Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

מבחני לזיהוי של antivirals הרומן נגד וירוס Bluetongue

Published: October 11, 2013 doi: 10.3791/50820

Summary

שלושה מבחני, כולל השפעת cytopathic (CPE) מבוססת assay, assay מנת התגובה וassay בזמן של תוספת (TOA) פותחו, אופטימיזציה, תוקף ומנוצל כדי לזהות antivirals רומן נגד וירוס Bluetongue (BTV), כמו גם כדי לקבוע את הפעולה מנגנון-of-האפשרית (משרד חקלאות) לantivirals זיהה לאחרונה.

Abstract

לזהות antivirals הפוטנציאלי נגד BTV, פיתחנו, מותאם ומאומתים שלושה מבחני שהוצגו כאן. Assay מבוסס CPE היה assay הראשון שפותח כדי להעריך אם מתחם הראה שום יעילות אנטי ושמש למסך ספריית מתחם גדולה. בינתיים, cytotoxicity של antivirals יכול גם להיות מוערך באמצעות assay מבוסס CPE. Assay מנת התגובה נועד לקבוע את טווח היעילות לנגיפים שנבחרו, כלומר 50% ריכוז מעכב (IC 50) או ריכוז יעיל (50 EC), כמו גם מגוון של cytotoxicity (CC 50). Assay TOA הועסק ללימוד משרד החקלאות הראשוני כדי לקבוע את המנגנון הבסיסי של antivirals הרומן במהלך מחזור חיים נגיפיים BTV או ההשפעה האפשרית על מנגנון תאי מארח. מבחני אלה הם חיוניים להערכת יעילות אנטי במערכת תרבית תאים, והיה בשימוש במשך המחקרים האחרונים שלנו להובילing לזיהוי של מספר התרופות אנטי רומן נגד BTV.

Introduction

BTV הוא וירוס RNA כפול גדילי אב טיפוס בסוג Orbivirus, משפחת Reoviridae. BTV הוא אחת המחלות החשובות ביותר של בעלי חיים מקומיים, ובם כבשים, עז, בקר וחיות בית אחרות, עם אובדן 3000000000 $ / שנה ברחבי העולם 1,2. סרוטיפ BTV האקזוטי הוא פתוגן בעלי חיים חשוב מופיע בסעיף 'פתוגנים משק החי התוצאה USDA גבוהה ". לאחרונה, מחדש מתפתח של BTV גרם להתפרצות גדולה של מחלה בבקר וצאן במספר המדינות באירופה הצפונית 3,4. כתוצאה מהמשמעות הכלכלית שלה כמערכת מודל, BTV כבר את הנושא של מחקרים מולקולריים, גנטיים ומבניים נרחבים, ומספר חיסונים פותחו. עם זאת, בשל המחסור במבחנים ראויים לגילוי תרופות אנטי, אין antivirals זמין נגד BTV.

בהקרנת תפוקה גבוהה לאחרונה במסע פרסום (HTS) תוך שימוש BTV כמערכת המודל, אנחנו דeveloped, מותאם ומאומתים assay מבוסס CPE לזהות antivirals ספקטרום רחב הפוטנציאלי נגד arboviruses 5. assay מבוסס CPE הוא assay מוכר היטב כי כבר בשימוש בגילוי תרופות אנטי נגד מספר הווירוסים שנגרם CPE / אפופטוזיס המהיר והנצפה 5-7. במערכת שלנו, זיהום BTV הודעה, CPE בא לידי ביטוי בתאים בעלי חוליות, כוללים הלה, ב.ס. ר, וHEK 293T 8. CPE-Induced BTV יכול להיות במעקב ולכמת באמצעות שיטות זיהוי כדאיות תא שונות, כוללים ערכת CellTiter Glo מגיב כדאיות תא (ערכת CTG) 9. ערכה זו קובע את מספר תאי קיימא בתרבות המבוססת על quantitation של ה-ATP הסלולרי הוצג, מה שמסמן את נוכחותם של תאי חיים פעילים מטבולית. בתנאים אופטימליים, מבוסס assay CPE מוצג כאן הראה ההיתכנות שלה עם הפרוטוקול "לערבב ולמדוד" צעד אחד, וגמישות עם אותות זורח יציבים. בינתיים, Redu תרכובות רעילותcing כדאיות תא לא ייכללו בassay מבוסס CPE זה. Assay מבוסס CPE הראה עמיד ואמין לגילוי תרופה אנטי נגד BTV שלה, ומאז משמש למסך NIH הספריות מולקולריות המולקולה קטנה Repository (MLSMR), מה שמוביל לזיהוי של שישה אשכול רומן של מתחם להוביל אנטי פוטנציאלי (ים ') 5.

