Måling av Total Kalsium i nevroner ved elektron Probe røntgenmikroanalyse

Summary

Dette notatet beskriver anvendelsen av cryoanalytical elektronmikroskopi til kvantitativ måling av total kalsium innhold og distribusjon på subcellulære oppløsning i fysiologisk definerte biologiske prøver.

Abstract

I denne artikkelen verktøyene, teknikker og instrumenter som er egnet for kvantitative målinger av intracellulært elementært innhold ved hjelp av den teknikk som kalles elektronsonde mikroanalyse (EPMA) er beskrevet. Intramitochondrial kalsium er et særlig fokus på grunn av den kritiske rollen som mitokondrie kalsium overbelastning spiller i nevrodegenerative sykdommer. Metoden er basert på analyse av røntgenstråler generert i et elektronmikroskop (EM) ved samvirke av en elektronstråle med prøven. For å opprettholde den opprinnelige fordeling av diffunderbare elementer i elektronmikroskopi prøver, krever EPMA "cryofixation" av vevet etterfulgt av fremstilling av ultratynne cryosections. Rask frysing av dyrkede celler eller organotypic skive kulturer utføres av plunge frysing i flytende etan eller slam frysing mot en kald metallblokk, henholdsvis. Cryosections nominelt 80 nm tykk er kuttet tørr med en diamant kniv på ca. -16076, C, montert på karbon / pioloform belagt kobber nett, og cryotransferred inn en Cryo-EM ved hjelp av en spesialisert cryospecimen holderen. Etter visuell undersøkelse og plassering kartlegging ved ≤ -160 ° C og lav elektron dose, frosne hydrert cryosections er frysetørket ved -100 ° C i ~ 30 minutter. Organelle nivå av tørkede cryosections blir registrert, også ved lav dose, ved hjelp av en treg-scan CCD-kamera og subcellulære regioner av interesse er valgt for analyse. X-stråler som sendes ut fra ROIs av et stasjonært, fokusert av høy intensitet elektronsonde blir samlet av en energi-dispersiv røntgen (EDX) spektrometer, behandlet med tilhørende elektronikk, og presentert som et røntgenspekteret, det vil si, et tomt på X-ray intensitet vs energi. Ytterligere programvaren muliggjør: 1) identifikasjon av elementkomponenter ved sine "karakteristisk" peak energier og fingeravtrykk, og 2) kvantitativ analyse ved ekstraksjon av topparealene / bakgrunn. Dette papiret konkluderer med to eksempler som illustrerer typiskeEPMA applikasjoner, en der mitokondrie kalsium analyse gitt viktig innsikt i mekanismene for eksitotoksiske skader og en annen som avslørte basis av iskemi motstand.

Introduction

Kalsiumioner er uten tvil den viktigste og allsidig celle signalisering enhet i biologi, som spiller en viktig rolle i normale prosesser så forskjellige som synaptisk overføring og genuttrykk. På den annen side er kalsium like viktig i celledød. Spesielt er kalsium deregulering en nøkkelfaktor i nevronale skader i hjerneslag, Parkinsons, Alzheimers og andre nevrodegenerative sykdommer ^3,5. Således er det av avgjørende betydning å forstå kvantitativt hvor kalsium er fordelt i celler, og hvor dette forandrer følgende fysiologiske eller pato-fysiologiske stimuli. Dette målet er komplisert ved det faktum at kalsium blir dynamisk fordelt mellom to fysiske tilstander - frie i oppløsning eller bundet til et substrat - og det cellulære kalsiumkonsentrasjonen endrer seg over flere størrelsesordener som følge av stimulering.

Mens det er flere avanserte metoder som er tilgjengelige for analyse av free intracellulært kalsium, er bestemmelse av total kalsiumkonsentrasjoner i definerte intracellulære rom realistisk begrenset til en metode, nemlig elektron probe mikroanalyse (EPMA). EPMA er en teknikk som par et røntgen spektrometer i et transmisjonselektronmikroskop (TEM). Den TEM elektronkanon fokuserer et stasjonært, submikron elektron-probe på en subcellulære området av interesse og elementspesifikke røntgenstråler som sendes ut som følge av elektron-bombardement blir samlet og analysert (se referanser ^{7, 4} for detaljerte tekniske vurderinger). Fordeler med EPMA inkluderer enkelt organelle-nivå oppløsning og submillimolar følsomhet. I praksis krever imidlertid EPMA spesialiserte cryotechniques og instrumentering for prøven fremstilling og analyse. Her er verktøy, teknikker og instrumenter som egner seg for målinger av intracellulært kalsium hjelp EPMA beskrevet. Intramitochondrial kalsium er spesielt interest på grunn av den kritiske rollen som mitokondrie kalsium overbelastning spiller i nevrodegenerative sykdommer.

Protocol

Den tilnærmingen som er beskrevet her ble utviklet ved hjelp av spesifikke instrumenter, verktøy og programvare. Fordi labs ikke skal bruke den samme eksperimentelle oppsettet tilnærmingen er generalisert der det er mulig.

En. Rapid Frysing

Den analytiske fremgangsmåte som skal beskrives er helt avhengig av kryogeniske metoder for: 1) "cryofixation» av celler eller vev på en måte som bevarer kvantitativt fordelingen av diffunderbart vevskomponenter og kjemiske elementer som de var i levende celler i det øyeblikket for frysing , og 2) ved fremstilling av ultratynne cryosections egner seg for avbildning og analyse i en TEM. Disse teknikkene er kort beskrevet her, men detaljer er nødvendig for å reprodusere disse prosedyrene i andre laboratorier er utenfor rammen av denne artikkelen. Interesserte lesere henvises til gode siste artiklene ^9,14.

Advarsel: Denne delen beskriver bruk av liquefied etan, noe som er meget brannfarlig og eksplosiv, nødvendige forholdsregler bør tas. Operatøren må også være kjent med flytende nitrogen (LN ₂₎ sikkerhetsregler, herunder laboratoriefrakk, briller, og cryoresistant hansker. Merk: Her og hele, alle verktøy (tang, osv.) brukes til å håndtere frosne prøver må precooled i LN _to før bruk for å unngå utilsiktet tining.

Dyrkede celler på dekkglass

1. Forbered en dukkert frysing enhet ved kondenserende gass etan på -160 ° C i LN _to avkjølt sentral godt. Fyll opp til merket og dekke godt med svingbare aluminium lokk når den ikke er i bruk.
2. Ved hjelp av filter papir kiler, blot plast Dekk av dyrkede celler under eksperimentelt egnede forhold til en tynn vandig film. Blot fra kanten for å unngå å berøre vevet, den ideelle rest film, bestemmes ved prøving og feiling, er så tynn som mulig, men ikke så thi å fordampe og tillate tørking av vevet underlag.
3. Holder dekkglass ved kanten med klem tang, raskt dyppe i flytende etan, enten manuelt eller ved hjelp av tyngdekraften drevne stempelet.
4. Plasser den frosne dekkglass i en nærliggende styrofoam bolle med LN _to, store nok til å manipulere det ønskede antall Dekk inn i langsiktige lagercontainere. Aluminium skrukork bokser som ikke gripe etter LN _to anbefales.

Rapid frysing av dyrkede hjernen skiver

5. Under en dissekere mikroskop, visning og orientere en organotypic hippocampus skive, usjenert og fortsatt festet til kultur membran innsatsen. Plasser fiducial merker på membranen nær kanten av skiven med en svart Sharpie-type penn og fotografi.
6. Fortsatt under mikroskopet, kuttet ut ca. 5 x 5 mm membran firkanter med enkeltsektorer sentrert på rutene. Unngå å ta på skive eller bøye membrane.
7. Monter en membran-støttet skive, dempet av en ¼ i diameter agar pad, på en spesialdesignet aluminium disk laget for å passe en cryoultramicrotome (beskrevet nedenfor). Raskt fryse stykket ved pneumatisk propelling det mot en LN _to kjølt safir blokken ved hjelp av en tilpasset "slam frysing" enhet.
8. Flytt til lagring som beskrevet for dyrkede celler.

2. Frysesnitt

PÅMINNELSE: Vellykket produsere tørr-kutt bånd av supertynne seksjoner, mens enkelt og logisk, krever trening, tålmodighet og betydelig praksis.

1. Bake ut en cryoultramicrotome utstyrt med en cryoattachment og avkjøl til -135 ° C.
2. Skjær frosne Dekk inn ca. 3 x 3 mm firkanter ved hjelp av en skarp, precooled skalpell. Bygge inn stykker med kulturer som vender opp i en viskøs væske "cryoglue" (en 01:06 blanding av etanol og 2-propanol, ^11), den standard 3mm diameter aluminiums pins designet for å passe mikrotomen prøven chuck. Unngå lekker cryoglue på kultur overflaten. Stivne cryoglue ved å senke cryobox temperaturen til ≤ -160 ° C.
   • For frosne hjerneskiver, sikkert feste platene direkte til en spesiallaget prøve chucken ved hjelp av en skruekragen.
3. Trim utvalgte områder av frosne prøver - for eksempel cellerike områder av dekk stykker eller identifiserte områder av skiver - til en ca. 250 x 250 mikrometer blokk ansikt og ~ 100 mikrometer dybde ved hjelp av en diamant trimming verktøy.
4. Tørr snitt bånd av tynne seksjoner på ca. -160 ° C ved bruk av en 35 ° diamant cryoknife, i det vesentlige som beskrevet i referencs ^{4, 9..} Skjærehastighet og kniv klaringsvinkel bestemmes empirisk, et godt utgangspunkt er 0,4-0,6 mm / sek ved 9 °. Den nominelle tykkelse, dvs. prøve forhånd, av hydrerte seksjoner ier typisk 80 nm, selv om deler er faktisk 1.5-2.0x tykkere, hovedsakelig på grunn av kompresjon. For tilfredsstillende seksjonering, er en antistatisk enhet avgjørende. Plasser ioniserende tuppen av enhets 0,5-1 cm fra kniveggen og justere utgangseffekt inntil tilfredsstillende bånd av delene er produsert.
5. Forbered øyenvippe prober ved å lime (med epoxy) øyevipper til tre applikasjonsnåler. Ved hjelp av en slik sonde, plukke opp og overføre deler fra baksiden av kniven bort på gløde-utladet, karbon-belagt pioloform støtte filmer støpt over 100 mesh folding kobbernett og hviler på en halv-brettet indium folie konvolutt på et arbeids hylle bak kniven. Brett over den øverste halvdelen av rutenettet og konvolutt, trykk med en kaldpressing verktøy.
6. Overfør innpakket nett til en praktisk grid boks og oppbevar i en aluminium kan som beskrevet i trinn 1.4.

Tre. Cryotransfer av prøver til Electron Microscope

Kjernen instrument for EPMAi dette laboratoriet er en analytisk elektronmikroskop drives på 120 kV og utstyrt for cryomicroscopy, det vil si, designet med et rent vakuum, prøve-området anticontaminator, en 2k x 2K høy følsomhet digitalkamera og cryotransfer prøveholder. Sjekk på forhånd mikroskop justering og driftsforhold i både lav-og høy forstørrelse moduser og bekrefte en tilfredsstillende kolonne vakuum, ideelt ≤ 10 ^-7 Torr. Tune opp etter behov.

1. Bekreft at vakuumisolasjon av Dewar komponenten i cryoholder er tilfredsstillende. Pumpe som nødvendig.
2. Avkjøl cryoholder til sin laveste temperatur, minst -160 ° C, mens under høyvakuum i objektbordet, løsne kabelen som forbinder holderen til dens kontroll-boksen. Vipp goniometer 45 ° med klokken før du fjerner holderen for å minimere LN _to søle på operatør-og mikroskop overflater.
3. Forbered Borstemmaskin cryoworkstation ved å kjøle den integrerte isolered cup til ≤ 160 ° C.
4. Transfer (raskt!) den avkjølte cryoholder fra mikroskop til Cryo arbeidsstasjon. Trekk innehaverens frost skjold.
5. Henting under LN _to et rutenett sandwich fra lagring og plass på arbeidsbordet i cryoworkstation. En låseringen for innehaverens prøvebrønn er også plassert på bordet.
6. Åpne indium konvolutten og flytte den vedlagte folding rutenettet til prøven godt av cryoholder. Sikre rutenettet med låseringen med skrunøkkelen verktøy levert og lukke frost skjold.
7. Raskt fjerne cryoholder fra cryoworkstation og sett inn i luftslusen av mikroskopet og gå gjennom pumping sekvensen så raskt som mulig. Ved innsettingen, bør det være et minimalt avbrudd vakuumkolonnen.
8. Returner goniometer til 0 ° tilt. Koble og revitalisere kontrollboksen og bekrefte at prøvetemperatur er ≤ 150 ° C.
9. Fyll på Dewar avprøveholder og la vakuum og temperatur til fullt igjen.

4. Visuell undersøkelse av § §

1. Trekk frost skjold av holderen for å avsløre prøven og slå på elektronstråle.
2. Evaluere visuelt prøven ved lav forstørrelse, typisk 250x, og lav belysning. Som illustrert i figur 1, bør delene være tynn og glatt, ikke foldet eller overlappende, flat og godt festet til bærerfilmen, og vanligvis ikke skjules av risten.
3. Eventuelt fotografere utvalgte deler. (MERK: Minimer eksponering trålen, siden frosne hydrert delene er svært utsatt for stråle-indusert skade.) Bruk automatisert digital goniometer scenen for å lagre koordinatene til utvalgte deler.

5. Frysetørking av § §

1. Fryse-tørr seksjoner ved å øke holder temperaturen til ca. -100 ° C i ~ 30 minutter.
2. Recool holderen til -160 ° C eller lavere.

6. Avbildning av celler og organ

Strukturelle bilder av frysetørkede seksjoner er oppnådd ved ca. -160 ° C som lavdose, null-tap bilder som er tatt digitalt ved hjelp av en 2k x 2k slow-scan CCD-kamera styres av egnet programvare.

1. Aktiver EM i hi-mag-modus.
2. Velg og bilde på ~ 2000 X (som TIFF, se figur 2) utvalgte celler og subcellulære områder av interesse i høy kvalitet seksjoner, der plasseringen var tidligere registrert og lagret. (MERK: De tørkede delene er nå vesentlig mindre sårbare og mindre utsatt for elektron skade stråle.
3. Vurdere bildene for å velge områder av interesse (Rois) for X-ray analyse. Dette trinn kan eventuelt utføres off-line, i hvilket tilfelle EM kan dreiesav, og prøven tillatt å oppvarmes til romtemperatur.

7. Oppkjøp av X-ray Spectra

X-ray spektra kan tas opp ved hjelp av noen av flere kommersielle eller spesialdesignede X-ray analyse systemer minimalt består av en energi-spredt X-ray (EDX) detektor, forbundet puls-prosessor elektronikk og kompatibel oppkjøp og vise programvare. (Det system som brukes i denne modulen er beskrevet i tabell 1).

1. Konfigurer EM for X-ray oppkjøpet ved å sette EDX detektoren i kolonnen (om nødvendig), uttak målet blenderåpning, og sette inn og sentre noen streif stråling åpninger. Juster cryoholder til den laveste temperatur ved hvilken frost kontaminering av prøven unngås, men i det minste under 100 ° C.
2. Vippe holderen 20 ° mot detektoren.
3. Under bred-feltavbildningsbetingelser, og forutsatt at man har til hensikt å analysere matrise av en individual mitokondrier, velger en mitokondrie for analyse, flytte den til midten av feltet og fokusere.
4. Gå til flekk-modus (på noen mikroskop bare konvergerer strålen ved hjelp av andre kondensator fokus) og øke strålestrømmen til ca. Tre nA (målt med et Faraday-kopp eller lignende) i en 100 nm sted.
5. Lansere spekteret oppkjøpet programvaren og begynne 100 sek oppkjøp, som kan sees live tid på TV-skjermen. Lagre innspilte-spektrum (fig. 2). Industristandarden EMSA format er å foretrekke.
6. Slå av EM og overføre flere spektra fil (er) til en (offline) analyse arbeidsstasjon.

8. Analyse av røntgenspektra

Kvalitativ analyse

En EDX spektrum (fig. 2, innfelt) er egentlig et xy-plot av røntgen intensitet g. energi. Spectra inneholde kvalitativ og kvantitativ informasjon om elementsammensetningen av tHan analysert volum, ved at den "karakteristisk" energi av en topp identifiserer element som gir opphav til denne toppen, mens intensiteten reflekterer mengden av dette elementet. De karakteristiske toppene ri på toppen av en langsomt varierende bakgrunns, den "sammenhengende". (Legenden Figur 2 ytterligere diskuterer fremtredende detaljer om EDX spektra.) Energien av peak manifolder for hele periodiske tabellen er definert av den velkjente elektroniske struktur elementer, dermed alle EDX programvare linker til en database som identifiserer komponenter av automatisk en analytt. I en fysiologisk sammenheng, elementer av allmenn interesse som er godt egnet til EDX analyse er Na (K _α på 1,04 keV), P (2,01 keV), K (3,31 keV), og Ca (3,69 keV).

1. Dra nytte av tilgjengelig programvare database og peak matchende rutiner for å identifisere viktige elementer i spektrene. I en biologisk prøve forvente å finne topper for Na, Mg, P, S, Cl, K og Ca. (FORSIKTIG:De to siste elementer overlapper hverandre!)

Kvantitativ analyse

Kvantitativ analyse av EDX-spektra består av ekstrahering av den integrerte området av identifiserte topper og konvertering av denne verdi til en konsentrasjon. For biologiske analyse, er det etablert tilnærming til Hall peak / kontinuum metode ^4,7,10, som tar fordel av det faktum at intensiteten av kontinuum (definert ovenfor og i figur 2) er proporsjonalt med den tørre massen av det analyserte volumet . Således er forholdet mellom toppareal / kontinuum-område, sammenlignet med det samme forholdet i spektra av standarder med kjent sammensetning, angir den konsentrasjon i den målrettede cellerommet. Legg merke til at denne fremgangsmåten gir konsentrasjoner i enheter av mol pr vekt, vanligvis uttrykt som mmol / kg tørrvekt. Denne enheten er uvanlig og for tolkning kan kreve ytterligere omdannelse til, for eksempel, mmol / L våtvekt or mmol / mg protein, som beskrevet elsewhere ^4,10.

2. Pakk toppområder (og feilanslag) av biologiske elementer mellom Z = 10-20 (0,5-4,0 keV), dvs. Na, Mg, P, S, Cl, K og Ca, ved hjelp av en av installasjonsrutiner bygget inn analyse programvare (se tabell 1, spesielt fotnote 4). Dette laboratoriet bruker Simplex eller flere-minste kvadrater montering. Merk at dette passer krever nøye oppmerksomhet til å løse overlappingen mellom K og Ca topper (se figur 2).
3. Integrer kontinuum mellom 1,45 til 1,61 keV. Alternativt interferensfrie områder kan anvendes.
4. Beregn peak / kontinuumsmekanikk forholdstall og deretter konsentrasjoner i forhold til standarder. Forplante feil i løpet av analysen.
5. Bruk standard statistisk programvare og formler for å beregne gjennomsnitt som gjenspeiler biologiske variasjoner.

Representative Results

Hjerneceller vanligvis opprettholde eksitotoksiske skade som følge av den patologiske signalstoffet utgivelsen som skjer under iskemiske tilstander. EPMA var kritisk for å finne ut hvordan muligheten for neuronal mitokondrier binder store mengder kalsium ligger til grunn for skademekanisme. Den elektronmikroskop i Figur 3 illustrerer utseendet av mitochondria in frysetørkede cryosections i dyrkede hippocampal neuroner raskt frosset etter 30 min eksponering til en eksitotoksiske stimulus (100 uM NMDA). De fleste mitokondrier synes å være strukturelt skadet, ettersom de er svært hovne og inneholder små, mørke inneslutninger (røde piler). EPMA, som har-oppløsning tilstrekkelig til å utføre elementanalyse innenfor og eks (det "matrix") mitokondrielle inkluderer (figur 3, rødt og blått spektra, henholdsvis), viste at de inneslutninger er i stor grad består av kalsium og fosfor. Den ekstremt høye kalsium contelt av disse inneslutninger - ~ 1300 mmol / kg tørrvekt, mens <1 mmol / kg er typisk for hvile mitokondriene - forklarer deres ekstraordinære kalsium-bufferkapasitet, og hvorfor overveldende dette buffering mekanismen fører til kalsium overbelastning utløst celledød ^11.

Den hippocampus, et område av hjernen kritisk for læring og hukommelse, er et stort område av skade etter iskemi. Det er interessant og terapeutisk viktige, er de funksjonelt distinkte region het CA3 langt mindre utsatt for iskemisk skade enn det som er tilstøtende, postsynaptisk koblet CA1 regionen. EMPA analyse - i forbindelse med cryosections av spesifikke områder av hippocampus skiver som opprettholder in situ struktur og funksjon (Figur 4, micrograph) - ble brukt til å vise at giftige stimuli indusere mye større kalsium forhøyninger i sårbare CA1 nevroner enn i motstandsdyktig tilstøtende CA3 nevroner ( Fig. 4, bar graph). Følgelig CA1 mitochon Dria utvise omfattende skade og dysfunksjon, noe som indikerer at Ca ^{2 +-overbelastning-indusert} mitokondriell dysfunksjon er en avgjørende faktor i den selektive sårbarhet CA1 nevroner ^13.

Figur 1. Lav-forstørrelse elektronmikroskop av to bånd av frosne hydrert cryosections støttes på en pioloform film. Er Kjennetegn på en god forberedelse illustrert, inkludert flate, godt festet, minimalt fragmentert seksjoner. Grid firkanter med riper i støtte film bør unngås, ettersom filmen tårer videre under elektronstråle. To torg fullt passende for analyse er merket med en stjerne. Scale bar = 100 mikrometer.

"Fo: src =" / files/ftp_upload/50807/50807fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50807/50807fig2.jpg "/>
Figur 2. Kvantitativ analyse av organelementsammensetningen av EPMA. Lav-dose, digital overføring scanning elektronmikrofotografi av sympatisk nervecelle i en frysetørket cryosection fremstilt fra raskt frosne kontroll ganglion illustrerer detaljer som kan oppnås i slike prøver. Legg merke til den skarpe plasma membran, godt bevarte stabler av endoplasmatiske retikulum og rikelig mitokondriene Inset -. EDX spekteret registrert fra et typisk område av mitokondrie matrix, som indikert av den røde prikken. Elementer svarende til de store K skallrøntgen toppene er identifisert, i tilfelle av kalium og kalsium, er to K-skall-linjer som kommer fra alternative elektroniske overganger løst, indikert som K _α and K _β i henhold til standard spektroskopiske notasjon. Spectrum illustrerer typisk fordeling av hovedelementer i levende nevroner. Legg merke til den sakte varierende kontinuum stråling, for eksempel mellom 01.05 til 01.08 eller 02.08 til 03.01 keV, som reflekterer massetettheten av denne cellerommet. Kvantitativ analyse av kalsium i friske celler er komplisert ved nærvær av relativt høye nivåer av kalium (ca. 500 mmol / kg tørrvekt, omtrent tilsvarende 150 mM), noe som gir opphav til overlapping av kalium K _β og kalsium K _α topper i EDX spekteret. Det er standard algoritmer for deconvolving denne overlappingen. Scale bar representerer en mikrometer.

Figur 3. Eksitotoksiske stimulering induserer variabel og lokalisert kalsium opphopning i enkelte mitokondriene. Digital overføring elektronmikroskop av frysetørret cryosection forberedt fra unfixed, raskt frosset hippocampus cellekultur etter eksitotoksiske stimulering av NMDA subtypen av glutamatreseptorer (100 mikrometer NMDA for 30 min) viser mange mitokondrier som inneholder små, naturlig elektron tette, punctate slutninger (røde piler). Tilsvarende røntgenspektrene viser at giftige stimulering resulterte i tap av ion-homeostase, slik det fremgår av økt Na topp og redusert K topp i inkludering frie mitokondrielle matriks (blå piler og spektrum). Den store Ca topp i det røde spektrum reflekterer sterk mitokondrie kalsium-akkumulering lokalisert til karakteristiske inneslutninger, som også inneholder store mengder av fosfor og oksygen. Gjennomsnittlig Ca konsentrasjon i inneslutninger og matriser var ~ 1300 og ~ 60 mmol / kg tørrvekt, henholdsvis. Scale bar representerer 500 nm.

7fig4.jpg "/>
Figur 4. Mitokondrie kalsium overbelastning er ansvarlig for selektiv iskemisk sårbarhet hippocampus CA1 nevroner venstre panel -. Electron mikrografer av cryosections av cellen organer i CA3 og CA1 regioner av en organotypic hippocampus skive kultur, fryse raskt etter iskemi-etterligne forholdene (100 mikrometer NMDA). høyre panel - EPMA analyser av mitokondrie kalsiuminnholdet viser at kjemisk iskemi induserer mye større kalsium forhøyninger i mitokondriene av sårbare CA1 nevroner enn i tilstøtende, iskemi-resistente CA3 nevroner (*, p <0,05 i forhold til NMDA-eksponert CA1). NMDA-indusert kalsium overbelastning ble avskaffet av NMDAR antagonist MK-801. Scale bar representerer to mikrometer.

Discussion

Den elektronmikroskop-basert analysemetode som presenteres her muliggjør påvisning, identifisering og kvantifisering av flere elementer av biologisk interesse, som Na, K, P, og spesielt Ca. Disse analysene kan utføres ved subcellulære, dvs. intra-organelle, oppløsning på grunn av evnen til å lokalisere og identifisere strukturer av interesse for bilder med høy kvalitet av cryosections fremstilt fra raskt frosne prøver. Legg merke til at ingen farging er nødvendig å ta opp elektron bilder sammenlign i strukturell kvalitet til konvensjonelt faste, plast-embedded forberedelser, selv mens plasseringen av vev elementer er kvantitativt bevart.

Selv om strukturundersøkelse Bilder tas ved lave anvendte elektron dose, er mye høyere doser som kreves for å fremkalle røntgen emisjon ved tellerater er tilstrekkelig til å skaffe god statistikk. Derfor må et mikroskop nyttig for EMPA være i stand til å danne en høy strøm fokusert probe; 2-5 nAinn 25-50 nm, egnet for altomfattende organeller som ER cisternae eller synaptiske vesikler, er akseptabelt. Denne minimalt krever en høy lysstyrke lantan hexaboride elektron pistol. Under disse instrumentelle betingelser, kan kalsium ved typiske vevskonsentrasjoner av 1-10 mmol / kg tørrvekt bli kvantitativt analysert på en standard feil på ± 0,1 mmol / kg i ~ 100 sek levende tid. Sensitiviteten av kalsium analyse ville bli mye bedre hvis det ikke var for den uheldige overlapping av de store kalsium x-ray tråd med en mindre kalium linje, deconvolution som tilfører betydelig usikkerhet til integrering av kalsium signal (se figur 1 legende for detaljer). Legg merke til at grensebetingelsene som er beskrevet er sterkt avslappet når lokale kalsiumkonsentrasjoner er uvanlig høy, som oppstår under fysiologiske, og spesielt patologisk, mitokondrie kalsium opphopning (Tall 2-3).

Til tross for tallrike successful-programmer, er det klart at EPMA er ikke en spesielt effektiv teknikk, så det er mye insentiv til å forbedre data gjennomstrømming. Tre lovende veier er nevnt her: 1) elektron energitap spektroskopi (EELS) i stedet for EDX, 2) 2D element kart i stedet for punkt sonder, og 3) nyere, state-of-the-art instrumentering. Snarere enn å samle slippes røntgen, avhenger EELS på opptak hendelses elektroner som har mistet karakteristiske, elementspesifikke mengder energi etter elektron / atom kollisjoner. Statistisk sett er EELS iboende ~ 4x bedre enn EDX, og ål maskinvare og programvare er nå praktisk talt modne for biologer. (Se referanser ^{6, 2} for anmeldelser ål applikasjoner i biologi.)

Den forbedret sensitivitet tilbys av EELS - og også av nyere high-throughput Si-drift EDX detektorer, se nedenfor - kan kortere holdetider per analyse, f.eks millisekunder i stedet for hundreds av sekunder, og dermed evnen til å generere digitale kart over utvalgte områder i rimelige tider. Som et eksempel kan en 128 x 128 kalsium kartet registreres i ~ 1 hr ^en. Merk at denne tilnærmingen, kjent som "spektrum bildebehandling" ^6,2, gir en komplett EELS spekteret ved hver piksel, slik informasjon på flere elementer er integrert i den innspilte "data kube" (x vs. Y vs. E).

Endelig har det vært vesentlige fremskritt i instrument teknologi og ytelse, siden det foreliggende system, som beskrevet i protokoll delen, ble utviklet for over 20 år siden. State-of-the-art teknologi som vil være de rigueur i en EMPA lab være setup i dag ville inneholde: 1) en høy lysstyrke felt-utslipp pistol som kan pumpe flere nanoamps (NA) av strøm inn subnanometer store flekker; 2 ) et stort område for silisium-drift detektor for maksimert røntgenoppsamlingseffektivitet og gjennomløp ^8, og 3) moderne programvaretilbyr overlegen fleksibilitet og ytelse for spektral oppkjøpet, analyse og kvantifisering. Slike programvarepakker er kommersielt tilgjengelig fra de fleste produsenter, alternativt en oppdatert og forbedret versjon av DTSA programvare, DTSA II, er tilgjengelig uten kostnader fra NIST (se tabell 1, fotnote 4). Funksjonene som nettopp er beskrevet er på toppen av en hvilken som helst automatisering og / eller robot tilgjengelige i baseelektronmikroskop.

EMPA protokoll som beskrevet har vist seg svært nyttig for å angripe flere saker av interesse for nevrologer, hjelpe, for eksempel, for å avsløre cellulære mekanismene for neurodegeneration. Med tanke på forbedringer bare anbefalt, bør EMPA fortsette å være en solid bidragsyter til fremtidig forskning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS/MATERIALS
Thermanox plastic coverslips	Thermo Fischer Scientific	72280
Culture inserts	BD Falcon	353090	For 6-well plates
Cryopins	Leica Microsystems	16701952	Grooved
Wood applicators	EM Sciences	72300
Folding EM grids	Ted Pella	4GC100/100	100 mesh
Indium foil	Alfa Aesar	13982	0.25 mm thick
EQUIPMENT
Plunge freezing device	Leica Microsystems	KF-80
Slam freezing device	LifeCell	CF-100
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC6
Cryoattachment for microtome	Leica Microsystems	FC6
Diamond cryotrimming tool	Diatome	Cryotrim 45
Diamond cryoknife	Diatome	Cryo 35
Antistatic device	Diatome	Hauf Static Line
Cryo electron microscope	Carl Zeiss Microscopy	EM912 Omega
EM cryo specimen holder	Gatan	CT3500
Slow-scan CCD camera, 2k x 2k	Troendle (TRS)	Sharpeye
Image acquisition software	Olympus SIS	iTEM suite
ED x-ray detector	Oxford Instruments	Linksystem Pentafet
Pulse Processor	Oxford Instruments	XP-3
PCI backplane card	4pi Systems	Spectral Engine II
Desktop computer	Apple	Any OS9-compatible model
X-ray analysis software	NIST	DTSA, DTSA II
Spreadsheet software	Microsoft	Excel
The CF100 is no longer sold commercially, although the machine is available at many academic facilities, and complete machines or parts can be found on-line. A video tutorial for the CT3500 cryotransfer holder is available at http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4. The SEII is obsolete; the Universal Spectral Engine Is a later, PC-compatible product with comparable functionality. 4pi has ceased manufacturing and sales but still provides technical customer support. Used systems are often found online. The original DTSA is now obsolete. NIST offers in the public domain an updated successor, DTSA II 12 (http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm)