Summary
Trois essais, y compris l'effet cytopathique (CPE) à base de test, essai dose-réponse et (TOA) test à temps de Addition ont été développés, optimisés, validés et utilisés pour identifier de nouveaux antiviraux contre le virus de la fièvre catarrhale (BTV), ainsi à déterminer le Mécanisme d'action-de-possible (MOA) pour antiviraux nouvellement identifiés.
Abstract
Pour identifier les antiviraux potentiels contre BTV, nous avons développé, optimisé et validé trois essais présentés ici. L'essai à base de CPE-a été le premier essai mis au point pour évaluer si un composé a montré une quelconque efficacité antivirale et ont été utilisés pour cribler grande bibliothèque de composés. Pendant ce temps, la cytotoxicité des antiviraux pourrait également être évaluée en utilisant le test basé CPE. L'analyse dose-réponse a été conçu pour déterminer la plage de l'efficacité de l'antiviral choisi, c'est à dire 50% de la concentration inhibitrice (CI 50) ou la concentration efficace (CE 50), ainsi que sa gamme de cytotoxicité (CC 50). Le dosage ToA a été utilisée pour l'étude initiale MoA pour déterminer le mécanisme sous-jacent des nouveaux antiviraux pendant BTV cycle de vie viral ou l'effet possible sur la machinerie cellulaire de l'hôte. Ces dosages sont vitales pour l'évaluation de l'efficacité antivirale dans un système de culture cellulaire, et ont été utilisés pour conduire nos recherches récentesment à l'identification d'un certain nombre de nouveaux antiviraux contre BTV.
Introduction
BTV est un virus à ARN double brin prototype dans le genre Orbivirus, famille Reoviridae. BTV est une des maladies les plus importantes de bétail domestique, y compris les ovins, les caprins, les bovins et d'autres animaux domestiques, avec une perte $ 3000000000 / année dans le monde 1,2. Le sérotype BTV exotique est un agent pathogène important animale énumérés dans les "USDA Haute Conséquence agents pathogènes du bétail." Récemment, la ré-émergentes de BTV a causé une épidémie majeure de la maladie chez les bovins et les moutons dans plusieurs pays d'Europe du Nord 3,4. En raison de son importance économique et en tant que système modèle, BTV a fait l'objet d'études moléculaires, génétiques et structurales étendues, et plusieurs vaccins ont été mis au point. Toutefois, en raison de l'absence de tests adéquats pour la découverte de médicaments antiviraux, il n'y a pas d'antiviraux disponibles contre la maladie.
Dans un récent criblage à haut débit (HTS) de la campagne en utilisant BTV comme système modèle, nous Developed, optimisé et validé un test basé sur CPE à identifier des antiviraux à large spectre contre les arbovirus potentiels 5. Dosage à base de CPE est un test bien connu qui a été utilisé dans la découverte de médicaments antiviraux contre un certain nombre de virus qui induit rapide et observable CPE / apoptose 5-7. Dans notre système, après l'infection virale, CPE est évident dans les cellules de vertébrés, y compris les cellules HeLa, BSR, et HEK 293T 8. CPE BTV-induite peut être surveillée et quantifiée à l'aide de divers procédés de détection de la viabilité cellulaire, y compris le kit de réactifs de viabilité cellulaire CellTiter Glo (kit CTG) 9. Cet ensemble détermine le nombre de cellules viables dans la culture sur la base de la quantification de l'ATP cellulaire présenté, ce qui signale la présence de cellules vivantes métaboliquement actives. Dans des conditions optimisées, le dosage à base de CPE-présentée ici a montré sa faisabilité avec le "mélanger et mesurer" protocole en une étape, et la flexibilité avec des signaux luminescents stables. Pendant ce temps, les composés toxiques Reducement viabilité cellulaire sera exclu de cette analyse à base de CPE. Le dosage à base de CPE-a montré sa robustesse et sa fiabilité pour antivirale découverte de médicaments contre la maladie, et a été utilisé pour cribler des bibliothèques moléculaires référentiel NIH petites molécules (MLSMR), ce qui conduit à l'identification de six nouveaux groupe de potentiel antiviral composé de plomb (s ) 5.
