול בדגימות קפואות חייבים להיות precooled בLN 2 לפני השימוש, כדי למנוע הפשרה מקרית.
תאים בתרבית על coverslips
- הכן את מכשיר הקפאה לצלול על ידי עיבוי אתאן גזים ב-160 מעלות צלזיוס בבאר המרכזית מקוררת-2 LN. מלא לציון ולכסות היטב עם מכסה אלומיניום ציר כאשר אינו בשימוש.
- באמצעות טריזי נייר סינון, למחוק coverslips פלסטיק של תאים בתרבית באופן ניסיוני תנאים מתאימים לסרט מימיים דק. למחוק מהקצה כדי להימנע מלגעת ברקמה; סרט שיורי האידיאלי, שנקבע על ידי ניסוי וטעייה, הוא דק ככל האפשר, אך לא כל כך הכבלהתאדות ולאפשר ייבוש של פני השטח הרקמות.
- מחזיק את coverslip על ידי הקצה עם מלקחיים מתהדקים, לטבול במהירות באתאן הנוזלי, באופן ידני או באמצעות הבוכנה המופעלת כוח הכבידה.
- מקום coverslip הקפוא בקערה סמוכה קלקר של LN 2, גדולה מספיק כדי לתפעל את המספר הרצוי של coverslips לתוך מיכלי אחסון לטווח ארוך. פחיות כובע בורג אלומיניום שלא לתפוס תחת LN 2 מומלצות.
הקפאה מהירה של פרוסות מוח בתרבית
- תחת מיקרוסקופ לנתח, להציג ולהתמצא פרוס בהיפוקמפוס organotypic, ללא הפרעה ועדיין מחובר להוספת קרום התרבות. הצב סימני fiducial על הקרום ליד הקצה של הפרוסה עם עט לנוכל מסוג שחור ולצלם.
- עדיין מתחת למיקרוסקופ, לחתוך את כ. 5 X 5 ריבועי קרום מ"מ עם פרוסות בודדות מתמקדות בריבועים. הימנע מלגעת בפרוסה או כיפוף membranדואר.
- הר פרוסה נתמך קרום, מרופדת ב¼ במשטח אגר קוטר, על דיסק אלומיניום מעוצב אישית עשה כדי להתאים cryoultramicrotome (שיפורט להלן). במהירות להקפיא את הפרוסה ידי pneumatically דוחף אותו כנגד גוש ספיר LN 2 מקורר באמצעות מכשיר "הקפאת טריקה" מותאם אישית.
- מעבר לאחסון כפי שתואר לתאים בתרבית.
2. Cryosectioning
אזהרה: בהצלחה בהפקת סרטים בחיתוך היבש של חלקים דקים במיוחד, ואילו פשוט והגיוני, דורש אימון, סבלנות ותרגול רב.
- אופים את cryoultramicrotome מצויד בcryoattachment ומגניב -135 ° C.
- חותכים coverslips הקפוא לכ. 3 x 3 מ"מ ריבועים באמצעות אזמל חד, precooled. להטביע חתיכות עם התרבויות פונות כלפי מעלה ב" cryoglue "צמיג נוזל (תערובת של אתנול ו1:06 2-propanol 11), ב -3 בתקןסיכות מ"מ קוטר אלומיניום נועדו להתאים את צ'אק דגימת microtome. הימנע דולף cryoglue על גבי משטח התרבות. לחזק cryoglue על ידי הורדת טמפרטורת cryobox ל≤ -160 ° C.
- לפרוסות מוח קפוא, באופן מאובטח לצרף דיסקים ישירות לצ'אק דגימת מחוייט באמצעות צווארון בורג.
- Trim אזורים נבחרים של הדגימות קפואות - למשל אזורי תא עשיר של יצירות coverslip או באזורים מזוהים של פרוסות - לכ. פנים 250 x 250 מיקרומטר בלוק ו~ 100 עומק מיקרומטר באמצעות כלי יהלום זמירה.