כאשר תרכובת אנטי פוטנציאלית זוהתה באמצעות assay מבוסס CPE, זה יהיה צריך להיות חשוף לassay מנת תגובת עשר הריכוז כדי לקבוע את טווח היעילות וcytotoxicity 2 אנטי. היעילות אנטי, מיוצג כ50% הריכוז המעכב (50 IC) או 50% הריכוז היעיל (50 EC), היא הריכוז של תרופה אשר מעכבת באמצע הדרך CPE-induced וירוס בין קו הבסיס והמקסימום. Cytotoxicity של antivirals, כלומר ריכוז 50% cytotoxicity (CC 50), הוא הריכוזשל תרופת גרימת 50% מcytotoxicity בין קו הבסיס והמקסימום. המדד סלקטיבית (SI), מסומן כ50% SI (50 SI) מחושב מCC 50 / IC 50 הקובע את הספציפיות של נגיפים נגד CPE-induced וירוס. IC 50 (או 50 EC), CC 50 וSI 50 ערכים הם צעדים קריטיים כדי לקבוע אם תרכובת אנטי היא חזקה ובררנית לפיתוח תרופות נוסף.

כאשר נגיפים לא הראו כל רעילות גלויה במבחנה, אך וירוס מנע מושרה CPE ומחזור החיים הנגיפי היעיל, חשוב לאפיין משרד החקלאות שלה 2. אנחנו יזמנו אפיון כזה על ידי ביצוע assay TOA כדי לקבוע את הצעד האפשרי (ים) של מחזור החיים נגיפי שמושפע אנטי. באופן כללי, מתחם אנטי נוספו לתאים בזמנים שונים מראש או זיהום שלאחר וירוס. אם antivirals נוספו לתאים הנגועים לפרסם ליעד שלהTEP במהלך ההדבקה, הוא יביא לפעילות נמוכה יותר בהשוואה לזו שהתווסף לפני הצעד. לכן, מחקר TOA הוא קריטי לקביעת היעילות אנטי של מתחם, והיעד הפוטנציאלי שלו, או על מחזור החיים הנגיפי או מכונות המארח מעורבות במחזור החיים הנגיפי.

לכל שלושת מבחני, כדאיות תא נקבעה באמצעות ערכת CTG בעקבות ההוראה של היצרן 5. מערכת זיהוי זה פלטי אותות הארה הולמים שיכול להיות מנותח באמצעות תוכנות שונות בבית. כל assay קבל תוקף ומתבצע לפחות בשלושה העתקים עם שמונה העתקים. לכל הנתונים שהתקבלו, שלושה פרמטרים, כולל ערך ממוצע (AVE), סטיית תקן (STDEV), ווריאצית שיתוף יעיל (CV) נותחו על מנת לקבוע את החוסן של assay. ברגע שהחוסן של assay נקבע, הנתונים ינותחו נוספים וזממו באמצעות יוסטאטיקה וgraphi שוניםכלים ג 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תאים, וירוסים והתרכובות אנטי

  1. שמור על תאים ב.ס. ר, נגזרת של כליות אוגר תינוק תאים (BHK) 10, במדיום של הנשר שונה Dulbecco (DMEM) המכילה 5% עוברי עגל בסרום (FCS), פניצילין 100U/ml ו100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין.
  2. לכל שלושת מבחני, תאי צלחת בDMEM עם FCS 1%, פניצילין 100U/ml ו100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, כמותאמים בעבר 5. בינוני זה התייחס כמדיום assay לכל שלושת מבחני.
  3. דגירה כל התאים בחממה על 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO 2 ולחות 80-95%.
  4. פלאק-לטהר ולהפיץ את הסוג 10 BTV (BTV-10) כפי שתואר לעיל 8. לדלל BTV-10 במדיום assay עבור כל מבחני מיועדים לכך.
  5. ממיסים את כל חומרי הבדיקה בDMSO כדי ליצור מניות עם ריכוז ב10 מ"מ. אחסן את המניות ב -20 ° C.
  6. לדלל תרכובות לריכוזים רצויים באמצעות מדיום assay ללייעדמבחני ד 2.