Quand un composé antiviral potentiel a été identifié en utilisant l'essai à base de CPE, il devra être soumis à l'essai dose-réponse dix-concentration pour déterminer la plage d'efficacité antivirale et la cytotoxicité 2. L'efficacité antivirale, représentée comme la concentration inhibitrice 50% (CI 50), soit la concentration efficace 50% (EC50) est la concentration d'un médicament qui inhibe la CPE à mi-chemin viro-induite entre la ligne de base et au maximum. La cytotoxicité des antiviraux, c'est à dire la concentration de la cytotoxicité de 50% (CC 50), est la concentrationd'un médicament induisant une cytotoxicité de 50% entre la ligne de base et au maximum. L'indice sélectif (SI), noté 50% SI (SI 50) est calculée à partir de CC 50 / IC 50 qui détermine la spécificité de la antivirale contre le CPE induit par un virus. La CI 50 (ou 50 CE), CC 50 et SI 50 valeurs sont des mesures essentielles pour déterminer si un composé antiviral est puissant et sélectif pour la poursuite du développement de médicaments.
Quand un antiviral n'a montré aucune toxicité manifeste in vitro, encore empêché virus induit CPE et le cycle de vie virale productive, il est important de caractériser son mode d'action 2. Nous avons lancé cette qualification en réalisant essai ToA pour déterminer l'étape possible (s) de cycle de vie viral qui est affecté par l'antiviral. En général, composé antiviral ont été ajoutés à des cellules à différents moments pré-ou post-infection virus. Si les antiviraux ont été ajoutés à des cellules infectées poster à son objectif detep au cours de l'infection, il en résulterait une activité plus faible par rapport à celle qui a été ajoutée avant l'étape. Ainsi, l'étude ToA est critique pour la détermination de l'efficacité antivirale d'un composé, et sa cible potentielle, soit sur le cycle de vie viral ou la machinerie de l'hôte impliquées dans le cycle de vie viral.
Pour les trois essais, la viabilité cellulaire a été déterminée en utilisant le kit CTG suivant les instructions du fabricant 5. Ce système de détection émet des signaux de luminescence adéquates qui pourraient être analysés à l'aide de divers logiciels en interne. Chaque essai a été validé et effectué au moins en triple exemplaire avec huit répliques. Pour l'ensemble des données obtenues, trois paramètres, y compris la valeur moyenne (AVE), l'écart type (STDEV), et coefficient de variation (CV) ont été analysés afin de déterminer la robustesse de l'analyse. Une fois la robustesse de l'analyse a été déterminé, les données seront analysés et obtenues en utilisant différents biostatistique et graphiquementdes outils de c 2.
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Protocol
Une. Cellules, virus et les composés antiviraux
- Maintenir les cellules BSR, un dérivé de rein de bébé hamster (BHK), les cellules 10 dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) contenant 5% de sérum de veau foetal (FCS), 100U/ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine.
- Pour les trois essais, les cellules de la plaque dans du DMEM avec 1% de FCS, 100U/ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine, comme précédemment optimisés 5. Ce milieu est désigné en tant que milieu de test pour chacun des trois essais.
- Incuber les cellules dans l'incubateur à 37 ° C, avec 5% de CO 2 et de 80 à 95% d'humidité.
- Plaque-purifier et de propager le type 10 BTV (BTV-10) comme décrit précédemment 8. Diluer BTV-10 en milieu de dosage pour chacun des essais désignés.
- Dissoudre tous les composés d'essai dans du DMSO pour former un stock de concentration à 10 mM. Conserver les stocks à -20 ° C.
- Diluer les composés à des concentrations désirées en utilisant un milieu de dosage pour la personne désignéed 2 dosages.
2. Essai sur la base-CPE en utilisant le kit CTG
- Semences cellules BSR dans une microplaque 384 puits (noir, le format de 16 x 24) par l'intermédiaire MicroFlo sélectionnez distributeur. La densité d'ensemencement est de 5000 cellules / puits et le volume d'ensemencement est de 20 pi pour l'analyse de l'efficacité antivirale.
- Incuber les cellules pendant 2-3 heures jusqu'à obtenir des cellules adhérentes à la plaque à fond.
- Ajouter composé antiviral avec une concentration finale de 10 pM à chaque puits. Mélanger complètement.
- Diluer BTV à titre désiré et ajouter 5 pi BTV avec MOI notée à chaque puits. Pour le contrôle du puits, ajouter 5 ul de milieu de dosage. Incuber les cellules infectées pour 72 heures à 37 ° C, avec 5% de CO 2 et de 80 à 95% d'humidité.
- À 72 hpi, dégel et équilibrer tampon CTG et le substrat CTG lyophilisé à la température ambiante avant de l'utiliser. Reconstituer la solution de réactif CTG homogène en mélangeant l'enzyme / substrat et le réactif lyophilisé tampon selon la thles instructions du fabricant de e.
- Equilibrer les plaques de dosage à température ambiante pendant 15 min.
- Ajouter un volume égal (25 ul) de réactifs CTG dans chaque puits par un distributeur. Après une incubation de 15 min à température ambiante dans l'obscurité, mesurer des signaux de luminescence en utilisant un lecteur multi-mode avec un temps d'intégration de 0,1 s.
3. Dose-réponse Assay
- Semence des cellules BSR dans une microplaque à 384 puits (noir; format en 16 x 24) par l'intermédiaire d'un distributeur, avec une densité d'ensemencement de 5000 cellules / puits dans un volume d'ensemencement de 20 ul pour le dosage de l'efficacité antivirale et 25 ul pour le dosage de cytotoxicité, respectivement .
- Incuber les cellules pendant 2-3 heures à 37 ° C, avec 5% de CO 2 et de 80 à 95% d'humidité jusqu'à ce que les cellules sont bien fixés à la plaque.
- Procédé de dosage dans une zone de quart de la plaque de 384 puits pour chaque composé (équivalent à une plaque de 96 puits), comme indiqué dans le tableau 1. Allouer huit répétitions pour chaque concentrationdans un seul dosage. Attribuez la première colonne que le contrôle positif sans ajout de composé et virus, et la dernière colonne (12 e) comme contrôle négatif en ajoutant virus seulement sans composés.
- Diluer les composés à 50 uM dans le milieu d'essai et ajouter à la colonne 2 ème à 20 ul / puits pour le dosage de l'efficacité antivirale. Mélanger le composé à cinq reprises en utilisant une pipette à 8 canaux semi-automatique à une concentration de 25 uM.
- Utilisation de la pipette semi-automatique à 8 canaux, transférer 20 mélange de pi en 2 ème colonne à la colonne suivante (3 e), bien mélanger pour former une concentration de 12,5 uM. Répéter ce processus en transférant 20 ul de mélange de 3 ème colonne de la colonne suivante (4 e) pour former une autre double dilution à une concentration de 6,25 pM. Répétez cette dilution en série deux fois jusqu'à la 11 ème colonne. Aspirer et jeter 20 pi du mélange dans 11 ième colonne après l'ajout et le mélange de l'échantillonplaies.
- Ajouter basé sur MOI de 0,01 BTV-10,, dans chaque puits de la colonne 2 à la colonne 11 avec un volume de 5 ul / puits. Après avoir ajouté le virus, la concentration en composé final dans chaque colonne doit être de: 20 uM dans la colonne 2, 10 uM dans la colonne 3, et continue avec une dilution au double de la colonne 11 vers le bas avec une concentration finale de 0,04 uM.
- Ajouter 5 ul de milieu à la colonne 1 que la cellule ne contrôle (positif) et 5 pl / puits de BTV à la colonne 12 de l'infection virale ne contrôle (négatif).
- Diluer les composés à une concentration initiale de 200 uM pour le dosage de cytotoxicité. De même, ajouter 25 pl / puits de composé à la colonne 2 et 5 fois mélangé avec pipette semi-automatique à 8 canaux à une concentration de 100 uM. Ne pas ajouter de BTV.
- Effectuer la série dilution deux fois par aspiration 25 pi de la colonne 2 de la colonne voisine 3, et a continué jusqu'à la dernière colonne (12 e). A la colonne 12, après mélange, aspirer et rejeter 25 ul de mélange. La concentration finale de la colonne 2 doit être de 100 uM et le 12 e colonne doit être à 0,2 uM. La colonne 1 est le seul contrôle de la cellule.
- Pour les deux dosages de cytotoxicité et de l'efficacité antivirale, incuber les plaques à 37 ° C, avec 5% de CO 2 et de 80 à 95% d'humidité pendant 72 post-traitement d'une heure. Mesurer la viabilité des cellules en utilisant le kit CTG comme décrit ci-dessus (protocole étapes 2.5 à 2.7).
4. Temps de Addition (TOA) Dosage
- Cellules semences de BSR de la colonne 1-24 dans une microplaque 384 puits (noir, le format de 16 x 24) par l'intermédiaire d'un distributeur à 5.000 cellules / puits et le volume de semis est de 15 pl / puits.
- Pour chaque composé, utiliser toutes les vingt-quatre colonnes avec huit répliques pour chaque point de temps dans une moitié de la plaque de 384 puits (tableau 2). Attribuer la colonne 1 que les cellules ne contrôle en ajoutant 10 pl / puits moyen essai. Mark colonne 24 que l'infection virale que de contrôle (contrôle négatif) en ajoutant 5 ul / puits dosage moyen d'unvirus d 5 ul / puits à une MOI de 0,01 et un volume final de 25 pl / puits.
- Sélectionnez les colonnes impaires de la colonne 2-22 de la colonne d'évaluation de l'efficacité comme antiviral à différents infection heures de poste (HPI). Dans ces colonnes, infecter les cellules avec 5 pl / puits BTV à une MOI de 0,01. Au hpi différent, aussi ajouter 5 ul / puits composé dilué dans chaque puits pour former un volume final de 25 pl / puits. Pour le notées -2 et -1 hpi ajouter composé de cellules BSR avant l'infection virale. Pour 0 hpi, ajouter le composé et BTV à la culture en même temps.
- En parallèle, désigner les colonnes impaires à partir de la colonne 3 à 23 en tant que composé ne contrôle que, de ce composé ont été ajoutés à différents points de temps désigné (-2, -1, 0, 1, 2, 4, 8, 16, 24, 48 hpi). Dans ces colonnes, ajouter 5 pl de milieu / puits de dosage et de 5 pl / puits dilué composé pour former un volume final de 25 pl / puits.
- Après le traitement, les cellules incuber à 37 ° C, 5% de CO 2 avec 80 à 95% d'humidité.
- Déterminer la viabilité des cellules à 72 hpi en utilisant le kit CellTiter-Glo comme décrit précédemment (protocole étapes 2.5 à 2.7).
5. Analyse des données
- Traiter toutes les données de la première utilisation du logiciel approprié en interne sur la base des signaux luminescents obtenus via le lecteur multi-mode. Déterminer la valeur moyenne (moyenne), l'écart-type (STDEV) pour chaque traitement ainsi que les variations de coefficient (CV), qui nécessite une valeur supérieure à 10%.
- Transférer les données traitées par le logiciel ci-dessus pour un outil logiciel biostatique et graphique. Effectuer l'analyse de régression non linéaire pour déterminer les valeurs de la CE 50 et CC 50.
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Representative Results
Une. Efficacité antivirale du composé
Le dosage de la CPE à base de cellules a été développé, optimisé et validé in vitro en utilisant le kit CTG base luminescente à identifier de nouveaux antiviraux contre la maladie, comme décrit précédemment 2,5. Le dosage de la réponse dix-dose a été utilisée pour tenir compte de l'efficacité antivirale et la cytotoxicité d'un composé de plomb identifiés en mesurant le nombre de cellules métaboliquement viables dans la culture sur la base de la quantification de l'ATP cellulaire présenté dans les cellules vivantes 5,11. Dans notre précédent rapport, un certain nombre de composés antiviraux potentiels ont été évalués, y compris les composés de chaque groupe identifié par HTS contre BTV 5, et leurs dérivés par synthèse de novo 2. En fonction de leur CE 50, CC 50 et SI 50, plusieurs composés de plomb prometteurs ont été identifiés avec une efficacité antivirale puissante, une faible toxicité et une sélectivité élevée. Par exemple, compound052 (C052)a été déterminée à avoir un CE 50 de 0,27 ± 0,12 uM (figure 1) 2 et un CC 50 de 82,69 uM, les deux courbes montrant régressifs typiques en vertu de la régression non linéaire analyses 2. Le SI 50 de C052 a été déterminée à 306 sur la base de ses 50 CE et CC 50 valeurs. L'efficacité de l'échelle nanomolaire antiviral, faible toxicité, et par conséquent une grande SI 50 ont indiqué que C052 pourrait être un antiviral puissant et sélectif contre le BTV.
2. Ministère de l'agriculture potentiel pour le composé antiviral
Le dosage ToA visait à déterminer le degré possible (s) de cycle de vie viral ciblé par des composés. Lors de l'ajout C052 à 1 ou 2 heures avant l'infection virale, soit -1 et -2 hpi, les efficacités antiviraux sont restés à l'échelle nanomolaire (figure 2) 2, ce qui indique que C052 peut agir au-delà du stade de cycle de vie viral, tels que l'entrée du virus. Furthermore, l'efficacité antivirale est resté inchangé jusqu'à C052 a été ajouté aux cellules infectées que plus tard que le 24 hpi. Lorsqu'il est ajouté à 32 hpi, le pourcentage de cellules viables a diminué dans des cellules C052 de traitement, ce qui indique que moins de protection C052 était à ce stade du cycle de vie viral. Si l'on ajoute à 48 hpi, il n'y avait aucune protection pour les cellules BSR de CPE BTV-induite. Depuis le premier cycle de réplication virale BTV s'effectuera dans les cellules infectées dans les 24 HPI, nos résultats suggèrent que C052 peut agir à la fin des étapes de BTV cycle de vie viral, telles que la réplication du virus, l'emballage, la maturation et la sortie. Pendant ce temps, il est également possible que C052 peut agir sur les mécanismes cellulaires de l'hôte qui ont participé à la fin de cycle de vie viral-2.
Tableau 1. La disposition de la plaque de dosage dose-réponse. L'efficacité antivirale de C052 a été d'évaluerd sur une échelle de 96 puits dans la plaque 384 puits. Chaque traitement, y compris l'infection virale ainsi que différentes concentrations C052, a été réalisée avec huit répliques. À 72 hpi, la viabilité cellulaire a été déterminée en utilisant le kit CTG.
Tableau. 2 Le plan de plaque pour le dosage à temps de Addition (TOA). L'essai de ToA C052 a été évaluée dans la plaque 384 puits comme indiqué dans la présentation. Chaque traitement, y compris l'infection virale, plus le temps d'ajouter C052, a été réalisée avec huit répliques. L'IPH -2 et -1 indiquent que C052 a été ajouté aux cellules avant l'infection virale. À 0 hpi, BTV et C052 ont été ajoutés simultanément. À 72 hpi, la viabilité cellulaire a été déterminée en utilisant le kit CTG. Cliquez ici pour voir le tableau .
Figure 1. L'efficacité antivirale de C052. Cellules ont été infectées par ce virus à une MOI de 0,01 en présence de dix concentrations différentes de C052, comme indiqué sur la figure. La viabilité cellulaire a été déterminée à 72 hpi, en utilisant le kit CTG. Chaque point de données représente moyens et SD de cinq répétitions. Ce chiffre a été modifié depuis Gu et al. 2012 2.
Figure 2. Le test de temps de plus pour C052. C052 à 2,5 mM et 0,27 mM, respectivement, a été ajouté aux cellules infectés par le virus de hpi différente comme indiqué, et la protection de la C052 contre CPE BTV induits, ou la viabilité des cellules, a été mesurée en utilisant la kit CTG à 72 hpi Chaque points de données représentant la valeur moyennes et SD de huit répétitions indépendantes. Ce chiffre a été modifié depuis Gu et al. 2012 2.
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Discussion
Pour l'identification initiale des résultats antiviraux, l'une des étapes clés pour la découverte de médicaments antiviraux et de développement est de développer des tests robustes, qui comprend la sélection d'un marqueur quantifiable, l'élaboration d'un protocole simple, obtenir suffisamment de signaux et moins de 10% CV. La plupart des écrans biochimiques ou cellulaires sont conçus pour fournir un point de départ chimique sur la base du plus robuste, un test simple et peu coûteux, en raison de la reproductibilité requise dans le processus de sélection et le nombre potentiellement élevé de molécules à cribler. Le dosage à base de CPE-a été désigné pour répondre à ces exigences pour identifier résultats efficaces à partir d'une grande bibliothèque de composés. CPE fait référence à l'effet néfaste sur les cellules en culture associées à la multiplication des virus. Différents dosages sont disponibles à utiliser l'indicateur de mesure de CPE à travers une série de différents marqueurs qui indiquent le nombre de cellules mortes (cytotoxicité), le nombre de cellules vivantes (viabilité), et le mécanismede la mort cellulaire (apoptose). Réactifs commerciaux pour analyse à base de CPE sont disponibles avec un protocole de test simple. Par exemple, le kit comprend le CTG "mélanger et mesurer" en une seule étape et a été largement utilisé pour quantifier le virus induit CPE. Cependant, le dosage en fonction CPE est limitée à des virus qui pourraient induire CPE rapide. Pour les virus qui n'induisent pas de CPE rapide, divers essais ont été développés. Par exemple, le dosage à base de réplicon-en utilisant la lignée de cellules hébergeant réplicon permet le criblage d'inhibiteurs de la réplication virale, y compris la traduction, de la transformation de la polyprotéine, et moins-plus-brin et la synthèse d'ARN de 12 à 14. Les stratégies d'ARN antisens et le criblage virtuel de bibliothèques de petites molécules peuvent également être utilisés pour identifier d'éventuelles 15,16 antiviraux. Néanmoins, il est essentiel que l'efficacité d'un médicament antiviral être validé dans le dosage à base de cellules in vitro, ce qui permet l'évaluation de l'efficacité antivirale contre l'ensemble du cycle de vie viral. À base de CPEtest a été adapté avec succès en format à haut débit et est l'une des méthode la plus fiable et robuste pour le criblage de grandes bibliothèques de composés, y compris récemment accomplis HTS projections contre le virus de la grippe 6,17, syndrome respiratoire coronavirus aigu sévère (SRAS-CoV) 18 , arénavirus 19, et réovirus (virus fièvre catarrhale du mouton) 5.
L'analyse dose-réponse a été désigné pour valider davantage l'efficacité antivirale des résultats identifiés par le dosage à base de CPE-dose unique, généralement après criblage d'une grande bibliothèque de composés. Ces résultats, bien identifié avec une activité antivirale, doivent encore confirmation de révéler leur potentiel de devenir un médicament. Efficacité antivirale d'un composé pourrait être révélé par l'analyse par CE 50, CC 50 et SI 50 valeur à l'aide de l'analyse dose-réponse. Pendant ce temps, sur hors cible ou faux positifs seront identifiés, et le nombre de plomb échantillonles plaies pourraient être réduit. Via cette analyse, l'ordre des puissances de composés et la toxicité pourrait être classé à diriger future découverte de médicaments antiviraux, en particulier pour la relation structure-activité (SAR) analyse et de futures modifications de la chimie médicinale. En fait, composé C052 était un dérivé du C003 composé, ce qui associé à de bonnes propriétés de drogue comme la fois in vitro et in vivo.
Pour répondre aux exigences d'un médicament, il est indispensable de déterminer son mode d'action, c'est à dire de caractériser l'interaction d'un composé avec sa cible à des concentrations physiologiques. Différents tests ont été mis au point des antiviraux particuliers, soit pour inhiber non seulement la cible, mais à avoir une solubilité acceptable, la perméabilité, la protéine de liaison des profils, sélectivité, le métabolisme et la toxicité. Puisque les études ministère de l'Agriculture étaient bas-débit dosage besoin laborieux efforts, seulement quelques molécules sélectionnées, avec puissant CE 50, haute CC 50 haute SI 50 valeur, pourrait être facilement analysé. Une compréhension du Ministère de l'agriculture d'un composé à ce stade peut ajouter de la profondeur à l'interprétation de l'activité cellulaire ou son absence. L'étude ToA est désigné pour affiner la scène lorsque l'antiviral interagit avec les cibles virales ou d'accueil. Connaissant un composé est en concurrence avec un substrat au stade certain cycle de vie viral pourrait fournir une direction immédiate pour une analyse plus approfondie MdA. Sinon, essai à base de cellules plus puissant avec mécanisme connu, comprenant une épreuve écran directement pour le VIH-1 inhibiteurs de l'intégrase 20, inhibition de la liaison à la surface des protéines 21 virus pourrait être utilisé qui fournissent MoA connu avant projections réelles 22. Alors que les résultats du dépistage peuvent bien liée à la MdA désigné, il fait MdA peut aussi avoir besoin de soumettre à ToA et un autre mécanisme d'études d'action.
En résumé, en utilisant les trois essais présentés ici, nous avons examiné avec succès et identifiéplusieurs antiviraux puissants contre BTV, y compris C003 et C052 2. En particulier, la SI 50 (de C052 était à 306, ce qui suggère que C052 est très sélective contre la maladie. Via les Toa et les autres études présentées ministère de l'Agriculture dans le document original, nous avons proposé que C052 pourrait être un agent antiviral potentiel d'interaction avec l'hôte machines de l'autophagie, pourrait être développé en un médicament anti-BTV.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Ce projet a été financée par la subvention 1R03MH08127-01 et 7R03MH08127-02 du NIH à Q. Li, et par les fonds d'IMPACT du Département de médecine de l'UAB à Q. Li. Le soutien du Fonds Molette et l'Université d'Auburn est appréciée. Nous remercions également les aides techniques de Mme Pulin Che et M. Volodymyr Musiienko au cours des travaux.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM medium | Gibco | 1134218 | For cell culture |
| FBS | Gibco | 16000044 | For cell culture |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 1000185 | For cell culture |
| DPBS | Gbico | 1049769 | For cell culture |
| CellTiter-Glo (CTG) kit | Promega | TB288 | For cell viability measurement |
| 70% ethanol | Fisher | S25309B | Diluted from 95% |
| Antiviral huashilcompounds | NIH MLSMR and de novo synthesis | ||
| BTV-10 | ATCC | VR-187 | |
| BSR cell | Developed in house | ||
| Synergy-II multi-mode microplate reader | BioTek | For luminescent signal reading | |
| MicroFlo select dispenser | BioTek | Adding cells, virus, and reagents | |
| 384-well flat-bottom microplate | CORNING | 28908031 | For cell culture |
| Gen. 5 software | BioTek | For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader | |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad | Version 5 | For biostatic analysis and plot |
References
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