- סרטים לחתוך יבש של סעיפים דקים בCA. -160 מעלות צלזיוס באמצעות cryoknife יהלומים 35 °, למעשה, כמתואר בreferencs 4, 9. מהירויות חיתוך וזווית אישור סכין נקבעות באופן אמפירי; נקודת התחלה טובה היא 0.4-0.6 מ"מ / שנייה בשעה 9 מעלות. העובי הנומינלי, כלומר מראש דגימה, סעיפים התייבשות iזה בדרך כלל 80 ננומטר, למרות שחלקים הם למעשה 1.5-2.0x עבים יותר, בעיקר עקב דחיסה. עבור חתך משביע רצון, מכשיר אנטי סטטי הוא חיוני. הנח את הקצה מייננת של מכשיר 0.5-1 סנטימטר מקצה הסכין ותפוקת חשמל להתאים עד סרטים מספקים של חלקים מיוצרים.
- הכן את הבדיקות על ידי הדבקת ריסים (עם אפוקסי) ריסים למקלות המוליך עץ. באמצעות בדיקה כזו, להרים וחתכים העברה מהחלק האחורי של הסכין על, סרטי תמיכת pioloform זוהרים משוחרר מצופה פחמן להטיל על רשתות נחושת מתקפל 100 רשת ונח על מעטפת נייר כסף אינדיום חצי מקופלת על מדף שמאחורי עבודה הסכין. מקפלים מעל את החצי העליון של הרשת והמעטפה, לחץ עם כלי כבישה קר.
- רשתות עטופות העברה לתיבה נוחה רשת וחנות באלומיניום יכולות כפי שמתוארות בשלב 1.4.
3. Cryotransfer של דוגמאות למיקרוסקופ אלקטרונים
מכשיר הליבה לEPMAבמעבדה זו הוא מיקרוסקופ אלקטרונים אנליטית המופעל ב120 KV ומצויד לcryomicroscopy, כלומר, נועד עם ואקום נקי, anticontaminator דגימה באזור, מצלמה דיגיטלית רגישות גבוהה 2k x 2k ובעל דגימת cryotransfer. בדקו מראש יישור מיקרוסקופ ותנאי הפעלה בשני מצבים נמוכים וגבוהה בהגדלה ולאשר ואקום עמודה משביע רצון, באופן אידיאלי ≤ 10 -7 טור. כוון את צורך.
- ודא שבידוד הוואקום של רכיב דיואר של cryoholder הוא משביעת רצון. לשאוב לפי צורך.
- מגניב cryoholder לטמפרטורה שלו מינימאלית, לפחות -160 מעלות צלזיוס, ואילו תחת ואקום גבוה בתוך הבמה מיקרוסקופ; לנתק את כבל חיבור למחזיק בן תיבת ששליטתה. הטה את 45 ° עם כיוון השעון goniometer לפני הסרת בעל למזער LN 2 נשפך על משטחי מפעיל ומיקרוסקופ.
- הכן את cryoworkstation המעבדתיים על ידי קירור הבודד נפרדכוס ד ל≤ 160 ° C.
- העברה (quickly!) cryoholder מקורר ממיקרוסקופ כדי Cryo תחנת עבודה. לחזור בו מגן הכפור של בעל.
- אחזר תחת LN 2 כריך רשת מאחסון ומקום על שולחן העבודה של cryoworkstation. טבעת תמך ולדגימה של בעל היא גם מונחת על השולחן.
- פתח את מעטפת אינדיום ולהעביר את הרשת מתקפל המצורפת כדי גם הדגימה של cryoholder. לאבטח את הרשת עם טבעת חיזוק שימוש באפשרות הברגים המסופק ולסגור את המגן הכפור.
- להסיר במהירות את cryoholder מcryoworkstation ולהכניס לתוך מנעל האוויר של המיקרוסקופ ולעבור את רצף השאיבה מהר ככל האפשר. בכניסה, לא אמור להיות הפרעה מזערית של ואקום העמודה.
- לחזור goniometer ל0 ° הטיה. חבר מחדש וreenergize תיבת הבקרה ולוודא כי טמפרטורת הדגימה היא ≤ 150 ° C.
- למלא את דיואר שלהדגימה בעל ולאפשר ואקום וטמפרטורה כדי להחלים באופן מלא.
4. סקר חזותי של סעיפים
- לחזור בו מגן הכפור של בעל לחשוף את הדגימה ולהפעיל את קרן האלקטרונים.
- מבחינה ויזואלית להעריך את הדגימה בהגדלה נמוכה, בדרך כלל 250X, ותאורה נמוכה. כפי שמודגם באיור 1, סעיפים צריכים להיות דקים וחלק, לא מקופל או חופפים, שטוחים ומחובר היטב לסרט התמיכה, ובאופן כללי לא מוסתרים על ידי סורגי רשת.
- לחלופין לצלם קטעים נבחרים. (הערה: מזעור חשיפת קרן, שכן חלקים קפואים-התייבשות הם מאוד רגישים לנזקים הנגרם קורה.) השתמש בשלב goniometer הדיגיטלי האוטומטי לאחסון קואורדינטות של קטעים נבחרים.
5. הקפאת ייבוש של סעיפים
- להקפיא יבשים חלקים על ידי הגדלת טמפרטורת בעל CA. C ° -100 ל~ 30 דקות.
- Recool בעל ל-C ° -160 או מתחת.
6. הדמיה של תאים ואברונים
תמונות מבניות של חלקים מיובשים בהקפאה מתקבלות בחברת CA. -160 ° C כמו במינון נמוך, תמונות אפס הפסד שנרשמו באופן דיגיטלי באמצעות מצלמת CCD איטי סריקת 2k x 2k נשלטת על ידי תוכנה מתאימה.
- הפעל את EM במצב Hi-mag.
- בחר ותמונה ב2,000 X ~ (כמו בפורמט TIFF, ראה איור 2) תאים שנבחרו ואזורי subcellular של עניין בחלקים באיכות גבוהה במקומות שנרשמו בעבר ומאוחסן. (הערה: הקטעים היבשים נמצאים כעת באופן משמעותי פחות שבירים ופחות רגישים לנזקי קרן אלקטרונים.
- להעריך את התמונות על מנת לבחור אזורים של עניין (ROIs) לניתוח ה-X. לחלופין ניתן לבצע צעד זה off-line, ובמקרה זה ניתן להפעיל EMומהדגימה מותר לחמם לטמפרטורת חדר.
7. רכישת רנטגן ספקטרה
ספקטרום ה-X ניתן להקליט באמצעות כל כמה מסחרי או אישית מעוצב רנטגן מערכות ניתוח מינימאלי בהיקף של גלאי אנרגיה נפיצה רנטגן (edx), אלקטרוניקה דופק מעבד קשורה ורכישת תוכנה והתצוגה תואמת. (המערכת בשימוש במעבדה זו מתוארת בטבלה 1).
- הגדר את EM לרכישת קרני ה-X על ידי החדרת גלאי EDX לתוך הטור (במידת צורך), נסיגת הצמצם האובייקטיבי, והחדרת ומרכוז כל פתחי קרינה תועים. התאם את cryoholder לטמפרטורה הנמוכה ביותר שבי זיהום כפור של הדגימה הוא נמנע, אבל לפחות מתחת -100 ° C.
- הטה את בעל 20 ° לכיוון הגלאי.
- בתנאי הדמיה רחב בתחום, ובהנחה שמתכוון לנתח את המטריצה של individuaמיטוכונדריה ליטר, בחר mitochondrion לניתוח, להעביר אותה למרכז השדה ולהתמקד.
- עבור למצב נקודה (בחלק מהמיקרוסקופים רק להתכנס הקרן באמצעות מוקד הקבל שני) ולהגדיל את הקרן הנוכחית לCA. 3 Na (כפי שנמדד עם כוס פאראדיי או דומה) למקום 100 ננומטר.
- הפעל את תוכנת רכישת הספקטרום ולהתחיל 100 רכישות שניות, אשר ניתן לצפות בשידור חי בזמן המסך להציג. להציל את הספקטרום שנרשם (איור 2). פורמט EMSA תקן התעשייה הוא מועדף.
- כבה את EM ולהעביר את הקובץ מרובה ספקטרום (ים) לתחנת עבודה (לא מקוון) ניתוח.
8. ניתוח של קרני ה-X ספקטרה
ניתוח איכותי
ספקטרום EDX (איור 2, הבלעה) הוא למעשה עלילת XY של עוצמת קרני ה-X לעומת אנרגיה. ספקטרה להכיל מידע איכותי וכמותי על הרכב היסודות של tהוא ניתח את עוצמת קול, שבאנרגיה "האופיינית" של שיא מזהה את האלמנט הוליד שיא שבעוד עוצמת משקפת את הסכום של רכיב זה. הפסגות האופייניות לרכב על גבי רקע משתנה באיטיות, "הרצף". (האגדה באיור 2 נוספת דנה בפרטים בולטים של ספקטרום EDX.) האנרגיה של יריעות השיא לטבלה המחזורית כולו מוגדרות על ידי המבנה הידוע האלקטרוני של אלמנטים, ובכך כל קישורי תוכנת EDX למסד נתונים שמזהה באופן אוטומטי רכיבים של אנליטי. בהקשר פיסיולוגי, אלמנטים של אינטרס כללי כי הם גם מתאימים לניתוח edx כוללים Na (α K ב1.04 Kev), P (2.01 Kev), K (3.31 Kev), וCa (3.69 Kev).
- נצל את היתרון של מסד הנתונים של תוכנה זמינה ושגרת התאמת השיא לזהות אלמנטים עיקריים בספקטרום. בדגימה ביולוגית מצפה למצוא פסגות לNa, Mg, P, S, Cl, K, ו-CA. (זהירות:שני האלמנטים שעבר חפיפה!)
ניתוח כמותי
ניתוח כמותי של ספקטרום EDX המורכב של חילוץ באזור המשולב של פסגות מזוהות והמרת הערך הזה לריכוז. לניתוח ביולוגי, הגישה שנקבעה היא שיטת הול שיא / רצף 4,7,10, שמנצלת את העובדה שעוצמת הרצף (שהוגדר לעיל ובאיור 2) היא פרופורציונלית למסה היבשה של הנפח ניתח . לפיכך, היחס בין שטח האזור / רצף שיא, בהשוואה לאותו היחס בספקטרום של סטנדרטים של הרכב ידוע, מציין את הריכוז בתא הסלולרי הממוקד. שים לב שגישה זו מספקת ריכוזים ביחידות של שומות לפי משקל, בדרך כלל באו לידי ביטוי כמשקל יבש מילימול / קילוגרם. יחידה זו היא יוצאת דופן ופרשנות עשוי לדרוש המרה נוספת ל, למשל, משקל רטוב mmol / L או מילימול / חלבון מ"ג, כפי שתוארה אלsewhere 4,10.
- לחלץ אזורי שיא (והערכות שגיאה) של אלמנטים ביולוגיים בין Z = 10-20 (.5-4.0 Kev), כלומר Na, Mg, P, S, Cl, K, ו-CA, תוכנה משתמש באחד מהרוטינות הולמת נבנה לניתוח (ראה טבלת מס '1, ובמיוחד הערת שוליים 4). מעבדה זו משתמשת סימפלקס או ריבועים מרובים לפחות הולם. שים לב שהתאמה זו דורשת תשומת לב קפדנית לפתרון החפיפה בין פסגות K ו Ca (ראה איור 2).
- לשלב את הרצף בין 1.45-1.61 קו. ניתן להשתמש בם אזורים נקיים מהפרעות אלטרנטיביים.
- חישוב יחס שיא / רצף ולאחר מכן ריכוזים בהשוואה לסטנדרטים. הפץ טעויות לאורך כל הניתוח.
- השתמש בתוכנה סטטיסטית מקובלת ונוסחאות להערכה ממוצעים המשקפות את השונות ביולוגיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תאים במוח בדרך כלל לקיים פציעת יתר רעילה כתוצאה משחרור הנוירוטרנסמיטר פתולוגיים המתרחש בתנאי איסכמי. EPMA הייתה קריטית כדי לגלות כיצד היכולת של המיטוכונדריה העצבית כדי לעקל כמויות אדירות של סידן עומדת בבסיס המנגנון של פציעה. מיקרוסקופ האלקטרונים באיור 3 ממחיש את המראה של המיטוכונדריה בcryosections המיובש בהקפאה של תאי עצב בהיפוקמפוס בתרבית הוקפא במהירות לאחר 30 חשיפת דקות לגירוי יתר רעיל (100 מיקרומטר NMDA). רוב מיטוכונדריה מופיעה להיפגע מבחינה מבנית, כפי שהם נפוחים מאוד ומכילים תכלילים קטנים וחשוכים (חיצים אדומים). EPMA, שבו יש רזולוציה מספיקה כדי לבצע ניתוח יסודי ובבלעדי של ("מטריקס") תכלילים המיטוכונדריה (איור 3, ספקטרום אדום וכחול, בהתאמה), גילתה כי תכלילים מורכבים בעיקר של סידן וזרחן. קון סידן הגבוה מאודאוהל של תכלילים אלה - ~ 1,300 משקל יבש מילימול / קילוגרם, ואילו <1 mmol / קילוגרם אופייני למנוחת מיטוכונדריה - מסביר קיבולת סידן החציצה יוצאת דופן שלהם, ומדוע מכריע מנגנון חציצה זה מוביל למוות של תאים, מופעל עומס יתר סידן 11.
ההיפוקמפוס, אזור במוח החיוני ללמידה וזיכרון, הוא אתר עיקרי של פציעה לאחר איסכמיה. מעניין, וחשוב טיפולי, האזור תפקודי המובהק בשם CA3 הוא הרבה פחות פגיע לפגיעה איסכמית מאשר הוא האזור הסמוך, מחובר synaptically CA1. ניתוח EMPA - בשיתוף עם cryosections של אזורים הספציפיים של פרוסות בהיפוקמפוס, כי לשמור על מבנה באתרו ותפקוד (איור 4, מיקרוסקופ) - היה בשימוש כדי להראות שגירויים רעילים לגרום לגבה סידן הרבה יותר גדולים בתאי עצב CA1 פגיעים יותר מאשר בתאי עצב סמוכים CA3 עמיד ( איור 4, גרף עמודות). כתוצאה מכך, mitochon CA1 dria תערוכת פגיעה וחוסר תפקוד נרחבים, המצביע על כך Ca 2 תפקוד המיטוכונדריה מושרה + עומס הוא גורם מכריע בפגיעות סלקטיבי של תאי עצב CA1 13.
איור 1. מיקרוסקופ אלקטרונים נמוך הגדלה של שני סרטים של cryosections קפוא התייבשות נתמכת על סרט pioloform. מאפייני הכנה טובה מומחשים, כוללים קטעים שטוחים, מחוברים היטב, מקוטעים מינימאלי. יש להימנע ריבועי רשת עם קרעים בסרט התמיכה, כמו בסרט קורע עוד יותר מתחת לאלומת האלקטרונים. שני ריבועים מתאימים באופן מלא לניתוח מסומנים בכוכביות. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר.
"עבור: src =" "/> /" = src "/ files/ftp_upload/50807/50807fig2.jpg files/ftp_upload/50807/50807fig2highres.jpg
איור 2. ניתוח כמותי של הרכב יסודות אברון ידי EPMA. במינון נמוך במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים סריקה הדיגיטלית של נוירון האוהד בcryosection המיובש בהקפאה שהוכן מהגנגליון שליטה במהירות קפוא ממחיש את הפירוט השגה בדגימות מסוג זה. הערה קרום הפלזמה החדה, ערימות השתמרות טובה של reticulum endoplasmic ומיטוכונדריה שפע הבלעה -. ספקטרום EDX נרשם מאזור טיפוסי של מטריקס המיטוכונדריה, כפי שצוין על ידי הנקודה האדומה. הרכיבים המתאימים לפסגות K הגדולות פגז רנטגן מזוהים; במקרה של אשלגן וסידן, שני קווי K-פגז הנובעים ממעברים אלקטרוניים חלופיים נפתרים, שמסומן כα K ו-K β פי סימון ספקטרוסקופיות סטנדרטי. ספקטרום ממחיש התפלגות טיפוסית של אלמנטים מרכזיים בחיים נוירונים. שים לב לקרינה משתנה באיטיות הרצף, למשל בין 1.5-1.8 או 2.8-3.1 קו, המשקפת את צפיפות המסה של תא סלולארי זה. ניתוח כמותי של סידן בתאים בריאים הוא מסובך על ידי הנוכחות של רמות גבוהות היחסי של אשלגן (משקל CA. 500 מילימול / קילוגרם יבש, כ שווה ערך ל 150 מ"מ), אשר מוליד את החפיפה של β K אשלגן וסידן K α פסגות בספקטרום EDX. יש אלגוריתמים סטנדרטיים לdeconvolving חפיפה זו. בר סולם מייצג 1 מיקרומטר.
איור 3. גירוי יתר רעיל גורם להצטברות סידן משתנה ומותאם במיטוכונדריה בודדת. מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים דיגיטלי של cryosection המיובש בהקפאה שהוכן מ תרבות מבולבל, מהירות קפוא בהיפוקמפוס תא לאחר גירוי יתר רעיל של תת סוג NMDA של קולטני גלוטמט (100 מיקרומטר NMDA ל30 דקות) מציגה מספר רב של מיטוכונדריה מכילה תכלילים קטנים, באופן טבעי אלקטרונים צפופים, punctate (חיצים אדומים). ספקטרום ה-X המתאים להוכיח שגירוי רעיל הביא לאובדן של הומאוסטזיס יון, כפי שמעיד שיא Na הגדיל והקטינו שיא K במטריצה ללא הכללה המיטוכונדריה (חיצים וספקטרום כחולים). שיא Ca הגדול בספקטרום האדום משקף הצטברות סידן המיטוכונדריה חזקה המקומית לתכלילים אופייניים, שגם מכילים כמויות גדולות של זרחן וחמצן. ריכוז Ca הממוצע בתכלילים ומטריצות היה ~ 1,300 ~ ומשקל יבש 60 מילימול / קילוגרם, בהתאמה. בר סולם מייצג 500 ננומטר.
7fig4.jpg "/>
איור 4. עומס יתר סידן המיטוכונדריה הוא אחראי לפגיעות איסכמי סלקטיבי של תאי עצב בהיפוקמפוס CA1 לוח שמאלי -. micrographs אלקטרונים של cryosections של גופי תא בCA3 ואזורי CA1 של תרבות organotypic היפוקמפוס הפרוסה, קפואה במהירות בתנאי חיקוי-איסכמיה (100 מיקרומטר NMDA). פנל ימני - EPMA ניתוחים של תכולת סידן המיטוכונדריה מראה כי איסכמיה הכימית גורמת לגבה סידן גדולים בהרבה במיטוכונדריה של תאי עצב CA1 פגיעים יותר מאשר בתאי עצב CA3 סמוכים, איסכמיה עמידה (* p <0.05 ביחס לCA1 נחשף-NMDA). עומס יתר סידן מושרה NMDA בוטל על ידי NMDAR אנטגוניסט ח"כ -801. בר סולם מייצג 2 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטת האלקטרונים המבוסס על מיקרוסקופ האנליטיות שהוצגה כאן מאפשרת לגילוי, זיהוי והכימות של כמה אלמנטים של עניין ביולוגי, כוללים Na, K, P, ובמיוחד Ca. ניתן לבצע ניתוחים אלה יצאו בsubcellular, כלומר, תוך אברון, רזולוציה בשל היכולת לאתר ולזהות מבנים של עניין בתמונות באיכות גבוהה של cryosections הוכן מדגימות מוקפאות במהירות. שים לב שאין צורך בצביעה להקליט תמונות אלקטרונים דומות באיכות מבנית להכנות קבועות כמקובל, משובץ פלסטיק, אפילו בזמן שהמיקום של אלמנטי רקמה נשמר כמותית.
למרות תמונות סקר מבניות נרשמות במינון אלקטרונים היישומי נמוך, מינונים גבוהים הרבה יותר נדרשים כדי לעורר קרינת ה-X בספירה שיעורים מספיקים כדי לקבל נתונים סטטיסטיים טובים. לכן, מיקרוסקופ שימושי עבור EMPA חייב להיות מסוגל ליצור בדיקה ממוקדת נוכחית גבוהה; 2-5 Naל25-50 ננומטר, מתאים למקיפים אברונים כמו cisternae ER או שלפוחית סינפטית, זה מקובל. מינימאלי זה דורש תותח אלקטרונים hexaboride ניתן בהירות גבוהה. בתנאים אלה סייעו, סידן בריכוזים רקמה טיפוסיים של 1-10 במשקל מילימול / קילוגרם יבש ניתן לנתח כמותית לשגיאה סטנדרטית של ± 0.1 מילימול / ק"ג ב~ 100 זמן חי שניות. הרגישות של ניתוח סידן הייתה משתפרת מאוד אם זה לא היה בגלל החפיפה המצערת של קו רנטגן הגדול סידן עם קו אשלגן קטין, deconvolution של אשר מוסיפה ודאות משמעותית לשילוב של אות סידן (ראה איור 1 לאגדה פרטים נוספים). שים לב שתנאי הגבול תיארו הם מאוד רגועים כאשר ריכוזי סידן מקומיים הם גבוהים בצורה יוצאת דופן, כפי שמתרחש במהלך הצטברות פיזיולוגית, ופתולוגיים במיוחד, סידן המיטוכונדריה (איורים 2-3).
למרות successf רביישומי ul, ברור שEPMA היא לא טכניקה יעילה במיוחד, ולכן יש תמריץ הרבה כדי לשפר את נתוני תפוקה. שלושה אפיקים מבטיחים מוזכרים כאן: 1) אנרגיית אלקטרון ספקטרוסקופיית אובדן (צלופחים) במקום EDX; 2) אלמנט 2D מפות במקום בדיקות נקודה: 3) מכשור חדש, מדינה-of-the-art. במקום איסוף צילומי רנטגן הנפלטים, צלופחים תלויים בהקלטת אלקטרונים אירוע שאיבדו כמויות של אנרגיה אופייניות, אלמנט ספציפי לאחר התנגשויות אלקטרונים / אטום. סטטיסטית, צלופחים הוא מטבעו ~ 4x טוב יותר מאשר EDX, וצלופחי חומרה ותוכנה נמצאים כעת כמעט בוגרות לביולוגים. (ראה אזכור 6, 2 לביקורות של יישומי צלופחים בביולוגיה).
הרגישות המשופרת המוצע על ידי צלופחים - וגם על ידי גלאי EDX Si-להיסחף תפוקה גבוהה יותר, ראה להלן - מאפשרת להתעכב זמנים קצרים יותר לניתוח, למשל אלפיות שנייה ולא שעותundreds של שניות, ולכן היכולת ליצור מפות דיגיטליות של אזורים נבחרים בזמנים סבירים. כדוגמא, מפת סיד 128 x 128 ניתן להקליט ב~ 1 שעות 1. שים לב כי גישה זו, המכונה "הדמיה ספקטרום" 6,2, מספקת קשת צלופחים מלאה על כל פיקסל, ולכן מידע על מספר אלמנטים מוטבע בנרשמה "קוביית המידע" (x vs. Y vs. E).
לבסוף, היו התקדמות מהותית בטכנולוגית מכשיר וביצועים מאז המערכת הנוכחית, כפי שתואר בסעיף הפרוטוקול, פותח לפני למעלה 20 שנים. מדינה-of-the-art הטכנולוגיה שתהיה דה דגר בהיותו התקנה היום מעבדה EMPA יכלול: 1) אקדח פליטת שדה הבהירות גבוהה שיכול לשאוב כמה nanoamps (Na) של זרם לתוך כתמי subnanometer בגודל; 2 ) גלאי שטח גדול סיליקון להיסחף ליעילות מוגדלת רנטגן איסוף ותפוקה 8: 3) תוכנה מודרניתהמציע גמישות וביצועים איכותיות לרכישת רפאים, ניתוח וכימות. חבילות תוכנה מסוג זה הן זמינים באופן מסחרי מרוב היצרנים, או לחלופין, גרסה מעודכנת ומשופרות של תוכנת DTSA, DTSA השני, זמינה ללא עלות מNIST (ראה טבלת מס '1, הערת שוליים 4). התכונות שתוארו לעיל נמצאות בחלק העליון של כל אוטומציה ו / או רובוטיקה נגיש במיקרוסקופ האלקטרונים בסיס.
פרוטוקול EMPA כמתואר הוכיח את עצמו שימושי מאוד לתקיף מספר נושאים בעלי עניין למדעני מוח, עוזר, למשל, לחשוף את המנגנונים תאיים של מחלות הניווניות. בהתחשב בשיפורים פשוט מומלצים, EMPA צריך להמשיך להיות תורם מוצק למחקר עתידי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מדווחים על היעדר ניגוד עניינים.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לגב 'כריסטין א ינטרס לקבלת סיוע טכני מעולה. עבודה זו נתמכה על ידי התכנית למדעי המוח הבסיסית של תכנית NINDS המחקר העירונית, NIH (Z01 NS002610).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS/MATERIALS | |||
| Thermanox plastic coverslips | Thermo Fischer Scientific | 72280 | |
| Culture inserts | BD Falcon | 353090 | For 6-well plates |
| Cryopins | Leica Microsystems | 16701952 | Grooved |
| Wood applicators | EM Sciences | 72300 | |
| Folding EM grids | Ted Pella | 4GC100/100 | 100 mesh |
| Indium foil | Alfa Aesar | 13982 | 0.25 mm thick |
| EQUIPMENT | |||
| Plunge freezing device | Leica Microsystems | KF-80 | |
| Slam freezing device | LifeCell | CF-100 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Cryoattachment for microtome | Leica Microsystems | FC6 | |
| Diamond cryotrimming tool | Diatome | Cryotrim 45 | |
| Diamond cryoknife | Diatome | Cryo 35 | |
| Antistatic device | Diatome | Hauf Static Line | |
| Cryo electron microscope | Carl Zeiss Microscopy | EM912 Omega | |
| EM cryo specimen holder | Gatan | CT3500 | |
| Slow-scan CCD camera, 2k x 2k | Troendle (TRS) | Sharpeye | |
| Image acquisition software | Olympus SIS | iTEM suite | |
| ED x-ray detector | Oxford Instruments | Linksystem Pentafet | |
| Pulse Processor | Oxford Instruments | XP-3 | |
| PCI backplane card | 4pi Systems | Spectral Engine II | |
| Desktop computer | Apple | Any OS9-compatible model | |
| X-ray analysis software | NIST | DTSA, DTSA II | |
| Spreadsheet software | Microsoft | Excel | |
|
|||
References
- Aronova, M. A., Kim, Y. C., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B., Leapman, R. D. Quantitative EFTEM mapping of near physiological calcium concentrations in biological specimens. Ultramicroscopy. 109, 201-212 (2009).
- Aronova, M. A., Leapman, R. D. Elemental mapping by electron energy loss spectroscopy in biology. Methods Mol. Biol. 950, 209-226 (2013).
- Bezprozvanny, I. Calcium signaling and neurodegenerative diseases. Trends Mol. Med. 15, 89-100 (2009).
- Fernandez-Segura, E., Warley, A. Electron probe X-ray microanalysis for the study of cell physiology. Methods Cell Biol. 88, 19-43 (2008).
- Gibson, G. E., Starkov, A., Blass, J. P., Ratan, R. R., Beal, M. F. Cause and consequence: Mitochondrial dysfunction initiates and propagates neuronal dysfunction, neuronal death and behavioral abnormalities in age-associated neurodegenerative diseases. Biochim. Biophys. Acta. 1802, 122-134 (2010).
- Leapman, R. D. Novel techniques in electron microscopy. Curr. Opin. Neurobiol. 14, 591-598 (2004).
- LeFurgey, A., Bond, M., Ingram, P. Frontiers in electron probe microanalysis: application to cell physiology. Ultramicroscopy. 24, 185-219 (1988).
- Newbury, D. E. The new X-ray mapping: X-ray spectrum imaging above 100 kHz output count rate with the silicon drift detector. Microsc. Microanal. 12, 26-35 (2006).
- Pierson, J., Vos, M., McIntosh, J. R., Peters, P. J. Perspectives on electron cryotomography of vitreous cryo-sections. J. Electron Microsc. 60, S93-S100 (2011).
- Pivovarova, N. B., Hongpaisan, J., Andrews, S. B., Friel, D. D. Depolarization-induced mitochondrial Ca accumulation in sympathetic neurons: spatial and temporal characteristics. J. Neurosci. 19, 6372-6384 (1999).
- Pivovarova, N. B., Nguyen, H. V., Winters, C. A., Brantner, C. A., Smith, C. L., Andrews, S. B. Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons. J. Neurosci. 24, 5611-5622 (2004).
- Ritchie, N. W. Spectrum simulation in DTSA-II. Microsc. Microanal. 15, 454-468 (2009).
- Stanika, R. I., Winters, C. A., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B. Differential NMDA receptor-dependent calcium loading and mitochondrial dysfunction in CA1 vs. CA3 hippocampal neurons. Neurobiol. Dis. 37, 403-411 (2010).
- Zhang, P., et al. Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the hemotaxis receptor Tsr. J. Microsc. 216, 76-83 (2004).
