Summary
磷酸钙沉淀是用于培养细胞的转染的便利和经济的方法。以优化，因此能够对难以转染细胞如原代神经元使用此方法。在这里，我们描述了我们详细的协议进行共培养与星形胶质细胞海马神经元的磷酸钙转染。
Abstract
磷酸钙沉淀是用于培养细胞的转染的便利和经济的方法。以优化，因此能够对难以转染细胞如原代神经元使用此方法。在这里，我们描述了我们详细的协议进行共培养与星形胶质细胞海马神经元的磷酸钙转染。
Introduction
原代神经元是最难的细胞类型，转染，因为它们是有丝分裂后，并以微环境的变化非常敏感的一个。有四种常用的类型的，在这些单元电池1的外源基因和短发夹RNA（的shRNA）的表达的方法。每个人都有自己的优点和缺点。例如，电穿孔，通常在新鲜分离的神经元2执行的，作为细胞必须被转移到比色杯中进行转染。病毒感染通常可以达到非常高的效率3，但更多的劳动力密集型和高风险的运营商。许多脂质介导的转染试剂是市售的，具有不同程度的神经元和不同程度的细胞毒性的成功。
磷酸钙转染代表了外源基因引入神经元既方便又经济的方法。该方法首先被用于引入腺病毒DNA导入哺乳动物CELLS由Graham和van der EB（1973）4。转染通过混合氯化钙与磷酸盐缓冲液的重组DNA进行。这使得DNA /磷酸钙形成沉淀，当逐渐下降到细胞单层，坚持到细胞表面，均是由内吞作用，最后进入细胞核5。这个过程将导致在靶细胞引入外源基因的表达。之间的0.5-5％6-8磷酸钙转染范围典型效率。然而，通过仔细的优化和实验方案的一致的执行，因此能够达到几乎50％的转染效率。在这里，我们描述了我们详细的协议，用于原代海马神经元，这是在一个三明治格式9共培养与星形胶质细胞的磷酸钙转染。
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Protocol
1。准备大鼠星形胶质细胞培养的条件培养基和星形胶质细胞，神经元共培养。
- 准备剥离缓冲液（BSS，请参阅表1配方），并在4℃下储存，直到准备使用。
- 麻醉新生幼鼠（P0-P2），异氟醚在500毫升烧杯中。
- 当幼崽是不动的，喷以70％乙醇和杀头。
- 消除大脑。
- 有一对杜蒙＃5镊子紧紧握住头部，并用细剪刀透过皮肤和颅骨，使正中切口。
- 揭露大脑通过反射头骨向两侧，并取出脑入含冷BSS的一道菜。
- 从下一个解剖范围间脑和脑干分离大脑半球。小心通过稳定的组织与一对镊子，轻轻拉扯脑膜与另一双钳取出所有脑膜。
- 收集所有半球我n一个60毫米菜。使用小剪刀，切末组织为细越好。然后将剁碎的组织转移到50毫升锥形管中。
- 加入1.5毫升1％DNA酶I和1.5ml的2.5％胰蛋白酶和12ml的BSS（15毫升的总体积）的至大脑。在37℃下孵育在振荡水浴15分钟以确保良好混合，管是由手工旋动，每隔5分钟。
- 通过70微米的细胞过滤网转移了一个新的50ml锥形管中的上清液。加3毫升FBS该上清液。
- 到剩余的片，加13.5毫升BSS和1.5ml 2.5％胰蛋白酶和孵化在摇动水浴另一个15分钟。
- 通过细胞过滤网传输剩余的上清液，并结合来自步骤1.8的上清液。
- 离心机在1,000 rpm离心5分钟以沉淀细胞。
- 重悬浮颗粒在5毫升胶质媒体。上清液可以再次离心以沉淀剩余的细胞。
- 使用血细胞计数器计数细胞。
- CEL板LS为1×10 7每150cm 2培养瓶的密度。
- 电镀后的一天改变媒体的新鲜胶质媒体。随后，喂细胞每周两次与胶质媒体。
- 当电池已达到> 80％汇合（电镀后约10天），冷冻细胞向下以90％马血清和10％DMSO中，并保持库存在液氮中。将细胞冷冻在2×10 6每小瓶。约5小瓶可以从每个瓶中进行冷冻保存。
- 设立海马培养前约10-14天，神经胶质细胞从冷冻的库存镀。我们通常板5 6孔板中，这是足够的，以支持90盖玻片海马神经元（每孔3至15毫米的圆形盖玻片）的生长。我们还板胶质细胞的额外的8至10 60mm的培养皿，其用于调节N2.1媒体进行转染。一天的神经元培养前，细胞必须与NB27媒体喂养。星形胶质细胞最好应> 90％汇合在日是点。我们发现，冷冻大大减少了在星形胶质细胞培养物的小胶质细胞的数量。从什么时候开始的小胶质细胞是存在于星形胶质细胞培养神经毒性增加观察，我们总是用冷冻库存准备共同培养的神经元与星形胶质细胞培养。
2。神经细胞培养
- 干净的玻璃盖玻片在超纯水2X第一清洗。然后，他们在浓硝酸浸泡24小时，并用超纯水进行至少五次以上共2小时的。盖玻片通过在225℃下进行6小时的烘箱中烘烤干燥和灭菌。
- 灭菌后转移盖玻片60毫米的菜肴。放置四个点无菌石蜡的每个盖玻片的外边缘附近，以保持神经元的神经胶质细胞的共培养中分离出来。
- 外套盖玻片用1毫克/毫升的聚-L-赖氨酸在0.1M硼酸盐缓冲液中过夜，37℃培养箱中培养。
- 第二天，在无菌米冲洗盖玻片两次illiQ水每个至少15分钟。然后，他们培养过夜电镀媒体在37℃培养箱中培养。
- 异氟醚麻醉后气胸安乐死孕鼠（E18），并斩首安乐死大鼠胚胎。移除大脑和剖析了上述的大脑半球。
- 从大脑半球解剖出海马。将所有海马入15ml锥形管中，并用0.25％的胰蛋白酶（0.5毫升2.5％的胰蛋白酶，4.5毫升BSS）在37℃消化15分钟。
- 消化海马漂洗在BSS 3倍，每次5分钟。然后将它们用玻璃巴斯德吸管研磨，细胞密度是通过使用血细胞计数器确定。神经元，然后在每60毫米培养皿2×10 5个细胞的密度接种。
- 约2-4小时后镀，转移与神经元连接到包含星形胶质细胞的菜盖玻片，用神经元朝下向神经胶质细胞。在DIV3，阿糖胞苷添加到细胞在5μM的最终浓度来停止神经胶质细胞的增殖。
3。钙转
- 条件N2.1介质上转染前一天的神经胶质细胞。
- 在转染当天，取空调N2.1媒体关闭胶质细胞并转移到一个新的菜。转移盖玻片与神经元到空调N2.1媒体。让我们在平衡孵化10-30分钟。
- 给一组无菌试管中，结合1-4的DNA微克，12.5微升的2M的CaCl 2，和无菌H 2 O的为100微升的总体积。到第二组管中，加100μL2×HBS的。
- 一次添加2×HBS的⅛体积（12.5微升）到含有氯化钙2 / DNA混合物的管，每次旋动几秒钟。让管坐15分钟。
- 15分钟后，温育后，将转染混合物逐滴加入到细胞中。孵育1-1.5小时。砂状沉淀一层应该是可见的使用10X物镜的显微镜下。
- 孵育后，冲洗盖玻片两次用温水哈佛商学院的洗涤缓冲液。
- 返回盖玻片原菜胶质细胞，犬尿喹啉酸添加到0.5mM的终浓度。
- 转染的神经元可现场进行成像或早，第二天处理的免疫细胞。转染后的神经元能够存活长达三个星期。
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Representative Results
当转染的不同的参数进行了优化，并小心地从试验对照试验，有可能获得高达50％的转染效率， 图1显示了在DIV4用GFP神经元的一个字段。该字段包含一个共有28个神经元，其中16转染的。这代表了超过50％的效率。在相同的盖玻片等领域的采样示出了整体的效率大约是50％（数据未示出）。与星形胶质细胞共培养系统，神经元保持健康和转染后正常发育。 图2显示了海马神经元在DIV15，转染与PSD-95-GFP的构建后10天。神经元已经开发了许多成熟的蘑菇状树突棘，这表明神经细胞是健康的。高转染效率和本协议的毒性最小，使其成为学习的主要河马基因功能的有价值的工具CAMPAL神经元。最后，这个协议可以潜在地适于染其它类型的神经元在大脑中的培养物，以及其他难以转染的细胞类型。
图1。海马神经元转染绿色荧光蛋白在DIV4，显示出较高的转染效率。16出28的神经元在该领域是积极的。 点击这里查看大图 。
图2。海马神经元转染PSD-95-GFP在DIV15，显示出许多成熟的蘑菇状树突棘。 点击这里查看大图 。
表1中。缓冲器/媒体食谱。
| 试剂 | 组件 |
| 胶质媒体 | 425毫升MEM 5毫升的GlutaMAX 5毫升丙酮酸钠，100mM的 15毫升20％葡萄糖 25毫升FBS（最终5％） 25毫升小牛血清（最终5％） 5 ml青霉素/链霉素 |
| 0.1M硼酸盐缓冲液 | 2.48克硼酸 3.9克四硼酸钠（硼砂） 800毫升的milliQ水 pH值用NaOH至8.5 过滤消毒 |
| 电镀媒体 | 425毫升MEM 5毫升的GlutaMAX 5毫升丙酮酸钠，100mM的 15毫升20％Glucose 50毫升FBS |
| NB27媒体 | 485毫升的Neurobasal媒体 5毫升的GlutaMAX 2毫升B27添加剂（50X） |
| 夹层缓冲液（BSS） | 50毫升10X HBSS 5毫升1M的HEPES，pH值7.3 5 ml青霉素/链霉素 440毫升H 2 O的 |
| N2.1媒体 | 425毫升MEM 5毫升的GlutaMAX 5毫升丙酮酸钠，100mM的 15毫升20％葡萄糖 50毫升卵白蛋白，1％的MEM 5毫升N2添加剂 |
| 2×HEPES缓冲盐水（HBS），无菌 | 274 mM氯化钠 9.5毫米氯化钾 15毫米的葡萄糖 42毫米肝素钠 1.4毫米的Na 2 HPO 4 准备3个不同的pH值（7.05，7.10，7.15）批 |
| 洗涤缓冲液（HEPES缓冲盐水） | 50毫升10X HBSS 5毫升1M的HEPES，pH值7.3 445毫升H 2 O的 |
| 50毫米犬尿喹啉酸 | 溶解0.473克犬尿喹啉酸在1x PBS中。添加氢氧化钠的滴把它转换成解决方案。然后用盐酸调节pH值恢复为7.0 |
表2。时间线培养制备。
| 日 | 行动 |
| 在开始之前 | 准备星形胶质细胞培养和细胞冷冻下来。一批次星形胶质细胞培养通常可支持数月的海马文化。 |
| 第1周星期一 | 解冻星形胶质细胞。 |
| 第1周周二 | 饲料星形胶质细胞。 |
| 第1周星期五 | 饲料星形胶质细胞。 |
| 第2周星期一 | 饲料星形胶质细胞。冲洗盖玻片在H 2 O，然后浸泡在硝酸中24小时。 |
| 第2周周二 | 凛SE盖玻片5倍。干燥灭菌盖玻片。 |
| 2周周三 | 将石蜡点盖玻片上。外套盖玻片用聚-L-赖氨酸。 |
| 第2周周四 | 在冲洗无菌水涂盖玻片，然后培养在盖玻片电镀过夜培养基中于37°C。在星形胶质细胞NB27更换介质。 |
| 第2周周五 | 海马解剖和电镀。 |
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Discussion
有迹象表明，需要仔细控制的一贯成功转染10,11几个关键参数。对于磷酸钙转染的最关键的参数是2×HBS，这在我们手中，通常7.10-7.15之间变化的pH值。我们建议将三批股票随pH值在0.05增量占pH计之间的差异。或者，Clontech公司哺乳动物转染试剂盒提供2倍哈佛商学院，始终产生良好的效益。记住，将溶液的pH值将甚至当在冰箱中存放随时间而改变。我们一般保持2倍哈佛商学院的分装于4℃下长达一个月，并且在-20℃可保存一年。
第二个参数是培养基中的pH值。为了保持这种一致性，N2.1介质的常规空调的星形胶质细胞培养过夜，但不超过24小时。此外，我们尝试使用星形胶质文化日在在汇合相似。利用神经胶质细胞条件培养基也有助于减少毒性对神经元转染过程中。条件培养基中平衡在孵化前的转染，以保持pH值保持一致。
磷酸钙沉淀物的大小和密度的关键是成功的转染。小的沉淀物会导致转染效率低，而大型，块状沉淀物通常会导致细胞毒性10。为了确保一致的磷酸钙沉淀的形成，我们使用间歇性涡旋混合的DNA / 氯化钙和2x HBS 11时。另一种常用的方法，混合是通过使用巴氏吸管12吹气泡。我们已经找到了间歇性涡旋产生更一致的沉淀物的形成，特别是对于小批量的转染混合物。
其他因素需要考虑，包括DNA的质量，和神经的年龄纳秒。我们发现，转染开始持续工作时的神经元达到DIV2，但是，效率开始下降时，神经元是超越DIV10。最后，该神经元培养物本身的健康表示另一个重要的参数。我们发现使用的共培养体系是产生健康的原代海马文化的最佳途径。如果神经元是不是健康的，他们不会长时间转染后仍然有效。随着共培养体系，低密度的神经元可以转，这有利于长期研究后长达3个星期生存。
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Disclosures
有兴趣的无冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院授予NS065183和启动从罗格斯大学罗伯特·伍德·约翰逊医学院的资金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | straight / sharp 8.5 cm |
| Vannas-Tubinger spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-14 | blunt / 14.5 cm |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-225-06 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| 100 mM Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4385 | |
| 1 M HEPES, pH 7.3 | Gibco/Invitrogen | 15630-080 | |
| GlutaMAX | Gibco/Invitrogen | 35050-061 | |
| Neurobasal Media | Gibco/Invitrogen | 21130-049 | |
| B27 Supplement (50x) | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 Supplement | Gibco/Invitrogen | 17502-048 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Invitrogen | 15070-063 | |
| 2.5% Trypsin | Gibco/Invitrogen | 15090-046 | |
| DNase I | Sigma | DN-25 | |
| Cytosine arabinoside | Calbiochem/EMD Millipore | 251010 | |
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 |
References
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