2. Assay מבוסס CPE באמצעות ערכת CTG

  1. תאי זרע ב.ס. ר לmicroplate 384 גם (שחור; פורמט ידי 16 x 24) באמצעות מתקן בחר MicroFlo. צפיפות הזריעה היא 5,000 תאים / היטב, וזריעת הנפח 20 μl לניתוח יעילות אנטי.
  2. דגירה תאים למשך 2-3 שעות עד שתאים מקבלים חסיד אל הצלחת ביסודיות.
  3. הוספת מתחם אנטי עם ריכוז סופי של 10 מיקרומטר היטב כל אחד. לערבב אותו לחלוטין.
  4. לדלל BTV לכייל רצוי ולהוסיף 5 BTV μl עם משרד הפנים מסומנים היטב כל אחד. לשליטה טובה, להוסיף 5 μl של תקשורת assay. דגירה התאים הנגועים ל72 שעות על 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO 2 ולחות 80-95%.
  5. ב72 HPI, הפשרה ולאזן חיץ CTG ומצע CTG lyophilized לטמפרטורת חדר לפני השימוש. מחדש את הפתרון מגיב CTG הומוגנית על ידי ערבוב של האנזים / מצע lyophilized ומגיב חיץ על פי ההוראות יצרן דואר.
  6. לאזן את צלחות assay לטמפרטורת חדר במשך 15 דקות.
  7. הוסף נפח שווה (25 μl) של חומרים כימיים CTG היטב כל אחד על ידי מתקן. לאחר דוגרים במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר בחושך, למדוד אותות הארה באמצעות קורא מצב מרובה עם זמן אינטגרציה של 0.1 שניות.

3. Assay מנת התגובה

  1. תאי זרע ב.ס. ר לmicroplate 384 גם (שחור; פורמט ידי 16 x 24) באמצעות מתקן, עם צפיפות זריעה של 5,000 תאים / גם בזריעת נפח 20 μl עבור assay יעילות אנטי ו25 μl עבור assay cytotoxicity, בהתאמה .
  2. דגירה תאים למשך 2-3 שעות על 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO 2 ולחות 80-95% עד תאים המחוברים היטב לצלחת.
  3. assay תהליך באזור רבע מהצלחת 384 גם לכל מתחם (שווה ערך לצלחת 96 היטב), כפי שמוצג בטבלה 1. להקצות שמונה חזרות לכל ריכוזבassay אחד. הקצה את העמודה הראשונה כביקורת החיובית מבלי להוסיף מתחם ווירוס, והעמודה האחרונה 12) כביקורת שלילית על ידי הוספת וירוס רק בלי תרכובות.
  4. לדלל תרכובות 50 מיקרומטר במדיום assay ולהוסיף לעמודה 2 nd ב20 μl / גם עבור assay יעילות אנטי. מערבבים את המתחם חמש פעמים באמצעות פיפטה חצי האוטומטית 8 ערוצים לריכוז של 25 מיקרומטר.
  5. באמצעות פיפטה חצי אוטומטית 8 ערוצים, להעביר 20 תערובת μl ב2 nd עמודה לעמודה הבאה (3 rd), ומערבב היטב כדי ליצור ריכוז של 12.5 מיקרומטר. חזור על תהליך זה על ידי העברת 20 תערובת μl מעמודת 3 ​​rd לעמודה הבאה (4 th) לצורה אחרת דילול כפול עם ריכוז של 6.25 מיקרומטר. חזור על הפעולה דילול סדרה כפול זה עד עמודת -11. לשאוב ולזרוק 20 μl של התערובת בעמודת ה 11 לאחר הוספת וערבוב compound.
  6. הוספת BTV-10, המבוסס על משרד הפנים של 0.01, לכל אחד גם מעמודה 2 לעמודה 11 בהיקף של 5 μl / טוב. לאחר הוספת הווירוס, ריכוז התרכובת הסופי בכל עמודה צריך להיות: 20 מיקרומטר בעמודה 2, 10 מיקרומטר בעמודה 3, והמשיך בדילול כפול למטה לעמודת 11 עם ריכוז סופי של 0.04 מיקרומטר.
  7. הוסף 5 μl של מדיום לעמודה 1 כתא שליטה בלבד (חיובית) וμl 5 / היטב BTV לעמודה 12 כזיהום BTV רק שליטה (שלילית).
  8. לדלל תרכובות לריכוז ראשוני של 200 מיקרומטר עבור assay cytotoxicity. בדומה לכך, להוסיף 25 μl / טוב של מתחם לעמודה 2 ומעורב 5x עם פיפטה חצי אוטומטית 8 ערוצים לריכוז של 100 מיקרומטר. אל תוסיף BTV.
  9. לבצע את דילול הסדרה הכפול על ידי aspirating 25 μl מעמודה 2 לעמודה 3 השכן, ונמשך עד העמודה האחרונה 12). בעמודה 12, לאחר הערבוב, לשאוב ולזרוק 25 μl של מ 'ixture. הריכוז הסופי בעמודה 2 צריך להיות 100 מיקרומטר ועמודת ה 12 צריכה להיות ב0.2 מיקרומטר. עמודת 1 היא השליטה היחידה בתא.
  10. עבור שני מבחני יעילות ורעילים לתאי נגיפים, דגירה הצלחות על 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO 2 ולחות 80-95% ל72 לאחר טיפול שעה. למדוד כדאיות תא באמצעות ערכת CTG כפי שתואר לעיל (פרוטוקול הצעדים 2.5-2.7).

4. בזמן של תוספת Assay (TOA)

  1. תאי הזרע ב.ס. ר מהעמודה 1-24 בmicroplate 384 גם (שחור; פורמט ידי 16 x 24) באמצעות מתקן ב5,000 תאים / היטב וזריעת הנפח 15 μl / טוב.
  2. עבור כל מתחם, לנצל את כל העשרים והארבע עמודות עם שמונה העתקים לכל נקודת זמן במחצית של צלחת 384 גם (טבלה 2). הקצה עמודת 1 כשליטה רק תאים על ידי הוספת 10 μl / גם מדיום assay. מארק עמודה 24 כזיהום BTV רק שליטה (בקרה שלילית) על ידי הוספה בינונית 5 μl / גם assayוירוס ד 5 μl / גם במשרד הפנים של 0.01 לנפח סופי של 25 μl / טוב.
  3. בחר את העמודות הזוגיות מעמודת 2-22 עמודת הערכת יעילות אנטי כבשעות שלאחר זיהום שונה (HPI). בטורים אלה, להדביק תאים עם 5 μl / טוב BTV במשרד הפנים של 0.01. בHPI שונה, גם להוסיף 5 μl / מתחם מדולל היטב היטב כל אחד כדי ליצור נפח סופי של 25 μl / טוב. למסומן -2 ו -1 HPI להוסיף מתחם לתאים ב.ס. ר לפני הדבקת BTV. ל0 HPI, להוסיף את המתחם וBTV לתרבות בו זמנית.
  4. במקביל, לייעד את עמודות אי זוגיות מעמודת 3-23 כמתחם שולט בלבד, מתוכם מתחם נוספו בזמן נקודות שונות כמיועד (-2, -1, 0, 1, 2, 4, 8, 16, 24, 48 HPI). בטורים אלה, להוסיף 5 μl בינוני / טוב assay ו5 μl / מדולל היטב מתחם כדי ליצור נפח סופי של 25 μl / טוב.
  5. לאחר טיפול, דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% לחות 2 עם 80-95% CO.
  6. לקבוע כדאיות תא ב72 HPI באמצעות ערכת CellTiter-Glo כפי שתואר לעיל (פרוטוקול הצעדים 2.5-2.7).

5. ניתוח נתונים

  1. לעבד את כל הנתונים הראשונים באמצעות תוכנה מתאימה בבית תוך שימוש באיתותים זורח הושגו באמצעות הקורא במצב מרובה. קבע את הערך הממוצע (הממוצע), סטיית תקן (STDEV) עבור כל טיפול, כמו גם וריאציות המקדם (CV), המחייב את ערך שאינו עולה על 10%.
  2. להעביר את הנתונים המעובדים מהתוכנה הנ"ל לכלי תוכנת biostatic והגרפי. לבצע את ניתוח רגרסיה שאינו ליניארי כדי לקבוע את הערכים של EC 50 ו50 CC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

1. יעילות אנטי של מתחם

Assay CPE מבוסס התאים פותח, מותאם ותוקף במבחנה באמצעות ערכת CTG מבוסס זורח לזהות antivirals רומן נגד BTV כפי שתואר לעיל 2,5. Assay התגובה עשרה המינון הועסק כדי לשקף את היעילות ורעילה לתאי נגיפים של מתחם להוביל זוהה על ידי מדידת מספר תאי קיימא מטבולית בתרבות המבוססת על quantitation של ה-ATP הסלולרי הוצגה בתאים חיים 5,11. בדו"ח הקודם שלנו, מספר התרכובות אנטי פוטנציאל הוערכו, כולל תרכובות מכל אשכול שזוהו באמצעות HTS נגד BTV 5, ונגזרים שלהם באמצעות דה נובו סינתזה 2. בהתבסס על EC 50, CC 50 ו50 SI, כמה תרכובות יתרון מבטיחות זוהו עם יעילות רבת עוצמה אנטי, רעילות נמוכה וסלקטיביות גבוהה. לדוגמא, compound052 (C052)היה נחוש בדעה יש לי EC 50 של 0.27 ± 0.12 מיקרומטר (איור 1) 2 ו CC 50 של 82.69 מיקרומטר, שני עקומות רגרסיביות טיפוסיות מראים מתחת לרגרסיה שאינה ליניארי מנתח 2. SI 50 של C052 נקבע ב306 מבוסס על EC 50 וCC 50 ערכיה. היעילות בקנה מידה nanomolar אנטי, רעילות נמוכה, וכתוצאה מכך גבוהים SI 50 ציינו כי C052 עשוי להיות אנטי חזק וסלקטיבית נגד BTV.

2. משרד חקלאות פוטנציאל למתחם אנטי

Assay TOA נועד כדי לקבוע במה האפשרית (ות) של מחזור החיים נגיפי הממוקד על ידי תרכובות. בעת הוספת C052 בשעה 1 או 2 לפני הדבקת BTV, כלומר -1 ו -2 HPI, efficacies אנטי נשאר בקנה מידת nanomolar (איור 2) 2, המציין כי C052 עלול לפעול מעבר לשלב המוקדם של מחזור החיים נגיפי, כגון כניסת וירוס. Furthermore, היעילות אנטי נותרה ללא שינוי עד C052 התווסף לתאים נגועים כמאוחר יותר כ24 HPI. כאשר נוספו ב32 HPI, אחוז תאי קיימא ירד בתאי טיפול C052, המציין כי C052 היה פחות מגונן בשלב זה של מחזור החיים נגיפי. כאשר נוספו ב48 HPI, לא הייתה שום הגנה לתאים ב.ס. ר מCPE-Induced BTV. מאז המחזור של שכפול הנגיפי BTV בדרך כלל סיים בתאים נגועים בתוך 24 HPI הראשון, התוצאות שלנו הציעו שC052 עלולה לפעול בשלבים המאוחרים של מחזור החיים נגיפי BTV, כמו שכפול של נגיף, אריזה, התבגרות ויציאה. בינתיים, אפשר גם שC052 עשויה לפעול במנגנונים תאיים מארח שהיו מעורבים במהלך מחזור החיים נגיפי מאוחר 2.

טבלת 1
טבלת 1. פריסת הצלחת עבור assay מנת התגובה. היעילות אנטי של C052 הייתה להעריך ד בהיקף 96 היטב בתוך הצלחת 384 גם. כל טיפול, כולל זיהום BTV תוספת ריכוזי C052 שונים, בוצע עם שמונה העתקים. ב72 HPI, כדאיות תא נקבעו באמצעות ערכת CTG.

טבלה 2
שולחן. 2 פריסת הצלחת עבור assay בזמן של תוספת (TOA). Assay TOA של C052 הוערך בצלחת 384 גם כפי שצוין בפריסה. כל טיפול, כולל זיהום BTV בתוספת זמן של הוספת C052, בוצע בשמונה העתקים. HPI -2 ו -1 מצביע על כך שC052 התווסף לתאים לפני זיהום BTV. ב 0 HPI, BTV וC052 נוספו בו זמנית. ב72 HPI, כדאיות תא נקבעו באמצעות ערכת CTG. לחץ כאן לקבלת לוח.

ithin-page = "תמיד"> איור 1
איור 1. היעילות אנטי של C052. תאים היו נגועה בBTV במשרד הפנים של 0.01 בנוכחות של עשרה ריכוזים שונים של C052, כפי שצוינה באיור. כדאיות תא נקבעו ב72 HPI, שימוש בערכת CTG. כל נקודת נתונים מייצגת אמצעים וSD מחמש חזרות. נתון זה שונה מהגו et al. 2012 2.

איור 2
איור 2. Assay הזמן של בנוסף לC052. C052 ב2.5 מ"מ ו0.27 מ"מ, בהתאמה, התווסף לתאי BTV נגועים בHPI שונה כפי שצוין, וההגנה של C052 נגד CPE BTV המושרה, או כדאיות תא, נמדדה באמצעות ערכת CTG ב72 HPI כל נקודות נתונים מיוצגות הערך הממוצעs ו-SD משל שמונה חזרות עצמאיות. נתון זה שונה מהגו et al. 2012 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

לזיהוי הראשוני של להיטים אנטי, אחד הצעדים המרכזיים לגילוי תרופות אנטי ופיתוח הוא לפתח מבחני חזקים, הכולל בחירת סמן לכימות, פיתוח פרוטוקול פשוט, קבלת אותות מספיקים וקורות חיים פחות מ -10%. רוב המסכים ביוכימי או מבוסס תאים נועדו לספק נקודת התחלה כימית המבוססת על assay חזק ביותר, הפשוט וזול, בשל שחזור נדרש בתהליך המיון והמספר פוטנציאלי הגדול של מולקולות שיוקרנו. Assay מבוסס CPE היה מיועד כדי לעמוד בדרישות אלה כדי לזהות להיטים יעילים מספריית מתחם גדולה. CPE מתייחס להשפעה השלילית על התאים בתרבית הקשורים להכפלה של וירוסים. מבחני שונים זמינים לשימוש מחוון CPE באמצעות מדידת מגוון רחב של סמנים שונים המציינים את מספר התאים המתים (cytotoxicity), מספרם של תאי חיים (כדאיות), והמנגנוןשל מוות של תאים (אפופטוזיס). ריאגנטים מסחריים עבור assay מבוסס CPE זמינים עם פרוטוקול assay פשוט. לדוגמא, ערכת CTG כוללת את הצעד "לערבב ולמדוד" אחת וכבר בשימוש נרחב לכמת CPE וירוס מושרה. עם זאת, assay מבוסס CPE מוגבל לוירוסים שיכולים לגרום לCPE המהיר. לוירוסים שלא לגרום CPE המהיר, מבחני שונים פותחו. לדוגמא, מבוסס assay replicon באמצעות שורת תאי מחסה-replicon מאפשר הקרנה למעכבים של שכפול נגיפי, כוללים תרגום, עיבוד polyprotein, ומינוס ופלוס גדיל סינתזה RNA 12-14. אסטרטגיות RNA antisense וההקרנה וירטואלית של ספריות מולקולה קטנה יכולים לשמש גם כדי לזהות antivirals האפשרי 15,16. עם זאת, זה קריטי, כי היעילות של תרופה אנטי להיות מאומתת בassay מבוסס תאים במבחנה המאפשר ההערכה של יעילות אנטי נגד מחזור החיים הנגיפי השלם. מבוסס CPEassay הותאם בהצלחה לפורמט תפוקה גבוהה, והוא אחד של assay אמין ויציב ביותר להקרנה של ספריות מתחם גדולות, כוללים הקרנות HTS נעשו לאחרונה נגד נגיף שפעת 6,17, קורונה תסמונת החמורה חריפה בדרכי הנשימה (SARS-COV) 18 , Arenaviruses 19, וreovirus (וירוס Bluetongue) 5.

Assay מנת התגובה היה מיועד כדי לאמת עוד יותר את היעילות אנטי של הנפילות באמצעות assay מבוסס CPE המנה הבודד, בדרך כלל לאחר הקרנת ספריית מתחם גדולה. הלהיטים הללו, למרות שהיו מזוהים עם פעילות אנטי, צריכים אישור נוסף כדי לחשוף את הפוטנציאל שלהם להפוך לתרופה. יעילות אנטי של מתחם יכולה להתגלות דרך הניתוח באמצעות 50 EC, 50 CC וערך SI 50 באמצעות ניתוח התגובה במינון. בינתיים, יצאתי מחוץ ליעד או חיובי שגוי יהיה מזוהה, ומספר comp הראשיounds יכול להיות הצטמצם. באמצעות ניתוח זה, בסדר הגודל של חוזקי מתחם ורעילים יכול להיות מדורג לכוון גילוי תרופות אנטי עתיד, במיוחד עבור הקשר בין מבנה לפעילות (SAR) ניתוח ושינוי כימיה רפואית בעתיד. למעשה, מתחם C052 היה נגזר של C003 מתחם, הקשורים במאפיינים כמו סמים טובים הן במבחנה in vivo.

כדי לעמוד בדרישות לסמים, הוא חייב לקבוע משרד החקלאות שלה, כלומר לאפיין את האינטראקציה של מתחם עם היעד שלה בריכוזים פיסיולוגיים. מבחני שונים פותחו של antivirals המסוים, כלומר לעכב לא רק היעד, אלא יש לי מסיסות מקובלת, חדירות, חלבון פרופילים מחייבים, סלקטיביות, חילוף חומרים ורעילות. מאז מחקרי משרד החקלאות היו assay נמוך התפוקה צורך מאמצים מייגע, רק כמה מולקולות שנבחרו, עם 50 EC החזק, גבוה CC 50 ושעותigh SI 50 ערך, יכול להיות מנותח בקלות. הבנת משרד החקלאות של מתחם, בשלב זה ניתן להוסיף עומק לפרשנות של פעילות תאית או היעדרה. מחקר TOA מיועד כדי לצמצם את השלב שבו נגיפים אינטראקציה עם מטרות נגיפיות או מארח. ידיעת מתחם היא תחרותית עם מצע בשלב מחזור חיים נגיפי מסוים יכול לספק כיוון מיידי לניתוח משרד חקלאות נוסף. לחלופין, assay תא חזק יותר מבוסס עם מנגנון ידוע, כולל assay ישירות למסך למעכבי אינטגראז HIV-1 20, עיכוב וירוס מחייב אל פני השטח חלבון 21 יכולים לשמש אשר מספקים משרד חקלאות ידוע לפני הקרנות בפועל 22. בעוד להיטים מהקרנה אלה עשויים להיות קשורים היטב למשרד החקלאות המיועד, יש למעשה משרד חקלאות עשויה גם צריכה להכפיף לTOA ומנגנון אחר של מחקרי פעולה.

לסיכום, באמצעות שלושה מבחני שדווחו כאן, יש לנו הוקרנו בהצלחה וזוהוכמה תרופות אנטי חזקות נגד BTV, כולל C003 וC052 2. בפרט, SI 50 (של C052 היה עד ב306, אשר הציע כי C052 הוא מאוד סלקטיבית נגד BTV. ויה TOA ומחקרי משרד חקלאות אחרות שהוצגו בנייר המקורי, שהצענו כי C052 יכול להיות סוכן אנטי פוטנציאל אינטראקציה עם מארח מכונות autophagy, יכולה להיות מפותחות לתרופה נגד BTV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

פרויקט זה מומן על ידי מענק 1R03MH08127-01 ו7R03MH08127-02 מ-NIH לש לי, ועל ידי קרנות IMPACT ממחלקה לרפואה ב UAB לש לי. תמיכה מקרן Molette ואוניברסיטת אובורן זוכה להערכה. אנו מודים גם assistances הטכני מהגב 'Pulin צ'ה ומר ולדימיר Musiienko במהלך העבודה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM medium Gibco 1134218 For cell culture
FBS Gibco 16000044 For cell culture
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 1000185 For cell culture
DPBS Gbico 1049769 For cell culture
CellTiter-Glo (CTG) kit Promega TB288 For cell viability measurement
70% ethanol Fisher S25309B Diluted from 95%
Antiviral huashilcompounds NIH MLSMR and de novo synthesis
BTV-10 ATCC VR-187
BSR cell Developed in house
Synergy-II multi-mode microplate reader BioTek For luminescent signal reading
MicroFlo select dispenser BioTek Adding cells, virus, and reagents
384-well flat-bottom microplate CORNING 28908031 For cell culture
Gen. 5 software BioTek For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader
GraphPad Prism 5 GraphPad Version 5 For biostatic analysis and plot

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hemati, B., et al. Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph. J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).
  2. Gu, L., et al. Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus. PLoS ONE. 7, e43341 (2012).
  3. Meiswinkel, R., et al. The 2006 outbreak of bluetongue in northern Europe--the entomological perspective. Prev. Vet. Med. 87, 55-63 (2008).
  4. Szmaragd, C., et al. Mortality and case fatality during the recurrence of BTV-8 in northern Europe in 2007. Vet. Rec. 161, 571-572 (2007).
  5. Li, Q., Maddox, C., Rasmussen, L., Hobrath, J. V., White, L. E. Assay development and high throughput antiviral drug screening against Bluetongue virus. Antiviral Research. 83, 267-273 (2009).
  6. Noah, J. W., et al. A cell-based luminescence assay is effective for high-throughput screening of potential influenza antivirals. Antiviral Res. 73, 50-59 (2007).
  7. Che, P., Wang, L., Li, Q. The development, optimization and validation of an assay for high throughput antiviral drug screening against Dengue virus. Int. J. Clin. Exp. Med. 2, 363-373 (2009).
  8. Li, Q., Li, H., Blitvich, B. J., Zhang, J. The Aedes albopictus inhibitor of apoptosis 1 gene protects vertebrate cells from bluetongue virus-induced apoptosis. Insect Mol. Biol. 16, 93-105 (2007).
  9. Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell number. J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).
  10. Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J. Virol. 73, 251-259 (1999).
  11. Phillips, T., Jenkinson, L., McCrae, C., Thong, B., Unitt, J. Development of a high-throughput human rhinovirus infectivity cell-based assay for identifying antiviral compounds. J. Virol. Methods. 173, 182-188 (2011).
  12. Harvey, T. J., et al. Tetracycline-inducible packaging cell line for production of flavivirus replicon particles. J. Virol. 78, 531-538 (2004).
  13. Puig-Basagoiti, F., et al. High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 4980-4988 (2005).
  14. Puig-Basagoiti, F., et al. Triaryl pyrazoline compound inhibits flavivirus RNA replication. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 1320-1329 (2006).
  15. Duan, M., et al. In vitro and in vivo protection against the highly pathogenic H5N1 influenza virus by an antisense phosphorothioate oligonucleotide. Antivir. Ther. 13, 109-114 (2008).
  16. Ray, D., Shi, P. Y. Recent advances in flavivirus antiviral drug discovery and vaccine development. Recent Pat. Antiinfect. Drug Discov. 1, 45-55 (2006).
  17. Severson, W. E., et al. High-throughput screening of a 100,000-compound library for inhibitors of influenza A virus (H3N2). J. Biomol. Screen. 13, 879-887 (2008).
  18. Severson, W. E., et al. Development and validation of a high-throughput screen for inhibitors of SARS CoV and its application in screening of a 100,000-compound library. J. Biomol. Screen. 12, 33-40 (2007).
  19. Bolken, T. C., et al. Identification and characterization of potent small molecule inhibitor of hemorrhagic fever New World arenaviruses. Antivir. Res. 69, 86-97 (2006).
  20. Van Loock, M., et al. A novel high-throughput cellular screening assay for the discovery of HIV-1 integrase inhibitors. J. Virol. Methods. 179, 396-401 (2012).
  21. Kampmann, T., et al. In silico screening of small molecule libraries using the dengue virus envelope E protein has identified compounds with antiviral activity against multiple flaviviruses. Antiviral Res. 84, 234-241 (2009).
  22. Kirchmair, J., et al. Development of anti-viral agents using molecular modeling and virtual screening techniques. Infect. Disord. Drug Targets. 11, 64-93 (2011).

Tags

אימונולוגיה גיליון 80 גילוי תרופות הערכת תרופות פרה מחקרי הערכה כנושא הערכת תרופות לימודי היתכנות הביולוגי Assay טכנולוגיה תרופות מבחני תפוקה גבוהה הקרנה מחלות בעלי חיים טכניקות חקירה אנטי יעילות וירוס Bluetongue השפעת cytopathic תגובת מנה, פעולה מנגנון-of-Time-of-תוספת
מבחני לזיהוי של antivirals הרומן נגד וירוס Bluetongue
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gu, L., Schneller, S. W., Li, Q.More

Gu, L., Schneller, S. W., Li, Q. Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus. J. Vis. Exp. (80), e50820, doi:10.3791/50820 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter