Summary
Tre assays, herunder cytopatisk effekt (CPE)-baserede assay, dosis-respons analyse og Time-of-Addition (ToA) assay er blevet udviklet, optimeret, valideret og udnyttet til at identificere nye antivirale mod bluetongue-virus (BTV), samt at bestemme mulig mekanisme-of-aktion (Landbrugsministeriet) for nyligt identificerede antivirale lægemidler.
Abstract
At identificere potentielle antivirale mod BTV, har vi udviklet, optimeret og valideret tre analyser, der præsenteres her. CPE-assay var det første assay udviklet til at vurdere, om en forbindelse viste nogen antiviral virkning og har været anvendt til at screene store stofbibliotek. I mellemtiden kunne cytotoksicitet af antivirale lægemidler også evalueret ved brug af CPE-baserede assay. Dosis-respons-assay blev udviklet til at bestemme området for effekten for den valgte antivirale, dvs 50% hæmmende koncentration (IC50) eller effektiv koncentration (EC50), samt sit sortiment af cytotoksicitet (CC 50). Toa assay blev anvendt til den indledende MoA undersøgelse for at bestemme den underliggende mekanisme af de nye antivirale løbet BTV virale livscyklus eller den mulige indvirkning på host cellulære maskineri. Disse analyser er afgørende for vurderingen af antiviral effekt i cellekultur-system, og har været brugt til vores seneste undersøgelser førerning til identifikation af en række nye antivirale mod BTV.
Introduction
BTV er en prototype dobbeltstrenget RNA virus i slægten orbivirus, familien Reoviridae. BTV er et af de vigtigste sygdomme i husdyr, herunder får, geder, kvæg og andre husdyr, med 3 milliarder dollars / år tab på verdensplan 1,2. Den eksotiske BTV serotype er en vigtig animalske patogener anført i "USDA High Konsekvens Livestock patogener." For nylig, den genopståede af BTV har forårsaget et stort sygdomsudbrud hos kvæg og får i flere lande i Nordeuropa 3,4. Som et resultat af dens økonomiske betydning og som en model system, har BTV været genstand for omfattende molekylære, genetiske og strukturelle studier, og flere vacciner er blevet udviklet. Men på grund af mangel på ordentlig assays for antiviral lægemiddelforskning, er der ingen antivirale tilgængelige mod BTV.
I en nylig high throughput screening (HTS) kampagne ved hjælp BTV som model system, er vi developed, optimeret og valideret en CPE-baserede assay til at identificere potentielle bredspektrede antivirale mod arbovira 5. CPE-assay er en velkendt assay, der har været anvendt i antiviral lægemiddeludvikling mod en række vira, som inducerede hurtig og observerbar CPE / apoptose 5-7. I vores system, post BTV infektion, CPE er tydelig i hvirveldyr celler, herunder HeLa, BSR, og HEK 293T 8. BTV-induceret CPE kan overvåges og kvantificeres ved hjælp af forskellige celle levedygtighed påvisningsmetoder, herunder CellTiter Glo cellelevedygtighed reagens kit (CTG kit) 9.. Dette sæt bestemmer antallet af levedygtige celler i kultur baseret på kvantificering af cellulære ATP præsenteret, som signalerer tilstedeværelsen af metabolisk aktive levende celler. Under optimerede betingelser, CPE-baserede assay præsenteres her viste sin gennemførlighed med "mix og måle" et skridt protokol og fleksibilitet med stabile selvlysende signaler. I mellemtiden, giftige forbindelser redusiering celleviabilitet vil blive udelukket i denne CPE-baserede assay. CPE-assay viste sin robusthed og pålidelighed for antiviral lægemiddeludvikling mod BTV og er blevet anvendt til at screene NIH Molecular Biblioteker Small Molecule Repository (MLSMR), hvilket fører til identifikation af seks nye klynge af potentiel antiviral bly forbindelse (r ) 5..
Når en potentiel antiviral forbindelse er blevet identificeret ved hjælp af CPE-assay, vil det være nødvendigt at blive udsat for den ti-koncentrationen af dosis-respons-assay for at bestemme området af antiviral effekt og cytotoksicitet 2. Den antivirale effektivitet, repræsenteret som 50% hæmmende koncentration (IC50) eller 50% effektive koncentration (EC50), er koncentrationen af et lægemiddel, som inhiberer virus-induceret CPE halvvejs mellem baseline og maksimum. Cytotoksiciteten af antivirale lægemidler, dvs koncentration 50% cytotoksicitet (CC 50), er koncentrationenaf et lægemiddel inducerer 50% af cytotoksicitet mellem baseline og maksimum. Den selektive indeks (SI), betegnet 50% SI (SI 50) beregnes ud fra CC 50 / IC 50 som bestemmer specificiteten af det antivirale mod virus-induceret CPE. IC 50 (eller EF-50), CC 50 og SI 50 værdier er kritiske foranstaltninger for at afgøre, om en antiviral forbindelse er potent og selektiv for yderligere udvikling af lægemidler.
Når et antiviralt viste ingen åbenbar toksicitet in vitro, men forhindret virus induceret CPE og den produktive virale livscyklus, er det vigtigt at karakterisere sin MoA 2. Vi indledte en sådan karakterisering ved at udføre ToA assay til at bestemme den mulige skridt (r) af viral livscyklus, som er påvirket af det antivirale. Generelt blev antiviral forbindelse tilsat til celler på forskellige tidspunkter præ-eller post-virusinfektion. Hvis antivirale blev føjet til de inficerede celler post til sit mål stoe i løbet af infektion, vil det resultere i en lavere aktivitet, når sammenlignet med den, som blev tilsat forud for trin. Således ToA undersøgelse er afgørende for at bestemme den antivirale effekt af et stof, og dets potentielle mål, enten på den virale livscyklus eller værten maskiner er involveret i den virale livscyklus.
For alle tre analyser, blev cellelevedygtighed bestemt ved anvendelse af CTG-kit efter fabrikantens anvisninger 5.. Denne afsløring Systemet sender tilstrækkelige luminescens-signaler, der kunne analyseres ved hjælp af forskellige in-house software. Hvert assay blev valideret og udført mindst tre gange med otte reproduktioner. For alle de indsamlede data blev tre parametre, herunder middelværdi (AVE), standardafvigelse (STDEV), og co-effektive variation (CV) analyseres for at bestemme robustheden af analysen. Når robusthed analysen er fastlagt, vil data blive analyseret og plottet ved hjælp af forskellige biostatics og grafiskc værktøjer 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Celler, Virus og antivirale forbindelser
- Oprethold BSR-celler, et derivat af babyhamsternyre (BHK)-celler 10, i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) indeholdende 5% føtalt kalveserum (FCS), 100U/ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin.
- For alle tre assays plade celler i DMEM med 1% FCS, 100U/ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin, optimeret tidligere 5. Dette medium omtales som assaymedium for alle tre analyser.
- Inkuber alle celler i inkubator ved 37 ° C, med 5% CO 2 og 80-95% fugtighed.
- Plaque-rense og udbrede den type 10 BTV (BTV-10) som beskrevet tidligere 8. Fortynd BTV-10 i assay medium for hver udpeget analyser.
- Opløs alle test forbindelser i DMSO til at danne en bestand med koncentration på 10 mM. Opbevar bestandene ved -20 ° C.
- Fortynd forbindelser til ønskede koncentrationer ved hjælp af assaymedium til udpegeded assays 2.
2. CPE-baserede Assay Brug CTG Kit
- Seed BSR celler i en 384-brønds mikroplade (sort, format med 16 x 24) via MicroFlo Select dispenser. Den podningstæthed er 5.000 celler / brønd, og såning volumen er 20 ul for antiviral effekt analyse.
- Cellerne inkuberes i 2-3 hr indtil cellerne får klæbende til pladen grundigt.
- Tilføj antiviral forbindelse med en endelig koncentration på 10 uM til hver brønd. Bland det fuldstændigt.
- Fortyndes BTV til ønsket titer og tilsættes 5 ul BTV med betegnet MOI til hver brønd. Til kontrol godt, tilsættes 5 ul assay medier. Inkuber de inficerede celler i 72 timer ved 37 ° C med 5% CO2 og 80-95% fugtighed.
- Ved 72 HPI, tø og tempereres CTG buffer og frysetørret CTG substrat til stuetemperatur før brug. Opblandes homogent CTG reagensopløsning ved at blande det frysetørrede enzym / substrat og puffer reagens ifølge the fabrikantens instruktioner.
- Ækvilibrer assaypladerne til stuetemperatur i 15 min.
- Læg et lige volumen (25 ul) af CTG reagenser til hver brønd af en dispenser. Efter inkubation i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke, måle luminescens-signaler ved hjælp af en multi-mode læser med en integration tid på 0,1 sek.
3. Dosis-respons-assay
- Seed BSR-celler i en 384-brønds mikroplade (sort, format med 16 x 24) via en dispenser med en podningstæthed på 5.000 celler / brønd i en podning volumen på 20 pi til antiviral virkning assay og 25 pi for cytotoksicitetsanalyse henholdsvis .
- Cellerne inkuberes i 2-3 timer ved 37 ° C med 5% CO2 og 80-95% fugtighed, indtil cellerne er godt fastgjort til pladen.
- Proces assay en fjerdedel område af 384 brønde for hver forbindelse (svarende til en 96-brønds plade), som vist i tabel 1. Afsætte otte gentagelser for hver koncentrationi et enkelt assay. Tildel den første kolonne som den positive kontrol uden at sammensatte og virus, og den sidste kolonne (12 th) som negativ kontrol ved at tilføje virus kun uden forbindelser.
- Fortyndes forbindelser til 50 uM i assaymedium og tilføje til den 2. kolonne på 20 ul / brønd for antiviral effekt assay. Bland forbindelsen fem gange under anvendelse af 8-kanals semi-automatisk pipette til en koncentration på 25 uM.
- Anvendelse af 8-kanals semi-automatisk pipette, 20 pi blandingen i 2. kolonne til den næste kolonne (3.), blandes godt til dannelse af en koncentration på 12,5 uM. Gentag denne proces ved at overføre 20 pi blandingen fra 3. kolonne til den næste kolonne (4.) til dannelse af en anden to-ganges fortynding med en koncentration på 6,25 uM. Gentag denne to-fold seriefortynding indtil 11. kolonne. Aspirer og kassér 20 pi af blandingen i 11 th kolonne efter tilsætning og blanding af compound.
- Tilføj BTV-10, baseret på MOI på 0,01, til hver brønd fra kolonne 2 til kolonne 11 med et volumen på 5 gl / brønd. Efter tilsætning af virus, at den endelige koncentration af forbindelse i hver kolonne er: 20 uM i kolonne 2, 10 uM i kolonne 3, og fortsatte med en to ganges fortynding ned til kolonne 11 med en endelig koncentration på 0,04 uM.
- Tilsæt 5 ul medium til kolonne 1 som celle kun kontrol (positiv) og 5 ul / brønd af BTV til kolonne 12 som BTV infektion kun kontrol (negativ).
- Fortyndes forbindelser til en initial koncentration på 200 pM for cytotoksicitet assay. Ligeledes tilsættes 25 gl / brønd af forbindelse, kolonne 2 og blandet 5x med 8-kanals semi-automatisk pipette til en koncentration på 100 uM. Må ikke tilføje BTV.
- Udføre den dobbelte serie fortynding ved at aspirere 25 ul fra kolonne 2 til den tilstødende kolonne 3, og fortsatte indtil den sidste kolonne (12 th). På søjle 12, efter blanding, aspireres og kassere 25 ul mixture. Den endelige koncentration på kolonne 2 bør være 100 m og den 12. kolonne skal være på 0,2 uM. Søjlen 1 er cellen kun kontrol.
- For både antivirale effekt og cytotoksicitetsassays, inkuberes pladerne ved 37 ° C, med 5% CO 2 og 80-95% fugtighed i 72 timer efter behandlingen. Måle cellelevedygtighed under anvendelse af CTG-kit som beskrevet ovenfor (protokol trin 2,5-2,7).
4.. Time-of-Addition (ToA) Indhold
- Frø BSR-celler fra kolonne 1-24 i en 384-brønds mikroplade (sort, format med 16 x 24) via en dispenser på 5.000 celler / brønd og såning volumen er 15 gl / brønd.
- For hver forbindelse udnytte alle fireogtyve kolonner med otte kopier for hvert tidspunkt-punkt i en halvdel af 384-brønds plade (tabel 2). Tildel kolonne 1 som celler kun kontrol ved tilsætning af 10 gl / brønd assay-medium. Mark kolonne 24 BTV infektion kun kontrol (negativ kontrol) ved tilsætning af 5 ul / brønd assaymedium end 5 gl / brønd virus ved MOI på 0,01 til et slutvolumen på 25 ul / brønd.
- Vælg de lige nummererede kolonner fra kolonne 2-22 som antiviral Effektevalueringen kolonne på forskellige tidspunkter efter infektion (HPI). I disse kolonner, inficere celler med 5 ul / brønd BTV ved MOI på 0,01. På forskellige hpi også tilsættes 5 ul / brønd fortyndet forbindelse til hver brønd til dannelse af et slutvolumen på 25 ul / brønd. For betegnet -2 og -1 hpi tilføje forbindelsen til BSR-celler før BTV infektion. For 0 HPI, tilsæt sammensatte og BTV til kulturen samtidig.
- Parallelt hermed udpege de ulige kolonner fra kolonne 3-23 som sammensatte styrer kun, hvoraf forbindelse blev tilsat på forskellige tidspunkter som udpeget (-2, -1, 0, 1, 2, 4, 8, 16, 24, 48 hpi). I disse kolonner, tilsættes 5 ul / brønd assay-medium og 5 ul / brønd fortyndet forbindelse til dannelse af et slutvolumen på 25 ul / brønd.
- Efter behandlingen inkuberes cellerne ved 37 ° C, 5% CO 2 med 80-95% fugtighed.
- Bestem cellelevedygtighed ved 72 hpi anvendelse af CellTiter-Glo kit som beskrevet tidligere (protokol trin 2,5-2,7).
5.. Dataanalyse
- At behandle alle data først med ordentlig in-house software baseret på de selvlysende opnåede signaler via multi-mode-læser. Bestem middelværdien (gennemsnit), standardafvigelse (STDEV) for hver behandling samt koefficienten variationer (CV), der kræver en værdi på højst 10%.
- Overfør de forarbejdede data fra ovennævnte software til en biostatisk og grafisk softwareværktøj. Udføre ikke-lineær regressionsanalyse til at bestemme værdierne af EF 50 og CC50.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1.. Antiviral virkning af forbindelse
Den cellebaserede CPE-assay blev udviklet, optimeret og valideret i vitro under anvendelse af luminescerende-baserede CTG kit til at identificere hidtil ukendte antivirale mod BTV som beskrevet tidligere 2,5. De ti-dosis-respons-analyse blev anvendt til at afspejle den antivirale effekt og cytotoksicitet af en identificeret bly forbindelse ved at måle antallet af metabolisk levedygtige celler i kultur baseret på kvantificering af cellulære ATP præsenteret i levende celler 5,11. I vores tidligere rapport, blev en række potentielle antivirale forbindelser evalueres, herunder forbindelser fra hver klynge identificeres via HTS mod BTV 5, og deres derivater via de novo syntese 2. Baseret på deres EC 50, CC 50 og SI 50, blev der flere lovende blyforbindelser er identificeret med potent antiviral effekt, lav giftighed og høj selektivitet. For eksempel compound052 (C052)blev bestemt til at have en EC50 på 0,27 ± 0,12 uM (Figur 1) 2 og en CC 50 82,69 pM begge viser typiske regressive kurver under den ikke-lineære regressionsanalyser 2. SI 50 af C052 blev bestemt til 306 baseret på dens EC 50 og CC 50 værdier. Det nanomolære skala antivirale effektivitet, lav toksicitet, og dermed høj SI 50 indikerede, at C052 kan være en potent og selektiv antiviral mod BTV.
2. Potentielle MoA for antivirale forbindelse
Toa analysen blev til formål at bestemme den mulige etape (r) af viral livscyklus rettet af forbindelser. Når du tilføjer C052 på 1 eller 2 timer før BTV infektion, dvs -1 og -2 HPI, de antivirale efficacies forblev på nanomolære skalaen (figur 2) 2, hvilket indikerer, at C052 kan handle ud over den tidlige fase af viral livscyklus, såsom virus post. Furthermore, forblev uændret det antivirale effekt indtil C052 blev tilføjet til inficerede celler så senere som 24 HPI. Når de lægges ved 32 HPI, faldt procentdelen af levedygtige celler i C052 behandling celler, hvilket indikerer, at C052 var mindre beskyttende i denne fase af viral livscyklus. Når tilsat ved 48 hpi, var der ingen beskyttelse BSR-celler fra BTV-induceret CPE. Siden den første cyklus af BTV viral replikation normalt afsluttet i inficerede celler indenfor 24 HPI, vores resultater antydede, at C052 kan virke på de sene stadier af BTV virale livscyklus, såsom virus replikation, emballering, modning og påstigning. I mellemtiden er det også muligt, at C052 kan handle på værts cellulære machineries, der var involveret i slutningen af virale livscyklus 2.
Tabel 1. Pladen layout til dosis-respons assay. Den antivirale effekt af C052 var evaluered i en 96-brønds skala inden for 384-brønds plade. Hver behandling, herunder BTV infektion plus forskellige C052-koncentrationer, blev udført med otte reproduktioner. Ved 72 hpi blev cellelevedygtighed bestemt ved anvendelse af CTG-kit.
Tabel. 2. Pladen layout for Time-of-Addition (ToA) assay. Toa analyse af C052 blev evalueret i 384-brønds plade, som angivet i layoutet. Hver behandling, herunder BTV infektion plus tid tilføje C052, blev gennemført med otte reproduktioner. De -2 og -1 HPI viser, at C052 blev tilføjet til cellerne før BTV-infektion. Ved 0 hpi blev BTV og C052 tilsat samtidigt. Ved 72 HPI blev cellelevedygtighed bestemt ved anvendelse af CTG kit. Klik her for at se tabellen .
Figur 1. Den antivirale effekt af C052. Celler blev inficeret med BTV ved MOI på 0,01 i nærværelse af ti forskellige koncentrationer af C052, som angivet i figuren. Cellelevedygtighed blev bestemt ved 72 hpi hjælp CTG kit. Hvert datapunkt repræsenterer midler og SD fra fem gentagelser. Dette tal er blevet ændret fra Gu et al. 2012 2 personer.
Figur 2. Den tid-of-tilføjelse assay for C052. C052 på 2,5 mM og 0,27 mM, blev tilføjet til BTV inficerede celler ved forskellige HPI som anført, og beskyttelse af C052 mod BTV induceret CPE, eller levedygtighed celle, blev målt ved hjælp af CTG kit ved 72 HPI Hver datapunkter repræsenterede den gennemsnitlige værdis og SD fra otte uafhængige gentagelser. Dette tal er blevet ændret fra Gu et al. 2012 2 personer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For den indledende identifikation af antivirale hits, en af de vigtigste trin i antiviral lægemiddelforskning og-udvikling er at udvikle robuste analyser, som omfatter valg af en kvantificerbar markør, udvikle en simpel protokol, opnå tilstrækkelig signaler og mindre end 10% CV. De fleste biokemiske eller cellebaserede skærme er designet til at give en kemisk udgangspunkt baseret på den mest robuste, enkle og billige assay, på grund af den krævede reproducerbarhed i udvælgelsesprocessen, og det potentielt store antal af molekyler, der skal screenes. CPE-baserede assay blev udpeget til at opfylde disse krav for at finde effektive hits fra et stort sammensat bibliotek. CPE refererer til den negative effekt på dyrkede celler forbundet med formeringen af virus. Forskellige assays er tilgængelige til brug CPE indikator gennem måling af en række forskellige markører, der angiver antallet af døde celler (cytotoksicitet), antallet af levende celler (levedygtighed), og mekanismenfor celledød (apoptose). Kommercielle reagenser til CPE-assay findes med en simpel prøvningsprotokol. For eksempel CTG sættet indeholder singlen "mix og måle" skridt og har været meget anvendt til at kvantificere virus induceret CPE. Men CPE-baserede assay er begrænset til vira, der kan fremkalde hurtig CPE. For vira, der ikke inducerer hurtig CPE, har forskellige assays blevet udviklet. For eksempel replikon-baseret assay under anvendelse af replikon-huser cellelinie muliggør screening for inhibitorer af viral replikation, herunder oversættelse, polyproteinforarbejdning og minus-og plus-streng RNA-syntese 12-14. Antisense RNA-strategier og virtuel screening af små molekyler biblioteker også kunne anvendes til at identificere mulige antivirale 15,16. Det er imidlertid afgørende, at effektiviteten af et antiviralt lægemiddel valideres i in vitro cellebaserede assay, som tillader vurdering af antiviral virkning mod hele virale livscyklus. CPE-baseredeassay er med succes blevet tilpasset til high throughput format og er en af de mest pålidelige og robuste assay til screening af store sammensatte biblioteker, herunder nylig udført HTS screeninger mod influenzavirus 6,17, svær akut respiratorisk syndrom coronavirus (SARS-CoV) 18 , arenaviruses 19, og Reovirus (Bluetongue-virus) 5..
Dosis-respons-assay blev udpeget til yderligere at validere den antivirale effekt af hits identificeret via enkeltdosis CPE-assay, som regel efter screening af et stort forbindelse bibliotek. Disse hits, selv identificeret med antiviral aktivitet, kræver yderligere bekræftelse til at afsløre deres potentialer til at blive et lægemiddel. Antiviral effekt af en forbindelse, kan blive afsløret gennem analyse via EC 50, CC 50 og SI 50 værdi vha. analyse dosis respons. I mellemtiden vil ud off-mål eller falske positiver skal identificeres, og antallet af bly compounds kunne indsnævres. Via denne analyse kan rækkefølgen af sammensatte kræfter og toksiciteter rangordnes rette deres fremtidige antivirale lægemiddelforskning, især for struktur-aktivitet relationer (SAR) analyse og fremtidig medicinalkemi modifikation. Faktisk forbindelse C052 var et derivat af forbindelse C003, der er forbundet med gode stof-lignende egenskaber både in vitro og in vivo.
For at opfylde kravene til et lægemiddel, er det et must at bestemme dens MoA, nemlig at karakterisere interaktionen af en forbindelse med sit mål ved fysiologiske koncentrationer. Forskellige assays er blevet udviklet af bestemte antivirale lægemidler, dvs ikke kun hæmme målet, men at have en acceptabel opløselighed, permeabilitet, proteinbinding, selektivitet, metabolisme og toksicitet profiler. Da Landbrugsministeriet studier var lav-throughput assay behov møjsommelige bestræbelser, kun nogle få udvalgte molekyler, med potente EC 50, høj CC 50 og hIGH SI 50-værdi, let kan analyseres. En forståelse MOA af en forbindelse på dette tidspunkt kan tilføje dybde til fortolkningen af cellulær aktivitet eller dens fravær. Toa Undersøgelsen er udpeget til at indsnævre den fase, hvor det antivirale interagerer med virus-eller værten mål. Kendskab til en forbindelse er konkurrencedygtig med et substrat i visse stadie virale livscyklus kan give en umiddelbar retning for yderligere MoA analyse. Alternativt mere potent cellebaseret assay med kendt mekanisme, herunder assay direkte screening for HIV-1-integrase-inhibitorer 20, inhibering af virusbinding til overfladen protein 21 kan anvendes, som giver kendt MoA før de egentlige screeninger 22. Mens hits fra disse screening kan godt relateret til den udpegede MoA, der faktisk MoA kan også nødt til at underkaste ToA og anden virkningsmekanisme-studier for.
Sammenfattende hjælp af de tre analyser er rapporteret her, har vi med succes screenet og identificeretflere potente antivirale midler mod BTV, herunder C003 og C052. 2. Især SI 50 (af C052 var op på 306, hvilket antydede, at C052 er stærkt selektiv mod BTV. Via ToA og andre Landbrugsministeriet undersøgelser præsenteret i det oprindelige papir, foreslog vi, at C052 kunne være en potentiel antiviralt middel interagere med vært autophagy maskiner, kunne udvikles til en anti-BTV stof.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette projekt blev støttet af tilskud 1R03MH08127-01 og 7R03MH08127-02 fra NIH til Q. Li, og af virkningen midler fra Institut for Medicin på UAB til Q. Li. Støtte fra Molette fonden og Auburn University er værdsat. Vi takker også de tekniske assistances fra Ms Pulin Che og Mr. Volodymyr Musiienko i løbet af arbejdet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM medium | Gibco | 1134218 | For cell culture |
| FBS | Gibco | 16000044 | For cell culture |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 1000185 | For cell culture |
| DPBS | Gbico | 1049769 | For cell culture |
| CellTiter-Glo (CTG) kit | Promega | TB288 | For cell viability measurement |
| 70% ethanol | Fisher | S25309B | Diluted from 95% |
| Antiviral huashilcompounds | NIH MLSMR and de novo synthesis | ||
| BTV-10 | ATCC | VR-187 | |
| BSR cell | Developed in house | ||
| Synergy-II multi-mode microplate reader | BioTek | For luminescent signal reading | |
| MicroFlo select dispenser | BioTek | Adding cells, virus, and reagents | |
| 384-well flat-bottom microplate | CORNING | 28908031 | For cell culture |
| Gen. 5 software | BioTek | For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader | |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad | Version 5 | For biostatic analysis and plot |
References
- Hemati, B., et al. Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph. J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).
- Gu, L., et al. Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus. PLoS ONE. 7, e43341 (2012).
- Meiswinkel, R., et al. The 2006 outbreak of bluetongue in northern Europe--the entomological perspective. Prev. Vet. Med. 87, 55-63 (2008).
- Szmaragd, C., et al. Mortality and case fatality during the recurrence of BTV-8 in northern Europe in 2007. Vet. Rec. 161, 571-572 (2007).
- Li, Q., Maddox, C., Rasmussen, L., Hobrath, J. V., White, L. E. Assay development and high throughput antiviral drug screening against Bluetongue virus. Antiviral Research. 83, 267-273 (2009).
- Noah, J. W., et al. A cell-based luminescence assay is effective for high-throughput screening of potential influenza antivirals. Antiviral Res. 73, 50-59 (2007).
- Che, P., Wang, L., Li, Q. The development, optimization and validation of an assay for high throughput antiviral drug screening against Dengue virus. Int. J. Clin. Exp. Med. 2, 363-373 (2009).
- Li, Q., Li, H., Blitvich, B. J., Zhang, J. The Aedes albopictus inhibitor of apoptosis 1 gene protects vertebrate cells from bluetongue virus-induced apoptosis. Insect Mol. Biol. 16, 93-105 (2007).
- Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell number. J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J. Virol. 73, 251-259 (1999).
- Phillips, T., Jenkinson, L., McCrae, C., Thong, B., Unitt, J. Development of a high-throughput human rhinovirus infectivity cell-based assay for identifying antiviral compounds. J. Virol. Methods. 173, 182-188 (2011).
- Harvey, T. J., et al. Tetracycline-inducible packaging cell line for production of flavivirus replicon particles. J. Virol. 78, 531-538 (2004).
- Puig-Basagoiti, F., et al. High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 4980-4988 (2005).
- Puig-Basagoiti, F., et al. Triaryl pyrazoline compound inhibits flavivirus RNA replication. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 1320-1329 (2006).
- Duan, M., et al. In vitro and in vivo protection against the highly pathogenic H5N1 influenza virus by an antisense phosphorothioate oligonucleotide. Antivir. Ther. 13, 109-114 (2008).
- Ray, D., Shi, P. Y. Recent advances in flavivirus antiviral drug discovery and vaccine development. Recent Pat. Antiinfect. Drug Discov. 1, 45-55 (2006).
- Severson, W. E., et al. High-throughput screening of a 100,000-compound library for inhibitors of influenza A virus (H3N2). J. Biomol. Screen. 13, 879-887 (2008).
- Severson, W. E., et al. Development and validation of a high-throughput screen for inhibitors of SARS CoV and its application in screening of a 100,000-compound library. J. Biomol. Screen. 12, 33-40 (2007).
- Bolken, T. C., et al. Identification and characterization of potent small molecule inhibitor of hemorrhagic fever New World arenaviruses. Antivir. Res. 69, 86-97 (2006).
- Van Loock, M., et al. A novel high-throughput cellular screening assay for the discovery of HIV-1 integrase inhibitors. J. Virol. Methods. 179, 396-401 (2012).
- Kampmann, T., et al. In silico screening of small molecule libraries using the dengue virus envelope E protein has identified compounds with antiviral activity against multiple flaviviruses. Antiviral Res. 84, 234-241 (2009).
- Kirchmair, J., et al. Development of anti-viral agents using molecular modeling and virtual screening techniques. Infect. Disord. Drug Targets. 11, 64-93 (2011).
