इलेक्ट्रॉन जांच एक्स - रे Microanalysis द्वारा न्यूरॉन्स में कुल कैल्शियम का मापन

Summary

इस पत्र physiologically परिभाषित जैविक नमूनों में subcellular संकल्प में कुल कैल्शियम की मात्रा और वितरण की मात्रात्मक माप करने cryoanalytical इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के आवेदन का वर्णन है.

Abstract

इस अनुच्छेद में इलेक्ट्रॉन जांच microanalysis (EPMA) के रूप में जाना तकनीक का उपयोग उपकरण, तकनीक, और intracellular मौलिक सामग्री का मात्रात्मक मापन के लिए उपयुक्त साधन वर्णित हैं. Intramitochondrial कैल्शियम क्योंकि mitochondrial कैल्शियम अधिभार neurodegenerative रोगों में खेलता है कि महत्वपूर्ण भूमिका की एक विशेष ध्यान है. विधि एक्स - रे का विश्लेषण नमूना के साथ एक इलेक्ट्रॉन बीम की बातचीत से एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (ईएम) में उत्पन्न पर आधारित है. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी नमूनों में प्रसारण तत्वों के मूल निवासी वितरण बनाए रखने के लिए, EPMA ultrathin cryosections की तैयारी द्वारा पीछा ऊतक की "cryofixation" की आवश्यकता है. संवर्धित कोशिकाओं या organotypic टुकड़ा संस्कृतियों का तेजी से ठंड क्रमश: एक ठंडी धातु ब्लॉक के खिलाफ तरल एटैन में या स्लैम ठंड के कारण जमने डुबकी द्वारा किया जाता है. Cryosections नाममात्र मोटी 80 एनएम सीए में एक हीरा चाकू के साथ सूखी काट रहे हैं. -16076, सी, कार्बन / pioloform लेपित तांबे ग्रिड पर मुहिम शुरू की है, और एक विशेष cryospecimen धारक का उपयोग कर एक क्रायो ईएम में cryotransferred. सी और कम इलेक्ट्रॉन खुराक ° ≤ -160 पर दृश्य सर्वेक्षण और स्थान मानचित्रण के बाद, जमे हुए हाइड्रेटेड cryosections फ्रीज सूखे ~ 30 मिनट के लिए -100 डिग्री सेल्सियस पर हैं. सूखे cryosections की organelle स्तर छवियों को एक धीमी गति से स्कैन सीसीडी कैमरा और विश्लेषण के लिए चयनित हित के subcellular क्षेत्रों के माध्यम से भी कम मात्रा में, दर्ज कर रहे हैं. एक स्थिर, ध्यान केंद्रित, उच्च तीव्रता इलेक्ट्रॉन जांच से ROIs से उत्सर्जित एक्स - रे एक ऊर्जा फैलानेवाला एक्स - रे (EDX) जुड़े इलेक्ट्रॉनिक्स द्वारा संसाधित स्पेक्ट्रोमीटर,, और एक एक्स - रे स्पेक्ट्रम के रूप में प्रस्तुत द्वारा एकत्र कर रहे हैं, वह है, एक ऊर्जा बनाम एक्स - रे तीव्रता की साजिश है. अतिरिक्त सॉफ्टवेयर की सुविधा: उनके "विशेषता" पीक ऊर्जा और फिंगरप्रिंट द्वारा मौलिक घटकों का 1) पहचान, और चोटी के क्षेत्रों / पृष्ठभूमि की निकासी के द्वारा 2) मात्रात्मक विश्लेषण. इस पत्र विशिष्ट उदाहरण देकर स्पष्ट करना है कि दो उदाहरणों के साथ समाप्तMitochondrial कैल्शियम विश्लेषण ischemia के प्रतिरोध के आधार से पता चला है कि excitotoxic चोट और एक अन्य के तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की, जिनमें से एक में EPMA अनुप्रयोगों,.

Introduction

कैल्शियम आयनों synaptic प्रसारण और जीन अभिव्यक्ति के रूप में विविध रूप में सामान्य प्रक्रियाओं में एक आवश्यक भूमिका निभा रहा है, यकीनन जीव विज्ञान में सबसे महत्वपूर्ण और बहुमुखी संकेतन सेल इकाई हैं. दूसरी ओर, कैल्शियम कोशिका मृत्यु में भी उतना ही महत्वपूर्ण है. विशेष रूप से, कैल्शियम ढील स्ट्रोक में neuronal चोट में एक महत्वपूर्ण कारक है, पार्किंसंस, अल्जाइमर और अन्य neurodegenerative रोगों ^3,5. इस प्रकार, यह कैल्शियम कोशिकाओं के भीतर वितरित किया जाता है कैसे मात्रात्मक समझने के लिए महत्वपूर्ण है, और कैसे यह शारीरिक या pathophysiological उत्तेजनाओं निम्न परिवर्तन. समाधान में नि: शुल्क या एक सब्सट्रेट करने के लिए बाध्य - - और सेलुलर कैल्शियम की सांद्रता उत्तेजना का एक परिणाम के रूप में परिमाण के कई आदेशों के साथ बदल कि इस लक्ष्य को कैल्शियम गतिशील रूप से दो शारीरिक राज्यों के बीच वितरित किया जाता है कि इस तथ्य से जटिल है.

Fr के विश्लेषण के लिए उपलब्ध कई उन्नत तरीके जबकि वहाँintracellular कैल्शियम EE, परिभाषित intracellular डिब्बों में कुल कैल्शियम की सांद्रता का दृढ़ संकल्प वास्तविक एक दृष्टिकोण, अर्थात्, इलेक्ट्रॉन जांच microanalysis (EPMA) तक सीमित है. EPMA कि जोड़े एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (मंदिर) के लिए एक एक्स - रे स्पेक्ट्रोमीटर एक तकनीक है. मंदिर इलेक्ट्रॉन बंदूक ब्याज और इलेक्ट्रॉन बमबारी का एक परिणाम के रूप में उत्सर्जित तत्व विशेष एक्स - रे की एक subcellular क्षेत्र पर एक स्थिर, submicron इलेक्ट्रॉन जांच केंद्रित (विस्तृत तकनीकी समीक्षा के लिए संदर्भ ^{7, 4} देखें) एकत्र की है और विश्लेषण कर रहे हैं. EPMA के लाभ एकल organelle स्तर के संकल्प और submillimolar संवेदनशीलता शामिल हैं. अभ्यास में, तथापि, EPMA नमूना तैयार करने और विश्लेषण के लिए विशेष cryotechniques और इंस्ट्रूमेंटेशन की आवश्यकता है. इधर, उपकरण, तकनीक और EPMA का उपयोग intracellular कैल्शियम की माप के लिए उपयुक्त साधन वर्णित हैं. Intramitochondrial कैल्शियम विशेष मैं का हैमहत्वपूर्ण भूमिका के कारण nterest कि neurodegenerative रोगों में mitochondrial कैल्शियम अधिभार नाटकों.

Protocol

यहाँ वर्णित दृष्टिकोण विशिष्ट उपकरणों, उपकरण और सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विकसित किया गया था. प्रयोगशालाओं में एक ही प्रयोगात्मक सेटअप का उपयोग नहीं होगा, क्योंकि दृष्टिकोण जहां संभव सामान्यीकृत है.

1. तेजी से ठंड

वे ठंड के क्षण में जीवित कोशिकाओं में थे के रूप में मात्रात्मक प्रसारण ऊतक घटकों और रासायनिक तत्वों के वितरण को बरकरार रखता है एक तरह से कोशिकाओं या ऊतकों की 1) "cryofixation": वर्णित किया जा करने के लिए विश्लेषणात्मक विधि के लिए क्रायोजेनिक दृष्टिकोण पर बिल्कुल निर्भर है , और 2) ultrathin की तैयारी एक मंदिर में इमेजिंग और विश्लेषण के लिए उपयुक्त cryosections. इन तकनीकों में संक्षेप में यहाँ वर्णित है, लेकिन अन्य प्रयोगशालाओं में इन प्रक्रियाओं को पुन: पेश करने के लिए आवश्यक विवरण इस लेख के दायरे से बाहर हैं. इच्छुक पाठकों उत्कृष्ट हाल के लेख ^9,14 करने के लिए भेजा जाता है.

सावधानी: इस खंड liqu के उपयोग का वर्णनअत्यधिक ज्वलनशील और संभावित विस्फोटक है जो efied एटैन,; उचित सावधानियां बरती जानी चाहिए. ऑपरेटर भी तरल नाइट्रोजन से परिचित होना चाहिए (एल एन ₂₎ सुरक्षा प्रयोगशाला कोट, चश्मा, और cryoresistant दस्ताने सहित सुरक्षा सावधानियों,. नोट: यहाँ और भर में सभी उपकरणों (संदंश, आदि) जमे हुए नमूनों आकस्मिक विगलन से बचने के लिए उपयोग करने से पहले एलएन ₂ precooled में किया जाना चाहिए संभाल करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

Coverslips पर संवर्धित कोशिकाओं

1. एलएन ₂ कूल्ड केंद्रीय कुएं में -160 डिग्री सेल्सियस पर गैसीय एटैन संघनक द्वारा एक डुबकी ठंड डिवाइस तैयार करें. मार्क को भरें और पिवट एल्यूमीनियम ढक्कन जब उपयोग में नहीं है के साथ अच्छी तरह से कवर किया.
2. एक पतली जलीय फिल्म के लिए प्रयोगात्मक उपयुक्त परिस्थितियों में संवर्धित कोशिकाओं की प्लास्टिक coverslips दाग फिल्टर पेपर wedges, का उपयोग करना. ऊतक को छू से बचने के रूप में इतनी बढ़त से ब्लाट, परीक्षण और त्रुटि के द्वारा निर्धारित आदर्श अवशिष्ट फिल्म, संभव के रूप में पतली लेकिन इतना वें नहीं हैऊतक सतह के सूखने लुप्त हो जाना और अनुमति देने के लिए के रूप में.
3. Clamping संदंश के साथ बढ़त से coverslip होल्डिंग, जल्दी से या तो स्वयं या गुरुत्वाकर्षण संचालित सवार का प्रयोग, तरल एटैन में विसर्जित कर दिया.
4. लंबी अवधि के भंडारण कंटेनरों में coverslips की वांछित संख्या में हेरफेर करने के लिए काफी बड़े एलएन ₂ के पास के एक स्टायरोफोम कटोरा, में जमी coverslip जगह. एल एन ₂ के तहत जब्त नहीं है कि एल्यूमीनियम पेंच टोपी डिब्बे सिफारिश कर रहे हैं.

सुसंस्कृत मस्तिष्क स्लाइसें के तेजी से ठंड

5. एक विदारक माइक्रोस्कोप, देखने और ओरिएंट अबाधित और अभी भी संस्कृति झिल्ली डालने से जुड़ी एक organotypic hippocampal टुकड़ा, के तहत. एक काले sharpie प्रकार कलम और तस्वीर के साथ टुकड़ा के किनारे के पास झिल्ली पर असंदिग्ध निशान रखें.
6. फिर भी खुर्दबीन के नीचे, लगभग काट दिया. चौराहों पर केन्द्रित व्यक्तिगत स्लाइस के साथ 5 एक्स 5 मिमी झिल्ली वर्गों. टुकड़ा छू या membran झुकने से बचेंई.
7. (नीचे वर्णित) एक cryoultramicrotome फिट करने के लिए बनाया एक कस्टम डिजाइन एल्यूमीनियम डिस्क पर व्यास अगर पैड में एक ¼ द्वारा तकिये एक झिल्ली समर्थित टुकड़ा, माउंट. तेजी से pneumatically एक स्वनिर्धारित "स्लैम ठंड" डिवाइस के माध्यम से एक एलएन ₂ कूल्ड नीलमणि ब्लॉक के खिलाफ यह पहुंचा द्वारा टुकड़ा फ्रीज.
8. संवर्धित कोशिकाओं के लिए वर्णित के रूप में भंडारण के लिए ले जाएं.

2. Cryosectioning

चेतावनी: सरल और तार्किक, प्रशिक्षण, धैर्य और काफी अभ्यास की आवश्यकता है जबकि सफलतापूर्वक, ultrathin वर्गों की सूखी कटौती रिबन का निर्माण किया.

1. -135 डिग्री सेल्सियस के एक cryoattachment और शांत से लैस एक cryoultramicrotome बाहर सेंकना
2. लगभग में जमी coverslips काटें. एक तेज, precooled स्केलपेल का उपयोग 3 एक्स 3 मिमी वर्गों. संस्कृतियों मानक 3 पर, एक चिपचिपा तरल "cryoglue" में (एक इथेनॉल के 01:06 मिश्रण और 2-propanol ¹¹⁾ का सामना करना पड़ के साथ टुकड़े शामिल करेंसूक्ष्म नमूना चक लायक बनाया मिमी व्यास एल्यूमीनियम पिंस. संस्कृति की सतह पर cryoglue लीक से बचें. -160 डिग्री सेल्सियस ≤ को cryobox तापमान को कम से cryoglue जमना
   • जमे हुए मस्तिष्क के स्लाइस के लिए, सुरक्षित रूप से एक पेंच कॉलर के माध्यम से एक कस्टम निर्मित नमूना चक को सीधे डिस्क देते हैं.
3. एक लगभग करने के लिए - स्लाइस की coverslip टुकड़े या क्षेत्रों की पहचान की जैसे सेल समृद्ध क्षेत्रों - जमे हुए नमूनों के चयनित क्षेत्रों ट्रिम. एक हीरे trimming उपकरण का उपयोग कर 250 x 250 माइक्रोन ब्लॉक चेहरे और ~ 100 माइक्रोन गहराई.
4. सीए में पतली वर्गों की सूखी कटौती रिबन. एक 35 डिग्री हीरा cryoknife का उपयोग कर -160 डिग्री सेल्सियस, referencs ^{4, 9} में वर्णित अनिवार्य रूप से के रूप में. गति काटना और चाकू निकासी कोण अनुभव से निर्धारित कर रहे हैं, एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु 9 डिग्री पर 0.4-0.6 मिमी / सेकंड है. हाइड्रेटेड वर्गों की नाममात्र मोटाई, यानी नमूना अग्रिम, मैंवर्गों मुख्य रूप से संपीड़न के कारण, वास्तव में 1.5 2.0x गहरा हो रहे हैं, हालांकि, आमतौर पर 80 एनएम है. संतोषजनक सेक्शनिंग के लिए, एक antistatic डिवाइस आवश्यक है. धार से डिवाइस 0.5-1 सेमी की ionizing टिप प्लेस और वर्गों के संतोषजनक रिबन उत्पादित कर रहे हैं जब तक बिजली उत्पादन समायोजित करें.
5. लकड़ी applicator के चिपक (epoxy के साथ) eyelashes gluing द्वारा बरौनी जांच को तैयार है. इस तरह के एक जांच का प्रयोग, उठाओ और चाकू के पीछे से हस्तांतरण वर्गों 100 जाल तह तांबे ग्रिड से अधिक डाली चमक से छुट्टी दे दी, कार्बन लेपित pioloform समर्थन फिल्मों पर और पीछे काम कर रहे एक शेल्फ पर एक आधा मुड़ा ईण्डीयुम पन्नी लिफाफे पर आराम चाकू. एक ठंडा दबाव उपकरण के साथ ग्रिड और लिफाफे के ऊपर आधा, प्रेस पर मोड़ो.
6. एक एल्यूमीनियम में एक सुविधाजनक ग्रिड बॉक्स और दुकान पर स्थानांतरण लिपटे ग्रिड के रूप में 1.4 चरण में वर्णित कर सकते हैं.

3. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप करने के लिए नमूनों की Cryotransfer

EPMA के लिए कोर साधनइस प्रयोगशाला में 120 केवी पर संचालित और cryomicroscopy के लिए सुसज्जित है, वह यह है कि एक स्वच्छ निर्वात, नमूना क्षेत्र anticontaminator, एक 2k एक्स 2k उच्च संवेदनशीलता डिजिटल कैमरा और cryotransfer नमूना धारक के साथ बनाया गया एक विश्लेषणात्मक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप है. दोनों कम और उच्च बढ़ाई मोड में माइक्रोस्कोप संरेखण और परिचालन की स्थिति पहले से जाँच करें और आदर्श ≤ 10 ^-7 Torr, एक संतोषजनक स्तंभ निर्वात की पुष्टि करें. आवश्यक के रूप में ट्यून.

1. Cryoholder के देवर घटक का वैक्यूम इन्सुलेशन संतोषजनक है कि पुष्टि करें. आवश्यक रूप से पंप.
2. अपने नियंत्रण बॉक्स के धारक को जोड़ने केबल को अलग; खुर्दबीन मंच के भीतर उच्च वैक्यूम के अंतर्गत है, जबकि इसकी न्यूनतम तापमान, कम से कम -160 डिग्री सेल्सियस, को cryoholder कूल. ऑपरेटर और माइक्रोस्कोप सतहों पर spilling एलएन ₂ को कम करने के धारक को हटाने से पहले गोनियोमीटर 45 ° दक्षिणावर्त झुकाएँ.
3. अभिन्न बचाने ठंडा करके benchtop cryoworkstation तैयार करें160 डिग्री सेल्सियस ≤ डी कप
4. स्थानांतरण (quickly!) माइक्रोस्कोप से ठंडा cryoholder वर्कस्टेशन क्रायो लिए. धारक की ठंढ ढाल लेना.
5. एलएन ₂ cryoworkstation के काम की मेज पर भंडारण और जगह से एक ग्रिड सैंडविच के तहत निकालते हैं. धारक का नमूना अच्छी तरह के लिए एक बनाए रखने की अंगूठी भी मेज पर रख दिया गया है.
6. ईण्डीयुम लिफाफा खुला और cryoholder का नमूना अच्छी तरह से करने के लिए संलग्न तह ग्रिड चाल है. पाना उपकरण प्रदान की है और ठंढ ढाल बंद का उपयोग अंगूठी बनाए रखने के साथ ग्रिड सुरक्षित.
7. जल्दी cryoworkstation से cryoholder हटाने और माइक्रोस्कोप के airlock में डालने और जितना ज्यादा हो सके पंप दृश्य के माध्यम से जाना. घुसाने, स्तंभ निर्वात की न्यूनतम विघटन होना चाहिए.
8. 0 ° झुकाव को गोनियोमीटर लौटें. जोड़ने और नियंत्रण बॉक्स reenergize और नमूना तापमान 150 डिग्री सेल्सियस ≤ है कि पुष्टि
9. के देवर से भरनाधारक नमूना और वैक्यूम और तापमान पूरी तरह से ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं.

4. धारा के दृश्य सर्वेक्षण

1. नमूना बेनकाब और इलेक्ट्रॉन बीम को चालू करने के लिए धारक की ठंढ ढाल लेना.
2. दिखने में कम बढ़ाई, आमतौर पर 250X, और कम रोशनी में नमूना का मूल्यांकन. चित्रा 1 में सचित्र, वर्गों पतली और चिकनी, तह नहीं या अतिव्यापी, फ्लैट और अच्छी तरह से समर्थन फिल्म से जुड़ी हो, और आम तौर पर ग्रिड सलाखों से छिप नहीं होना चाहिए.
3. वैकल्पिक रूप से चयनित वर्गों तस्वीर. (नोट: जमे हुए हाइड्रेटेड वर्गों किरण प्रेरित नुकसान को बहुत जल्दी हो जाता है के बाद से, किरण जोखिम को कम.) चयनित वर्गों के निर्देशांक संग्रहीत करने के लिए स्वचालित डिजिटल गोनियोमीटर मंच का उपयोग करें.

5. धारा के फ्रीज सुखाने

1. फ्रीज शुष्क वर्गों सीए करने धारक तापमान में वृद्धि से. ~ 30 मिनट के लिए -100 डिग्री सेल्सियस.
2. नीचे -160 डिग्री सेल्सियस या धारक Recool.

6. कोशिकाओं और अंगों की इमेजिंग

फ्रीज सूखे वर्गों की संरचनात्मक छवियों सीए में प्राप्त कर रहे हैं. -160 डिग्री सेल्सियस के रूप में कम खुराक, उपयुक्त सॉफ्टवेयर के द्वारा नियंत्रित एक 2k एक्स 2k धीमी गति से स्कैन सीसीडी कैमरे का उपयोग कर डिजिटल रूप में रिकार्ड शून्य नुकसान छवियाँ.

1. हाय पत्रिका मोड में ईएम सक्रिय करें.
2. चुनें और छवि ~ 2,000 एक्स पर (झगड़े के रूप में, चित्रा 2 देखें) चयनित कोशिकाओं और जिसका स्थानों पहले से रिकॉर्ड और संग्रहीत किया गया है उच्च गुणवत्ता वाले वर्गों में ब्याज के subcellular क्षेत्रों. (नोट: सूखे वर्गों अब काफी हद तक कम नाजुक और इलेक्ट्रॉन बीम क्षति को कम संभावना है.
3. एक्स - रे विश्लेषण के लिए ब्याज के क्षेत्रों (ROIs) का चयन करने के क्रम में छवियों का मूल्यांकन. यह कदम वैकल्पिक रूप से बंद लाइन प्रदर्शन किया, उन्हें दिया जा सकता है, जो मामले में किया जा सकता हैबंद और कमरे के तापमान को गर्म करने के लिए अनुमति दी नमूना.

7. एक्स - रे स्पेक्ट्रा का अधिग्रहण

एक्स - रे स्पेक्ट्रा में से किसी का उपयोग कर दर्ज किया जा सकता है कई वाणिज्यिक या कस्टम डिजाइन एक्स - रे न्यूनतम एक ऊर्जा फैलानेवाला एक्स - रे (EDX) डिटेक्टर, जुड़े नाड़ी प्रोसेसर इलेक्ट्रॉनिक्स और संगत अधिग्रहण और प्रदर्शन सॉफ्टवेयर से मिलकर विश्लेषण प्रणाली. (इस प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता प्रणाली तालिका 1 में वर्णित है.)

1. , स्तंभ (यदि आवश्यक हो) में EDX डिटेक्टर डालने उद्देश्य एपर्चर वापस लेने, और किसी भी आवारा विकिरण apertures डालने और केंद्रित द्वारा एक्स - रे के अधिग्रहण के लिए EM विन्यास करें. नमूना की ठंढ संदूषण से बचा जाता है, जिस पर सबसे कम तापमान cryoholder समायोजित करें, लेकिन कम से कम -100 डिग्री सेल्सियस नीचे
2. धारक डिटेक्टर की ओर 20 ° झुकाव.
3. व्यापक क्षेत्र इमेजिंग शर्तों के तहत, और एक एक individua की मैट्रिक्स का विश्लेषण करने का इरादा रखता संभालनेएल mitochondria, विश्लेषण के लिए एक माइटोकांड्रिया चयन क्षेत्र के केंद्र के लिए यह कदम और ध्यान.
4. (कुछ सूक्ष्मदर्शी पर सिर्फ दूसरा कंडेनसर फोकस का उपयोग किरण एकाग्र) हाजिर मोड के पास जाकर एक 100 एनएम स्थान में (एक फैराडे कप या इसी तरह से मापा के रूप में). 3 NA सीए करने के लिए बीम वर्तमान में वृद्धि.
5. स्पेक्ट्रम अधिग्रहण सॉफ्टवेयर लॉन्च और प्रदर्शन की निगरानी पर रहते समय देखा जा सकता है जो 100 सेकंड अधिग्रहण शुरू करते हैं. दर्ज स्पेक्ट्रम (चित्रा 2) सहेजें. उद्योग मानक EMSA प्रारूप पसंद है.
6. उन्हें नीचे रहो और एक (ऑफलाइन) विश्लेषण कार्य केंद्र से कई स्पेक्ट्रा फ़ाइल (ओं) को हस्तांतरण.

8. एक्स - रे स्पेक्ट्रा का विश्लेषण

गुणात्मक विश्लेषण

एक EDX स्पेक्ट्रम (चित्रा 2, इनसेट) अनिवार्य रूप से ऊर्जा बनाम एक्स - रे तीव्रता का एक XY साजिश है. स्पेक्ट्रा टी की मौलिक रचना के बारे में गुणात्मक और मात्रात्मक जानकारी होती हैएक चोटी के "लक्षण" ऊर्जा तीव्रता उस तत्व की मात्रा को दर्शाता है, जबकि उस शिखर को जन्म देने के तत्व की पहचान करता है में वह मात्रा का विश्लेषण किया. विशेषता चोटियों एक धीरे बदलती पृष्ठभूमि, "सातत्य" के शीर्ष पर सवारी. (2 चित्र कथा आगे EDX स्पेक्ट्रा की मुख्य विवरण पर चर्चा.) पूरे आवर्त सारणी के लिए चोटी के manifolds ऊर्जा तत्वों के प्रसिद्ध इलेक्ट्रॉनिक संरचना, स्वतः के घटकों की पहचान करता है एक डेटाबेस के लिए इस प्रकार सभी EDX सॉफ्टवेयर लिंक द्वारा परिभाषित कर रहे हैं एक analyte. एक शारीरिक संदर्भ में, EDX विश्लेषण करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं कि सामान्य ब्याज के तत्वों ना (1.04 कीव में कश्मीर _α), पी (2.01 कीव), कश्मीर (3.31 कीव), और सीए (3.69 कीव) शामिल हैं.

1. स्पेक्ट्रा में प्रमुख तत्वों की पहचान करने के लिए उपलब्ध सॉफ्टवेयर डेटाबेस और शिखर मिलान दिनचर्या का लाभ उठाएं. एक जैविक नमूने में ना, मिलीग्राम, पी, एस, क्लोरीन, कश्मीर, और क्षमताओं के लिए चोटियों पाने की उम्मीद. (चेतावनी:पिछले दो तत्वों ओवरलैप!)

मात्रात्मक विश्लेषण

EDX स्पेक्ट्रा के मात्रात्मक विश्लेषण की पहचान की चोटियों के एकीकृत क्षेत्र निकालने और एकाग्रता के लिए यह मान परिवर्तित करने के होते हैं. जैविक विश्लेषण के लिए, स्थापित दृष्टिकोण (ऊपर और चित्रा 2 में परिभाषित) सातत्य की तीव्रता का विश्लेषण मात्रा के सूखे जन के लिए आनुपातिक है कि इस तथ्य का लाभ लेता है जो हॉल शिखर / सातत्य विधि ^4,7,10, है . ज्ञात रचना के मानकों के स्पेक्ट्रा में यही अनुपात की तुलना में जब इस प्रकार, शिखर क्षेत्र / सातत्य क्षेत्र का अनुपात, लक्षित, सेलुलर डिब्बे में एकाग्रता निर्दिष्ट करता है. इस दृष्टिकोण आमतौर mmol / किलो सूखी वजन के रूप में व्यक्त वजन प्रति मोल, की इकाइयों में सांद्रता प्रदान करता है कि ध्यान दें. इस इकाई असामान्य है और व्याख्या के लिए एल के रूप में वर्णित है, उदाहरण के लिए, mmol / एल गीला वजन या mmol / मिलीग्राम प्रोटीन, को अतिरिक्त रूपांतरण की आवश्यकता हो सकती^4,10 sewhere.

2. जेड = 10-20 के बीच जैविक तत्वों (0.5-4.0 कीव) के शिखर क्षेत्रों (और त्रुटि अनुमान) निकालें, यानी ना, मिलीग्राम, पी, एस, क्लोरीन, कश्मीर, और सीए, विश्लेषण में निर्मित फिटिंग दिनचर्या में से एक का उपयोग सॉफ्टवेयर (विशेष रूप से 4 फुटनोट, 1 टेबल देखें). इस प्रयोगशाला सिंप्लेक्स या एकाधिक कम से कम वर्ग फिटिंग का उपयोग करता है. इस फिटिंग कश्मीर और सीए चोटियों के बीच ओवरलैप (देखें चित्र 2) को हल करने के लिए सावधान ध्यान देने की आवश्यकता है कि ध्यान दें.
3. 1.45-1.61 कीव के बीच सातत्य एकीकृत. वैकल्पिक हस्तक्षेप से मुक्त क्षेत्रों में इस्तेमाल किया जा सकता है.
4. मानकों की तुलना द्वारा फिर शिखर / सातत्य अनुपात और सांद्रता की गणना. विश्लेषण के दौरान त्रुटियों प्रचार.
5. जैविक परिवर्तनशीलता प्रतिबिंबित कि मूविंग अनुमान लगाने के लिए मानक सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर और सूत्रों का उपयोग करें.

Representative Results

मस्तिष्क कोशिकाओं को आमतौर पर इस्कीमिक स्थितियों के कारण होती है कि रोग neurotransmitter रिहाई का एक परिणाम के रूप में excitotoxic चोट बनाए. EPMA कैल्शियम की भारी मात्रा में पृथक neuronal mitochondria की क्षमता चोट के तंत्र का आधार कैसे खोज के लिए महत्वपूर्ण था. चित्रा 3 में इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ तेजी से एक excitotoxic प्रोत्साहन (100 माइक्रोन NMDA) के लिए 30 मिनट के प्रदर्शन के बाद जमे हुए संवर्धित hippocampal न्यूरॉन्स के फ्रीज सूखे cryosections में mitochondria की उपस्थिति दिखाता है. वे अत्यधिक सूजी हुई हैं और छोटे, अंधेरे समावेशन (लाल तीर) होते ही अधिकांश mitochondria, संरचनात्मक रूप से क्षतिग्रस्त हो दिखाई देते हैं. Mitochondrial समावेशन (चित्रा 3, लाल और नीले रंग की स्पेक्ट्रा, क्रमशः) के भीतर और ("द मैट्रिक्स ') की विशेष मौलिक विश्लेषण करने के लिए पर्याप्त संकल्प किया है जो EPMA, समावेशन काफी हद तक कैल्शियम और फास्फोरस से बना रहे हैं कि पता चला. अत्यंत उच्च कैल्शियम चोरइन समावेशन के तम्बू - ~ 1300 mmol / किलो सूखी वजन, जबकि <1 mmol / किलो mitochondria आराम की खासियत है - उनके असाधारण कैल्शियम बफरिंग क्षमता बताते हैं, और क्यों भारी इस बफरिंग तंत्र कैल्शियम अधिभार ट्रिगर कोशिका मृत्यु ¹¹ की ओर जाता है.

हिप्पोकैम्पस, सीखने और स्मृति के लिए महत्वपूर्ण मस्तिष्क के एक क्षेत्र, ischemia के बाद चोट का एक प्रमुख स्थल है. दिलचस्प है, और therapeutically महत्वपूर्ण, सीए 3 नामित कार्यात्मक अलग क्षेत्र में अब तक कम चपेट में इस्कीमिक चोट से सटे, synaptically जुड़े सीए 1 क्षेत्र है से है. EMPA विश्लेषण - सीटू संरचना और समारोह (चित्रा 4, माइक्रोग्राफ) में बनाये रखने hippocampal स्लाइस के विशिष्ट क्षेत्रों की cryosections के साथ संयोजन के रूप में - विषाक्त उत्तेजनाओं (प्रतिरोधी आसन्न सीए 3 न्यूरॉन्स की तुलना में कमजोर सीए 1 न्यूरॉन्स में बहुत बड़ा कैल्शियम उन्नयन प्रेरित बताते हैं कि करने के लिए इस्तेमाल किया गया था चित्रा 4, बार ग्राफ). नतीजतन, सीए 1 mitochon dria सीए ^{2 +} अधिभार प्रेरित mitochondrial रोग सीए 1 न्यूरॉन्स ¹³ के चुनिंदा जोखिम में एक निर्धारण कारक है यह दर्शाता है कि व्यापक चोट और शिथिलता दिखा रहे हैं.

चित्रा 1. एक pioloform फिल्म पर समर्थित जमी हाइड्रेटेड cryosections की दो रिबन की कम बढ़ाई इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ. एक अच्छी तैयारी के लक्षण फ्लैट, अच्छी तरह से जुड़ा हुआ है, न्यूनतम खंडित वर्गों सहित, सचित्र हैं. फिल्म इलेक्ट्रॉन बीम के तहत आगे आँसू के रूप में समर्थन फिल्म में rips के साथ ग्रिड वर्गों, बचा जाना चाहिए. विश्लेषण के लिए पूरी तरह से उपयुक्त दो चौकों तारों से संकेत कर रहे हैं. = 100 माइक्रोन स्केल बार.

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चित्रा 2. EPMA द्वारा organelle मौलिक रचना. कम खुराक के मात्रात्मक विश्लेषण, तेजी से जमे हुए नियंत्रण नाड़ीग्रन्थि से तैयार एक फ्रीज सूखे cryosection में सहानुभूति न्यूरॉन की डिजिटल स्कैनिंग संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ ऐसे नमूनों में प्राप्त विस्तार दिखाता है. तेज प्लाज्मा झिल्ली, जालिका और प्रचुर मात्रा में mitochondria की अच्छी तरह से संरक्षित ढेर नोट इनसेट -. लाल डॉट द्वारा संकेत के रूप में, mitochondrial मैट्रिक्स के एक विशिष्ट क्षेत्र से दर्ज EDX स्पेक्ट्रम. प्रमुख कश्मीर खोल एक्स - रे चोटियों को इसी तत्वों की पहचान कर रहे हैं, पोटेशियम और कैल्शियम के मामले में, विकल्प इलेक्ट्रॉनिक संक्रमण से उत्पन्न होने वाली दो कश्मीर खोल लाइनों हल कर रहे हैं, कश्मीर _α और कश्मीर के रूप में संकेत दिया _β मानक स्पेक्ट्रोस्कोपी अंकन के अनुसार. स्पेक्ट्रम न्यूरॉन्स में रहने वाले प्रमुख तत्वों की ठेठ वितरण दिखाता है. इस सेलुलर डिब्बे की जन घनत्व को दर्शाता है जो जैसे 1.5-1.8 या 2.8-3.1 कीव के बीच धीरे - धीरे बदलती सातत्य विकिरण,, ध्यान दें. स्वस्थ कोशिकाओं में कैल्शियम की मात्रात्मक विश्लेषण चोटियों _α पोटेशियम कश्मीर _β और कैल्शियम कश्मीर के ओवरलैप को जन्म देता है जो पोटेशियम (150 मिमी के लगभग समान सीए. 500 mmol / किलो सूखी वजन,), के अपेक्षाकृत उच्च स्तर की उपस्थिति से जटिल है EDX स्पेक्ट्रम में. इस ओवरलैप deconvolving के लिए मानक एल्गोरिदम रहे हैं. स्केल बार 1 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है.

चित्रा 3. Excitotoxic उत्तेजना व्यक्तिगत mitochondria में चर और स्थानीय कैल्शियम संचय लाती है. फ्रीज सूखे cryosection के डिजिटल संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ से तैयार unfixed, तेजी से जमे हुए हिप्पोकैम्पस सेल संस्कृति ग्लूटामेट रिसेप्टर्स (30 मिनट के लिए 100 माइक्रोन NMDA) के NMDA उप प्रकार के excitotoxic उत्तेजना के बाद छोटे, स्वाभाविक रूप से इलेक्ट्रॉन घने, कबरा समावेशन (लाल तीर) युक्त कई mitochondria से पता चलता है. इसी एक्स - रे स्पेक्ट्रा वृद्धि हुई ना शिखर इसका सबूत है और शामिल किए जाने से मुक्त mitochondrial मैट्रिक्स (नीले तीर और स्पेक्ट्रम) में कश्मीर शिखर कम के रूप में विषाक्त उत्तेजना, आयन homeostasis के नुकसान के परिणामस्वरूप है कि प्रदर्शित करता है. लाल स्पेक्ट्रम में बड़े सीए शिखर भी फास्फोरस और ऑक्सीजन की बड़ी मात्रा में होते हैं जो विशेषता समावेशन, के लिए स्थानीय मजबूत mitochondrial कैल्शियम संचय को दर्शाता है. समावेशन और matrices में औसत सीए एकाग्रता क्रमश: ~ 1300 और ~ 60 mmol / किलो सूखी वजन था. स्केल बार 500 एनएम का प्रतिनिधित्व करता है.

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चित्रा 4. Mitochondrial कैल्शियम अधिभार हिप्पोकैम्पस सीए 1 न्यूरॉन्स के चयनात्मक इस्कीमिक जोखिम के लिए जिम्मेदार है बाईं पैनल -. तेजी ischemia नकल उतार शर्तों (100 माइक्रोन NMDA) के तहत जमे हुए एक organotypic hippocampal टुकड़ा संस्कृति, के सीए 3 और सीए 1 क्षेत्रों में सेल शरीर के cryosections की इलेक्ट्रॉन micrographs. सही पैनल - EPMA mitochondrial कैल्शियम की मात्रा का विश्लेषण करती रासायनिक ischemia (*, पी <NMDA उजागर सीए 1 के लिए 0.05 के सापेक्ष) आसन्न, ischemia प्रतिरोधी सीए 3 न्यूरॉन्स की तुलना में कमजोर सीए 1 न्यूरॉन्स के mitochondria में बहुत बड़ा कैल्शियम उन्नयन लाती है कि दिखाता है. NMDA प्रेरित कैल्शियम अधिभार NMDAR प्रतिपक्षी एम 801 द्वारा समाप्त कर दिया गया था. स्केल बार 2 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है.

Discussion

इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप आधारित विश्लेषणात्मक विधि यहाँ प्रस्तुत पहचान का पता लगाने, और ना, कश्मीर, पी, और विशेष रूप से सीए सहित जैविक हित के कई तत्वों के quantitation के लिए अनुमति देता है. ये विश्लेषण, subcellular पर बाहर किया जा सकता है यानी, अंतर organelle, तेजी से जमे हुए नमूनों से तैयार cryosections के उच्च गुणवत्ता वाले चित्रों में ब्याज की संरचनाओं का पता लगाने और पहचान करने की क्षमता के कारण संकल्प. कोई धुंधला ऊतक तत्वों के स्थान मात्रात्मक संरक्षित है भी है, जबकि पारंपरिक तय, प्लास्टिक में एम्बेडेड तैयारी के लिए संरचनात्मक गुणवत्ता में तुलनीय इलेक्ट्रॉन छवियों को रिकार्ड करने के लिए आवश्यक है कि ध्यान दें.

संरचनात्मक सर्वेक्षण छवियों कम एप्लाइड इलेक्ट्रॉन खुराक में दर्ज कर रहे हैं, बहुत ज्यादा खुराक लेने से अच्छा आँकड़े प्राप्त करने के लिए पर्याप्त गिनती दरों पर एक्स - रे उत्सर्जन को प्रकाश में लाना आवश्यक है. इसलिए, Empa के लिए उपयोगी एक खुर्दबीन एक उच्च वर्तमान केंद्रित जांच बनाने में सक्षम होना चाहिए, 2-5 ना25-50 एनएम में, ईआर cisternae या synaptic vesicles तरह organelles को शामिल करने के लिए उपयुक्त, स्वीकार्य है. यह न्यूनतम एक उच्च चमक लेण्टेनियुम hexaboride इलेक्ट्रॉन बंदूक की आवश्यकता है. इन वाद्य शर्तों के तहत, 1-10 mmol / किलो सूखी वजन के विशिष्ट ऊतक सांद्रता में कैल्शियम मात्रात्मक ~ 100 सेकंड रहते समय में ± 0.1 mmol / किलो के एक मानक त्रुटि के लिए विश्लेषण किया जा सकता है. यह एक छोटी सी पोटेशियम लाइन के साथ प्रमुख कैल्शियम एक्स - रे लाइन की दुर्भाग्यपूर्ण ओवरलैप के लिए नहीं थे, तो कैल्शियम विश्लेषण की संवेदनशीलता काफी सुधार किया जाएगा, deconvolution जिनमें से महत्वपूर्ण अनिश्चितता (चित्रा 1 किंवदंती देखने कैल्शियम संकेत के एकीकरण के लिए कहते हैं विवरण). शारीरिक, और विशेष रूप से रोग, mitochondrial कैल्शियम संचय (आंकड़े 2-3) के दौरान होता है के रूप में स्थानीय कैल्शियम की सांद्रता, असामान्य रूप से उच्च रहे हैं जब वर्णित सीमा की स्थिति बहुत आराम कर रहे हैं ध्यान दें.

कई सफल होने के बावजूदउल अनुप्रयोगों, यह EPMA एक विशेष रूप से कुशल तकनीक नहीं है, तो डेटा throughput में सुधार करने के लिए अधिक प्रोत्साहन है कि स्पष्ट है. तीन होनहार रास्ते यहाँ उल्लेख कर रहे हैं: बजाय EDX का 1) इलेक्ट्रॉन ऊर्जा नुकसान स्पेक्ट्रोस्कोपी (मछली), 2) 2 डी तत्व के बजाय बिंदु जांच के नक्शे, और 3), नए राज्य के अत्याधुनिक उपकरण. बल्कि उत्सर्जित एक्स - रे का संग्रह से, मछली इलेक्ट्रॉन / एटम collisions के बाद ऊर्जा की विशेषता, तत्व विशेष मात्रा में खो दिया है कि घटना इलेक्ट्रॉनों रिकॉर्डिंग पर निर्भर करता है. सांख्यिकीय, मछली EDX से स्वाभाविक ~ 4x बेहतर है, और हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर अब व्यावहारिक रूप से जीव के लिए परिपक्व हैं ईल. (जीव विज्ञान में मछली आवेदनों की समीक्षा के लिए संदर्भ ^{6, 2} देखें.)

सुधार संवेदनशीलता मछली द्वारा की पेशकश की - और भी नए उच्च throughput सी बहाव EDX डिटेक्टरों से, नीचे देखें - अनुमति देता विश्लेषण कम प्रति ध्यान केन्द्रित करना टाइम्स, जैसे मिसे के बजाय घंटेसेकंड undreds, और इसलिए उचित समय में चयनित क्षेत्रों के डिजिटल नक्शे उत्पन्न करने की क्षमता. एक उदाहरण के रूप में, एक 128 x 128 कैल्शियम का नक्शा ~ 1 घंटा ¹ में दर्ज किया जा सकता है. "स्पेक्ट्रम इमेजिंग" ^6,2 के रूप में जाना जाता है यह दृष्टिकोण, प्रत्येक पिक्सेल पर एक पूर्ण मछली स्पेक्ट्रम प्रदान करता है, इसलिए कई तत्वों पर जानकारी दर्ज "डेटा घन" में अंतर्निहित है कि नोट (एक्स बनाम.. ई बनाम वाई).

अन्त में, प्रोटोकॉल खंड में वर्णित के रूप में, 20 साल पहले विकसित किया गया था, वर्तमान प्रणाली के बाद से साधन प्रौद्योगिकी और प्रदर्शन में ठोस प्रगति की गई है. राज्य के अत्याधुनिक आज स्थापना की जा रही एक EMPA प्रयोगशाला में डी rigueur होगा कि प्रौद्योगिकी में शामिल होगा: subnanometer आकार के धब्बे में वर्तमान के कई nanoamps (एनए) पंप कर सकते हैं कि 1) एक उच्च चमक क्षेत्र के उत्सर्जन बंदूक, 2 ) एक बड़े क्षेत्र सिलिकॉन बहाव अधिकतम एक्स - रे संग्रह क्षमता और throughput ⁸ डिटेक्टर, और 3) आधुनिक सॉफ्टवेयरवर्णक्रमीय अधिग्रहण, विश्लेषण और quantitation के लिए बेहतर लचीलापन और प्रदर्शन की पेशकश की. इस तरह के सॉफ्टवेयर संकुल सबसे निर्माताओं से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, वैकल्पिक रूप से, DTSA सॉफ्टवेयर, DTSA द्वितीय, का एक अद्यतन और उन्नत संस्करण (1 टेबल, फुटनोट 4 देखें) NIST से कोई भी कीमत पर उपलब्ध है. बस वर्णित सुविधाओं आधार इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप पर उपलब्ध किसी भी स्वचालन और / या रोबोटिक्स के शीर्ष पर हैं.

के रूप में वर्णित EMPA प्रोटोकॉल neurodegeneration के सेलुलर तंत्र प्रकट करने के लिए, उदाहरण के लिए, की मदद करने, neuroscientists के हित के कई मुद्दों पर हमला करने के लिए अपने आप में बेहद उपयोगी साबित हो गया है. सिर्फ सिफारिश सुधार को देखते हुए, Empa भविष्य के अनुसंधान के लिए एक ठोस योगदान हो जारी रखना चाहिए.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS/MATERIALS
Thermanox plastic coverslips	Thermo Fischer Scientific	72280
Culture inserts	BD Falcon	353090	For 6-well plates
Cryopins	Leica Microsystems	16701952	Grooved
Wood applicators	EM Sciences	72300
Folding EM grids	Ted Pella	4GC100/100	100 mesh
Indium foil	Alfa Aesar	13982	0.25 mm thick
EQUIPMENT
Plunge freezing device	Leica Microsystems	KF-80
Slam freezing device	LifeCell	CF-100
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC6
Cryoattachment for microtome	Leica Microsystems	FC6
Diamond cryotrimming tool	Diatome	Cryotrim 45
Diamond cryoknife	Diatome	Cryo 35
Antistatic device	Diatome	Hauf Static Line
Cryo electron microscope	Carl Zeiss Microscopy	EM912 Omega
EM cryo specimen holder	Gatan	CT3500
Slow-scan CCD camera, 2k x 2k	Troendle (TRS)	Sharpeye
Image acquisition software	Olympus SIS	iTEM suite
ED x-ray detector	Oxford Instruments	Linksystem Pentafet
Pulse Processor	Oxford Instruments	XP-3
PCI backplane card	4pi Systems	Spectral Engine II
Desktop computer	Apple	Any OS9-compatible model
X-ray analysis software	NIST	DTSA, DTSA II
Spreadsheet software	Microsoft	Excel
The CF100 is no longer sold commercially, although the machine is available at many academic facilities, and complete machines or parts can be found on-line. A video tutorial for the CT3500 cryotransfer holder is available at http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4. The SEII is obsolete; the Universal Spectral Engine Is a later, PC-compatible product with comparable functionality. 4pi has ceased manufacturing and sales but still provides technical customer support. Used systems are often found online. The original DTSA is now obsolete. NIST offers in the public domain an updated successor, DTSA II 12 (http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm)