Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bluetongue वायरस के खिलाफ उपन्यास antivirals की पहचान के लिए assays

Published: October 11, 2013 doi: 10.3791/50820
Automatic Translation
1, 2, 1
1Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 2Molette Laboratory for Drug Discovery, Department of Chemistry and Biochemistry, Auburn University

Summary

कोशिकाविकृति संबंधी प्रभाव (सीपीई) आधारित परख, खुराक प्रतिक्रिया परख और समय के जोड़ (TOA) परख सहित तीन assays, साथ ही, विकसित अनुकूलित, मान्य है और Bluetongue वायरस के खिलाफ उपन्यास antivirals (BTV) की पहचान करने के लिए उपयोग किया गया है नव पहचान antivirals के लिए संभव तंत्र की कार्रवाई (एमओए) निर्धारित करने के रूप में.

Abstract

BTV के खिलाफ संभावित antivirals की पहचान करने के लिए, हम विकसित अनुकूलित और यहाँ प्रस्तुत तीन assays पुष्टि की है. सीपीई आधारित परख एक यौगिक किसी भी antiviral प्रभावकारिता दिखाया और बड़े परिसर पुस्तकालय स्क्रीन इस्तेमाल किया गया है कि क्या मूल्यांकन करने के लिए विकसित की पहली परख थी. इस बीच, antivirals के cytotoxicity भी सीपीई आधारित परख का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है. खुराक प्रतिक्रिया परख चयनित एंटीवायरल के लिए प्रभावकारिता की सीमा निर्धारित करने के लिए डिजाइन किया गया था, 50% निरोधात्मक एकाग्रता (आईसी 50) या प्रभावी एकाग्रता (ईसी 50), और साथ ही cytotoxicity की अपनी सीमा (सीसी 50) अर्थात्. TOA परख BTV वायरल जीवन चक्र या मेजबान सेलुलर तंत्र पर संभव प्रभाव के दौरान उपन्यास antivirals के अंतर्निहित तंत्र निर्धारित करने के लिए प्रारंभिक एमओए अध्ययन के लिए नियुक्त किया गया था. ये assays सेल संस्कृति प्रणाली में antiviral प्रभावकारिता के मूल्यांकन के लिए महत्वपूर्ण हैं, और हमारे हाल के शोध का नेतृत्व करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैBTV के खिलाफ उपन्यास antivirals के एक नंबर की पहचान करने के लिए आईएनजी.

Introduction

BTV जीनस Orbivirus, परिवार Reoviridae में एक प्रोटोटाइप डबल असहाय शाही सेना वायरस है. BTV दुनिया भर में 1,2 $ 3000000000 / वर्ष के नुकसान के साथ, भेड़, बकरी, पशु और अन्य घरेलू पशुओं सहित घरेलू पशुओं का सबसे महत्वपूर्ण रोगों में से एक है. विदेशी BTV सीरोटाइप में सूचीबद्ध एक महत्वपूर्ण पशु रोगज़नक़ है "यूएसडीए उच्च परिणाम पशुधन रोगज़नक़ों." हाल ही में, फिर से उभरते BTV के उत्तरी यूरोप 3,4 भर में कई देशों में एक प्रमुख पशुओं में बीमारी का प्रकोप और भेड़ कारण बना हुआ है. इसके आर्थिक महत्व का एक परिणाम के रूप में और एक मॉडल प्रणाली के रूप में, BTV व्यापक, आणविक आनुवंशिक और संरचनात्मक अध्ययन का विषय रहा है, और कई टीके विकसित किया गया है. हालांकि, एंटीवायरल दवाओं की खोज के लिए उचित assays की कमी के कारण, BTV के खिलाफ उपलब्ध नहीं antivirals कर रहे हैं.

मॉडल प्रणाली के रूप BTV का उपयोग हाल ही में एक उच्च throughput स्क्रीनिंग (HTS) अभियान में, हम घ, eveloped अनुकूलित और arboviruses 5 के खिलाफ संभावित व्यापक स्पेक्ट्रम antivirals की पहचान करने के लिए एक सीपीई आधारित परख मान्य. सीपीई आधारित परख तेजी से और नमूदार सीपीई / apoptosis 5-7 प्रेरित है कि वायरस के एक नंबर के खिलाफ antiviral दवाओं की खोज में इस्तेमाल किया गया है कि एक अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त परख है. हमारी प्रणाली में, पोस्ट BTV संक्रमण, सीपीई हेला, बीएसआर, और HEK 293T 8 सहित हड्डीवाला कोशिकाओं में स्पष्ट है. BTV प्रेरित सीपीई CellTiter Glo सेल व्यवहार्यता अभिकर्मक किट (CTG किट) 9 सहित विभिन्न सेल व्यवहार्यता का पता लगाने के तरीकों का उपयोग और निगरानी की मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. इस किट metabolically सक्रिय जीवित कोशिकाओं की उपस्थिति का संकेत है, जो सेलुलर एटीपी के quantitation पर आधारित संस्कृति में व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या प्रस्तुत किया, निर्धारित करता है. अनुकूलित शर्तों के तहत, यहाँ प्रस्तुत सीपीई आधारित परख "मिश्रण और उपाय" एक कदम प्रोटोकॉल, और स्थिर luminescent संकेतों के साथ लचीलेपन के साथ इसकी व्यवहार्यता दिखाया. इस बीच, जहरीले यौगिकों reduसेल व्यवहार्यता cing इस सीपीई आधारित परख में बाहर रखा जाएगा. सीपीई आधारित परख इसकी मजबूती और BTV के खिलाफ antiviral दवाओं की खोज के लिए विश्वसनीयता से पता चला है, और संभावित एंटीवायरल नेतृत्व यौगिक (ओं के छह उपन्यास क्लस्टर की पहचान की जाती है जो एनआईएच आण्विक पुस्तकालय लघु अणु भंडार (MLSMR), स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है ) 5.

एक संभावित antiviral यौगिक सीपीई आधारित परख का उपयोग पहचान की गई है, जब वह एंटीवायरल प्रभावकारिता और cytotoxicity 2 की सीमा निर्धारित करने के लिए दस एकाग्रता खुराक प्रतिक्रिया परख के लिए किए जाने की आवश्यकता होगी. एंटीवायरल प्रभावकारिता, 50% निरोधात्मक एकाग्रता (आईसी 50) या 50% प्रभावी एकाग्रता (ईसी 50) के रूप में प्रतिनिधित्व, आधारभूत और अधिकतम के बीच वायरस प्रेरित सीपीई आधे रास्ते को रोकता है जो एक दवा की एकाग्रता है. antivirals के cytotoxicity, 50% cytotoxicity एकाग्रता (सीसी 50) यानी, एकाग्रता हैआधारभूत और अधिकतम के बीच cytotoxicity का 50% उत्प्रेरण एक दवा की. 50% एसआई (एसआई 50) के रूप में चिह्नित चयनात्मक सूचकांक (एसआई), वायरस प्रेरित सीपीई के खिलाफ antiviral की विशिष्टता को निर्धारित करता है जो सीसी 50 / आईसी 50 से गणना की है. आईसी 50 (या चुनाव आयोग 50), सीसी 50 और एसआई 50 मानों एक antiviral यौगिक शक्तिशाली और आगे दवा के विकास के लिए चयनात्मक है कि यह निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण उपाय कर रहे हैं.

एक antiviral इन विट्रो में कोई प्रकट विषाक्तता से पता चला है, अभी तक रोका वायरस सीपीई और उत्पादक वायरल जीवन चक्र को प्रेरित किया, यह अपने एमओए 2 चिह्नित करने के लिए महत्वपूर्ण है. हम एंटीवायरल से प्रभावित है कि वायरल जीवन चक्र के संभावित कदम (ओं) निर्धारित करने के लिए TOA परख बाहर ले जाने से इस तरह के लक्षण वर्णन शुरू की. आम तौर पर, एंटीवायरल यौगिक अलग अलग समय पूर्व या बाद वायरस के संक्रमण में कोशिकाओं को जोड़ा गया. Antivirals संक्रमित कोशिकाओं को जोड़ा गया तो अपने लक्ष्य के लिए पोस्टपहले कदम के लिए जोड़ा गया है, जो एक की तुलना में जब चरण संक्रमण के दौरान, यह कम गतिविधि पर नतीजा होगा. इस प्रकार, TOA अध्ययन या तो वायरल जीवन चक्र या वायरल जीवन चक्र में शामिल मेजबान मशीनरी पर, एक यौगिक के antiviral प्रभावकारिता, और अपनी क्षमता को लक्ष्य निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है.

सभी तीन assays के लिए, सेल व्यवहार्यता निर्माता अनुदेश 5 निम्नलिखित CTG किट का उपयोग कर निर्धारित किया गया था. इस प्रणाली का पता लगाने के लिए विभिन्न घर में सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है कि पर्याप्त luminescence संकेत outputs. प्रत्येक परख कम से कम आठ प्रतिकृतियां के साथ तीन प्रतियों में मान्य है और प्रदर्शन किया गया था. सभी प्राप्त आंकड़ों के लिए, मतलब मूल्य (AVE), मानक विचलन (STDEV), और गुणांक भिन्नता (सीवी) सहित तीन मानकों, परख की मजबूती का निर्धारण करने के लिए विश्लेषण किया गया. परख की मजबूती निर्धारित किया गया है, डेटा आगे विश्लेषण किया और विभिन्न बायोस्टेटिक्स और ग्राफिक्स का उपयोग कर साजिश रची किया जाएगासी उपकरण 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. सेल, वायरस और antiviral यौगिकों

  1. बीएसआर कोशिकाओं, 5% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) युक्त बच्चा हम्सटर गुर्दे के व्युत्पन्न Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम में (बीएचके) कोशिकाओं 10, (DMEM) को बनाए रखने, 100U/ml पेनिसिलिन और 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन.
  2. सभी तीन assays के लिए, 1% FCS, 100U/ml पेनिसिलिन और 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन साथ DMEM में थाली कोशिकाओं, 5 पहले से अनुकूलित के रूप में. यह मध्यम सभी तीन assays के लिए परख माध्यम के रूप में जाना जाता है.
  3. 5% सीओ 2 और 80-95% आर्द्रता के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में सभी कोशिकाओं को सेते हैं.
  4. पट्टिका को शुद्ध और पहले से 8 के रूप में वर्णित प्रकार 10 BTV (BTV-10) का प्रचार. प्रत्येक नामित assays के लिए परख मध्यम में BTV-10 पतला.
  5. 10 मिमी पर एकाग्रता के साथ एक शेयर के लिए फार्म DMSO में सभी परीक्षण यौगिकों भंग. -20 डिग्री सेल्सियस पर और देखिए स्टोर
  6. नामित लिए परख माध्यम का उपयोग कर वांछित सांद्रता के यौगिकों पतलाडी assays 2.

2. CTG किट का उपयोग कर सीपीई आधारित परख

  1. MicroFlo चुनिंदा निकालने की मशीन के माध्यम से, एक 384 अच्छी तरह से microplate (16 x 24 से प्रारूप काला) में बीज बीएसआर कोशिकाओं. बोने घनत्व अच्छी तरह से 5000 कोशिकाओं / है, और बोने मात्रा एंटीवायरल प्रभाव के विश्लेषण के लिए 20 μl है.
  2. कोशिकाओं को अच्छी तरह से थाली के अनुयायी होने तक 2-3 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं.
  3. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 10 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता के साथ एंटीवायरल यौगिक जोड़ें. यह पूरी तरह से मिलाएं.
  4. वांछित अनुमापांक को BTV पतला और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए चिह्नित MOI के साथ 5 μl BTV जोड़ें. नियंत्रण के लिए अच्छी तरह से परख मीडिया के 5 μl जोड़ें. 5% सीओ 2 और 80-95% आर्द्रता के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 72 घंटे के लिए संक्रमित कोशिकाओं को सेते हैं.
  5. 72 HPI, पिघलना और उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान को CTG बफर और lyophilized CTG सब्सट्रेट संतुलित करना है. वें के अनुसार lyophilized एंजाइम / सब्सट्रेट और बफर अभिकर्मक मिश्रण से सजातीय CTG अभिकर्मक समाधान Reconstituteई निर्माता के निर्देशों का.
  6. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान को परख प्लेटें संतुलित करना.
  7. एक मशीन से एक अच्छी तरह से CTG अभिकर्मकों के एक बराबर मात्रा (25 μl) जोड़ें. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए incubating के बाद, 0.1 सेकंड के एकीकरण के समय के साथ एक बहु मोड रीडर का उपयोग luminescence संकेतों को मापने.

3. खुराक प्रतिक्रिया परख

  1. क्रमशः / अच्छी तरह एंटीवायरल प्रभावकारिता परख के लिए 20 μl और cytotoxicity परख के लिए 25 μl, के एक बोने मात्रा में 5,000 कोशिकाओं के एक बोने घनत्व के साथ एक मशीन के माध्यम से, (16 x 24 से प्रारूप काला), एक 384 अच्छी तरह से microplate में बीज बीएसआर कोशिकाओं .
  2. 5% सीओ 2 और कोशिकाओं तक 80-95% आर्द्रता के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं अच्छी तरह से थाली से जुड़े होते हैं.
  3. तालिका 1 में दिखाया गया है, (एक 96 अच्छी तरह से थाली के बराबर) प्रत्येक परिसर के लिए 384 अच्छी तरह से थाली के एक चौथाई क्षेत्र में प्रक्रिया परख. प्रत्येक एकाग्रता के लिए आठ replicates आवंटितएक एकल परख में. केवल यौगिकों के बिना वायरस जोड़कर नकारात्मक नियंत्रण के रूप में मिश्रित और वायरस को जोड़ने के बिना सकारात्मक नियंत्रण के रूप में पहला स्तंभ, और अंतिम स्तंभ (12 वें) निरुपित.
  4. परख मध्यम में 50 माइक्रोन तक यौगिकों पतला और 20 μl / अच्छी तरह एंटीवायरल प्रभावकारिता परख के लिए 2 एन डी स्तंभ को जोड़ने. 25 माइक्रोन की एकाग्रता के लिए 8 चैनल अर्द्ध स्वचालित पिपेट का उपयोग कर परिसर में पांच बार से मिलाएं.
  5. 8 चैनल अर्द्ध स्वचालित विंदुक का प्रयोग, 12.5 माइक्रोन की एकाग्रता के लिए फार्म का अच्छा मिश्रण है, अगले स्तंभ (3) के लिए 2 एन डी स्तंभ में 20 μl मिश्रण हस्तांतरण. 6.25 माइक्रोन की एकाग्रता के साथ एक और दो ​​गुना कमजोर पड़ने के लिए फार्म अगले स्तंभ (4 ध) के लिए 3 स्तंभ से 20 μl मिश्रण स्थानांतरित करके इस प्रक्रिया को दोहराएं. 11 वें स्तंभ तक इस दो गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने दोहराएँ. महाप्राण और COMP जोड़ने और मिश्रण के बाद 11 वें स्तंभ में मिश्रण के 20 μl त्यागेंound.
  6. 5 μl / अच्छी तरह का एक मात्रा के साथ कॉलम 11 के लिए स्तंभ 2 से अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए, BTV-10, 0.01 के MOI पर आधारित जोड़ें. वायरस जोड़ने के बाद, प्रत्येक स्तंभ में अंतिम मिश्रित एकाग्रता होनी चाहिए: स्तंभ 2 में 20 माइक्रोन, कॉलम 3 में 10 माइक्रोन, और 0.04 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता के साथ कॉलम 11 के लिए नीचे एक दो गुना कमजोर पड़ने के साथ जारी रखा.
  7. 1 कॉलम को माध्यम के 5 μl जोड़ें सेल केवल (सकारात्मक) नियंत्रण और BTV संक्रमण के रूप में स्तंभ से 12 BTV के 5 μl / अच्छी तरह से केवल नियंत्रण (नकारात्मक) के रूप में.
  8. Cytotoxicity परख के लिए 200 माइक्रोन का एक प्रारंभिक एकाग्रता के लिए यौगिकों पतला. इसी तरह, 100 माइक्रोन की एकाग्रता के लिए 8 चैनल अर्द्ध स्वचालित पिपेट साथ स्तंभ 2 और मिश्रित 5x के लिए 25 μl / अच्छी तरह से परिसर के जोड़ें. BTV न जोड़ें.
  9. पड़ोसी स्तंभ से 3 स्तंभ 2 से 25 μl aspirating से दो गुना श्रृंखला कमजोर पड़ने से बाहर ले जाने, और अंतिम स्तंभ (12 वें) तक जारी रहा. कॉलम 12 में, मिश्रण के बाद, महाप्राण और एम के 25 μl त्यागेंixture. स्तंभ 2 में अंतिम एकाग्रता 100 माइक्रोन होना चाहिए और 12 वें स्तंभ 0.2 माइक्रोन से कम होना चाहिए. 1 कॉलम सेल ही नियंत्रण है.
  10. दोनों antiviral प्रभावकारिता और cytotoxicity assays के लिए, 5% सीओ 2 और 72 घंटे बाद इलाज के लिए 80-95% आर्द्रता के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं. (प्रोटोकॉल 2.5-2.7 कदम) के रूप में ऊपर वर्णित CTG किट का उपयोग सेल व्यवहार्यता उपाय.

4. समय के जोड़ (TOA) परख

  1. 5000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से में एक मशीन और बोने मात्रा के माध्यम से 15 μl / अच्छी तरह से है, एक 384 अच्छी तरह से microplate में स्तंभ 1-24 (एक्स 24 16 से प्रारूप काला) से बीज बीएसआर कोशिकाओं.
  2. प्रत्येक परिसर के लिए, 384 अच्छी तरह से थाली (तालिका 2) के एक छमाही में प्रत्येक समय बिंदु के लिए आठ प्रतिकृतियां के साथ सभी चौबीस स्तंभों का उपयोग. 10 μl / अच्छी तरह से परख मध्यम जोड़कर कोशिकाओं केवल नियंत्रण के रूप में स्तंभ 1 असाइन करें. मार्क स्तंभ 24 5 μl / अच्छी तरह से परख मध्यम जोड़कर BTV संक्रमण केवल नियंत्रण (नकारात्मक नियंत्रण) के रूप में25 μl / अच्छी तरह से की अंतिम मात्रा के लिए 0.01 के MOI में डी 5 μl / अच्छी तरह से वायरस.
  3. स्तंभ 2-22 अलग घंटे के बाद संक्रमण (HPI) पर ही एंटीवायरल प्रभावकारिता मूल्यांकन स्तंभ से भी गिने स्तंभों का चयन करें. इन स्तंभों में, 0.01 के MOI में 5 μl / अच्छी तरह BTV के साथ कोशिकाओं को संक्रमित. विभिन्न HPI में भी अच्छी तरह से 25 μl / के अंतिम मात्रा के लिए फार्म प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 5 μl / अच्छी तरह पतला यौगिक जोड़ें. के लिए चिह्नित -2 और -1 HPI पूर्व BTV संक्रमण के लिए बीएसआर कोशिकाओं को यौगिक जोड़ें. 0 HPI के लिए, एक साथ संस्कृति को यौगिक और BTV जोड़ें.
  4. यौगिक केवल नियंत्रण के रूप में समानांतर में,, (-2, -1, 0, 1, 2, 4, 8, 16 नामित जो परिसर के अलग समय बिंदुओं पर जोड़ा गया था, स्तंभ 3-23 से अजीब गिने स्तंभों को नामित 24, 48 HPI). इन स्तंभों में, 5 μl / अच्छी तरह से परख मध्यम जोड़ने और 5 μl / अच्छी तरह से अच्छी तरह से 25 μl / के अंतिम मात्रा के लिए फार्म परिसर पतला.
  5. उपचार के बाद, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 80-95 के साथ% नमी में कोशिकाओं सेते.
  6. पहले से (प्रोटोकॉल 2.5-2.7 कदम) के रूप में वर्णित CellTiter-Glo किट का उपयोग कर 72 HPI पर सेल व्यवहार्यता का निर्धारण.

5. डेटा विश्लेषण

  1. बहु मोड रीडर के माध्यम से प्राप्त luminescent संकेतों के आधार पर उचित घर में सॉफ्टवेयर का उपयोग सबसे पहले डेटा की प्रक्रिया. 10% से अधिक नहीं एक मूल्य की आवश्यकता है जो मतलब मूल्य (औसत), प्रत्येक उपचार के लिए मानक विचलन (STDEV) के साथ ही गुणांक बदलाव (सीवी), निर्धारित करते हैं.
  2. एक biostatic और ग्राफिक सॉफ्टवेयर उपकरण के लिए ऊपर सॉफ्टवेयर से संसाधित डेटा स्थानांतरण. चुनाव आयोग 50 और सीसी 50 के मूल्यों को निर्धारित करने के लिए गैर रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण करना.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

1. परिसर के antiviral प्रभावकारिता

सेल आधारित सीपीई परख, विकसित और अनुकूलित पहले 2,5 के रूप में वर्णित BTV के खिलाफ उपन्यास antivirals की पहचान करने के लिए luminescent आधारित CTG किट का उपयोग कर इन विट्रो में मान्य किया गया था. दस खुराक प्रतिक्रिया परख जीवित कोशिकाओं 5,11 में प्रस्तुत सेलुलर एटीपी के quantitation पर आधारित संस्कृति में पाचन व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या को मापने के द्वारा एक पहचान नेतृत्व परिसर के antiviral प्रभावकारिता और cytotoxicity प्रतिबिंबित करने के लिए नियुक्त किया गया था. हमारी पिछली रिपोर्ट में, संभावित antiviral यौगिकों की एक संख्या BTV 5 के खिलाफ एचटीएस के माध्यम से पहचान प्रत्येक क्लस्टर से यौगिकों सहित, मूल्यांकन, और उनके डेरिवेटिव के माध्यम से नए सिरे से संश्लेषण 2 गया. उनके चुनाव आयोग 50 के आधार पर, सीसी 50 और एसआई 50, कई होनहार नेतृत्व यौगिकों शक्तिशाली antiviral प्रभावकारिता, कम विषाक्तता और उच्च चयनात्मकता के साथ पहचान की गई. उदाहरण के लिए, compound052 (C052)0.27 ± 0.12 माइक्रोन की एक चुनाव आयोग 50 (चित्रा 1) के 2 और 82.69 माइक्रोन से एक सीसी 50, गैर रेखीय प्रतिगमन के तहत दोनों दिखा ठेठ प्रतिगामी घटता 2 का विश्लेषण करती है करने के लिए निर्धारित किया गया था. C052 के एसआई 50 अपने ईसी 50 और सीसी 50 मूल्यों पर आधारित 306 पर निर्धारित किया गया था. nanomolar पैमाने एंटीवायरल प्रभावकारिता, कम विषाक्तता, और फलस्वरूप उच्च एसआई 50 C052 BTV के खिलाफ एक शक्तिशाली और चुनिंदा एंटीवायरल हो सकता है कि संकेत दिया.

2. एंटीवायरल परिसर के लिए संभावित एमओए

TOA परख यौगिकों द्वारा लक्षित वायरल जीवन चक्र के संभावित मंच (ओं) निर्धारित करने के उद्देश्य से किया गया था. पूर्व BTV संक्रमण के लिए 1 या 2 घंटे में C052 जोड़ने, यानी -1 और -2 HPI, एंटीवायरल efficacies, C052 वायरल जीवन चक्र के प्रारंभिक चरण से आगे कार्रवाई हो सकती है यह दर्शाता है कि nanomolar पैमाने (चित्रा 2) के 2 पर बने इस तरह के वायरस प्रविष्टि के रूप में. FurtheC052 के रूप में बाद में 24 HPI के रूप में संक्रमित कोशिकाओं को जोड़ा गया है जब तक rmore, एंटीवायरल प्रभावकारिता अपरिवर्तित रहे. 32 HPI में जोड़ा है, व्यवहार्य कोशिकाओं का प्रतिशत C052 वायरल जीवन चक्र के इस स्तर पर कम रक्षात्मक था यह दर्शाता है कि C052 उपचार कोशिकाओं में कमी आई है. 48 HPI में जोड़ा है, BTV प्रेरित सीपीई से बीएसआर कोशिकाओं को कोई सुरक्षा नहीं थी. आमतौर पर 24 HPI भीतर संक्रमित कोशिकाओं में पूरा BTV वायरल प्रतिकृति के पहले चक्र के बाद से, हमारे परिणाम C052 ऐसे वायरस प्रतिकृति, पैकेजिंग, परिपक्वता और निकास के रूप में BTV वायरल जीवन चक्र की देर चरणों, पर कार्य हो सकता है कि सुझाव दिया. इस बीच, यह C052 देर वायरल जीवन चक्र 2 के दौरान शामिल किया गया है कि मेजबान सेलुलर मशीनरी पर कार्य कर सकते हैं कि यह भी संभव है.

तालिका 1
तालिका 1. खुराक प्रतिक्रिया परख के लिए थाली लेआउट. C052 के antiviral प्रभावकारिता का मूल्यांकन किया गया था384 अच्छी तरह से थाली के भीतर एक 96 अच्छी तरह से बड़े पैमाने में डी. BTV संक्रमण प्लस अलग C052 सांद्रता सहित प्रत्येक उपचार, आठ प्रतिकृतियां के साथ प्रदर्शन किया गया था. 72 HPI में, सेल व्यवहार्यता CTG किट का उपयोग कर निर्धारित किया गया था.

तालिका 2
टेबल. समय के जोड़ (TOA) परख के लिए 2 थाली लेआउट. लेआउट में संकेत के रूप C052 के TOA परख 384 अच्छी तरह से थाली में मूल्यांकन किया गया था. BTV संक्रमण प्लस C052 जोड़ने के समय सहित प्रत्येक उपचार, आठ प्रतिकृतियां के साथ किया गया. -2 और -1 HPI C052 BTV संक्रमण से पहले कोशिकाओं को जोड़ा गया है कि संकेत मिलता है. 0 HPI में, BTV और C052 एक साथ जोड़ा गया था. 72 HPI में, सेल व्यवहार्यता CTG किट का उपयोग कर निर्धारित किया गया था. टेबल देखने के लिए यहां क्लिक करें .


चित्रा 1. आकृति में संकेत के रूप C052. प्रकोष्ठों के antiviral प्रभावकारिता, C052 के दस विभिन्न सांद्रता की उपस्थिति में 0.01 के MOI में BTV से संक्रमित थे. सेल व्यवहार्यता CTG किट का उपयोग कर, 72 HPI पर निर्धारित किया गया था. प्रत्येक डेटा बिंदु पाँच replicates से मतलब है और एसडी प्रतिनिधित्व करता है. यह आंकड़ा गुजरात एट अल से संशोधित किया गया है. 2012 2.

चित्रा 2
चित्रा 2. संकेत के रूप C052 के लिए समय के अलावा परख. 2.5 मिमी और क्रमशः 0.27 मिमी, पर C052, अलग HPI पर BTV संक्रमित कोशिकाओं को जोड़ा गया है, और BTV प्रेरित सीपीई, या सेल व्यवहार्यता के खिलाफ C052 के संरक्षण, का उपयोग मापा गया था 72 HPI प्रत्येक डेटा बिंदुओं पर CTG किट औसत मूल्य प्रतिनिधित्वआठ स्वतंत्र प्रतिकृति के से है और SD. यह आंकड़ा गुजरात एट अल से संशोधित किया गया है. 2012 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

एंटीवायरल हिट की प्रारंभिक पहचान के लिए, एंटीवायरल दवाओं की खोज और विकास के लिए महत्वपूर्ण कदमों में से एक, एक quantifiable मार्कर का चयन एक सरल प्रोटोकॉल के विकास, पर्याप्त संकेत है और कम से कम 10% सीवी प्राप्त करने के जो भी शामिल है, मजबूत assays विकसित करने के लिए है. अधिकांश जैव रासायनिक या सेल आधारित स्क्रीन के कारण जांच प्रक्रिया में आवश्यक reproducibility और जांच की अणुओं की संभावित बड़ी संख्या के लिए सबसे मजबूत, सरल और सस्ती परख के आधार पर एक रसायन के प्रारंभिक बिंदु प्रदान करने के लिए तैयार कर रहे हैं. सीपीई आधारित परख एक बड़े परिसर पुस्तकालय से प्रभावी हिट की पहचान करने के लिए इन आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए नामित किया गया था. सीपीई वायरस का गुणन के साथ जुड़े संवर्धित कोशिकाओं पर प्रतिकूल प्रभाव को दर्शाता है. विभिन्न assays तंत्र मृत कोशिकाओं की संख्या (cytotoxicity), जीवित कोशिकाओं की संख्या (व्यवहार्यता) का संकेत विभिन्न मार्करों की एक किस्म को मापने के माध्यम से सीपीई सूचक का उपयोग करने के लिए उपलब्ध हैं, औरकोशिका मृत्यु का (apoptosis). सीपीई आधारित परख के लिए वाणिज्यिक अभिकर्मकों एक सरल परख प्रोटोकॉल के साथ उपलब्ध हैं. उदाहरण के लिए, CTG किट एकल "मिश्रण और उपाय" कदम भी शामिल है और व्यापक रूप से वायरस प्रेरित सीपीई यों इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, सीपीई आधारित परख तेजी से सीपीई के लिए प्रेरित कर सकता है कि वायरस के लिए सीमित है. तेजी से सीपीई के लिए प्रेरित नहीं है कि वायरस के लिए, विभिन्न assays विकसित किया गया है. उदाहरण के लिए, replicon-शरण सेल लाइन का उपयोग कर replicon आधारित परख अनुवाद, polyprotein प्रसंस्करण, और ऋण और प्लस कतरा शाही सेना संश्लेषण 12-14 सहित वायरल प्रतिकृति के inhibitors, के लिए स्क्रीनिंग की अनुमति देता है. antisense शाही सेना की रणनीतियों और छोटे अणु पुस्तकालयों की आभासी स्क्रीनिंग भी संभव antivirals 15,16 की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. फिर भी, यह एक एंटीवायरल दवा की प्रभावकारिता पूरे वायरल जीवन चक्र के खिलाफ antiviral प्रभावकारिता के मूल्यांकन की अनुमति देता है जो इन विट्रो सेल आधारित परख में मान्य किया है कि महत्वपूर्ण है. सीपीई आधारितपरख सफलतापूर्वक उच्च throughput स्वरूप में रूपांतरित किया और इन्फ्लूएंजा वायरस 6,17, सीवियर एक्यूट रेस्पिरेटरी सिंड्रोम कोरोना (सार्स-COV) 18 के खिलाफ हाल ही में पूरा किया एचटीएस चोकर सहित बड़ी यौगिक पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग के लिए सबसे अधिक विश्वसनीय और मजबूत परख से एक है किया गया है , 19 arenaviruses, और reovirus (Bluetongue वायरस) 5.

खुराक प्रतिक्रिया परख आगे आमतौर पर एक बड़े परिसर पुस्तकालय स्क्रीनिंग के बाद, एक खुराक सीपीई आधारित परख के माध्यम से पहचान हिट के antiviral प्रभावकारिता को मान्य करने के लिए नामित किया गया था. ये हिट, antiviral गतिविधि के साथ की पहचान हालांकि, एक दवा बनने के लिए अपनी क्षमता प्रकट करने के लिए आगे की पुष्टि की जरूरत है. एक परिसर के antiviral प्रभावकारिता चुनाव आयोग 50, सीसी 50 और खुराक प्रतिक्रिया विश्लेषण का उपयोग एसआई 50 मूल्य के माध्यम से विश्लेषण के माध्यम से पता चला जा सकता है. इस बीच, बाहर बंद लक्ष्य या झूठी सकारात्मक पहचान की जाएगी और नेतृत्व COMP की संख्याounds नीचे संकुचित किया जा सकता है. इस विश्लेषण के माध्यम से, मिश्रित potencies और toxicities के आदेश विशेष रूप से संरचना गतिविधि संबंध (एसएआर) विश्लेषण और भविष्य औषधीय रसायन विज्ञान संशोधन के लिए, भविष्य एंटीवायरल दवाओं की खोज करने के लिए प्रत्यक्ष वें स्थान पर किया जा सकता है. वास्तव में, यौगिक C052 इन विट्रो और इन विवो दोनों में अच्छी दवा जैसे गुणों के साथ जुड़ा हुआ है, जो परिसर C003, के व्युत्पन्न था.

एक दवा के लिए आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए, यह शारीरिक सांद्रता में अपने लक्ष्य के साथ एक यौगिक की बातचीत के लिए चिह्नित करने के लिए अपने एमओए, यानी निर्धारित करने के लिए बहुत जरूरी है. विभिन्न assays यानी लक्ष्य को बाधित करने के लिए न केवल लेकिन स्वीकार्य घुलनशीलता, पारगम्यता, प्रोटीन बंधन, चयनात्मकता, चयापचय और विषाक्तता प्रोफाइल है करने के लिए, विशेष रूप से antivirals के विकसित किया गया है. एमओए पढ़ाई श्रमसाध्य प्रयासों, शक्तिशाली ईसी 50, उच्च सीसी 50 और ज के साथ केवल कुछ चयनित अणुओं, की आवश्यकता होगी, कम throughput परख थेigh एसआई 50 मूल्य, आसानी से विश्लेषण किया जा सकता है. एक इस स्तर पर एक परिसर के एमओए समझने सेलुलर गतिविधि की व्याख्या या अपनी अनुपस्थिति को गहराई से जोड़ सकते हैं. TOA अध्ययन एंटीवायरल वायरल या मेजबान लक्ष्य के साथ सूचना का आदान प्रदान जब मंच को सटीक बनाने के नामित है. एक परिसर को जानने आगे एमओए विश्लेषण के लिए एक तत्काल दिशा प्रदान कर सकता है निश्चित स्तर वायरल जीवन चक्र में एक सब्सट्रेट के साथ प्रतिस्पर्धात्मक है. वैकल्पिक रूप से, परख सहित ज्ञात तंत्र, के साथ और अधिक शक्तिशाली सेल आधारित परख सीधे प्रोटीन 21 सतह के लिए बाध्य वायरस बाधा, एचआईवी -1 इंटिग्रेस inhibitors 20 के लिए स्क्रीन वास्तविक चोकर 22 से पहले जाना जाता एमओए जो उपलब्ध कराने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इन स्क्रीनिंग से हिट नामित एमओए के लिए अच्छी तरह से संबंधित हो सकता है, वास्तव में एमओए भी TOA और कार्रवाई के अध्ययन के अन्य तंत्र के अधीन करने के लिए वहाँ की जरूरत हो सकती है.

संक्षेप में, यहाँ बताया तीन assays का उपयोग, हम सफलतापूर्वक जांच की और पहचान की हैC003 और C052 2 सहित BTV के खिलाफ कई शक्तिशाली antivirals,. विशेष रूप से, C052 के एसआई 50 (C052 BTV के खिलाफ अत्यधिक चयनात्मक है कि जो सुझाव दिया है, 306 पर था. TOA और मूल अखबार में प्रस्तुत अन्य एमओए अध्ययन के माध्यम से, हम C052 मेजबान के साथ बातचीत के एक संभावित antiviral एजेंट हो सकता है कि प्रस्तावित भोजी मशीनरी, एक विरोधी BTV दवा के रूप में विकसित किया जा सकता है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

इस परियोजना अनुदान 1R03MH08127-01 और एनआईएच से प्र. ली को 7R03MH08127-02 के द्वारा समर्थित है, और UAB में चिकित्सा विभाग से प्रभाव निधियों द्वारा प्र. ली के लिए किया गया था. Molette फंड और Auburn विश्वविद्यालय से समर्थन की सराहना की है. हम भी काम के दौरान सुश्री पुलिन चे और श्री वलोडिमिर Musiienko से तकनीकी assistances धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM medium Gibco 1134218 For cell culture
FBS Gibco 16000044 For cell culture
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 1000185 For cell culture
DPBS Gbico 1049769 For cell culture
CellTiter-Glo (CTG) kit Promega TB288 For cell viability measurement
70% ethanol Fisher S25309B Diluted from 95%
Antiviral huashilcompounds NIH MLSMR and de novo synthesis
BTV-10 ATCC VR-187
BSR cell Developed in house
Synergy-II multi-mode microplate reader BioTek For luminescent signal reading
MicroFlo select dispenser BioTek Adding cells, virus, and reagents
384-well flat-bottom microplate CORNING 28908031 For cell culture
Gen. 5 software BioTek For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader
GraphPad Prism 5 GraphPad Version 5 For biostatic analysis and plot

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hemati, B., et al. Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph. J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).
  2. Gu, L., et al. Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus. PLoS ONE. 7, e43341 (2012).
  3. Meiswinkel, R., et al. The 2006 outbreak of bluetongue in northern Europe--the entomological perspective. Prev. Vet. Med. 87, 55-63 (2008).
  4. Szmaragd, C., et al. Mortality and case fatality during the recurrence of BTV-8 in northern Europe in 2007. Vet. Rec. 161, 571-572 (2007).
  5. Li, Q., Maddox, C., Rasmussen, L., Hobrath, J. V., White, L. E. Assay development and high throughput antiviral drug screening against Bluetongue virus. Antiviral Research. 83, 267-273 (2009).
  6. Noah, J. W., et al. A cell-based luminescence assay is effective for high-throughput screening of potential influenza antivirals. Antiviral Res. 73, 50-59 (2007).
  7. Che, P., Wang, L., Li, Q. The development, optimization and validation of an assay for high throughput antiviral drug screening against Dengue virus. Int. J. Clin. Exp. Med. 2, 363-373 (2009).
  8. Li, Q., Li, H., Blitvich, B. J., Zhang, J. The Aedes albopictus inhibitor of apoptosis 1 gene protects vertebrate cells from bluetongue virus-induced apoptosis. Insect Mol. Biol. 16, 93-105 (2007).
  9. Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell number. J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).
  10. Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J. Virol. 73, 251-259 (1999).
  11. Phillips, T., Jenkinson, L., McCrae, C., Thong, B., Unitt, J. Development of a high-throughput human rhinovirus infectivity cell-based assay for identifying antiviral compounds. J. Virol. Methods. 173, 182-188 (2011).
  12. Harvey, T. J., et al. Tetracycline-inducible packaging cell line for production of flavivirus replicon particles. J. Virol. 78, 531-538 (2004).
  13. Puig-Basagoiti, F., et al. High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 4980-4988 (2005).
  14. Puig-Basagoiti, F., et al. Triaryl pyrazoline compound inhibits flavivirus RNA replication. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 1320-1329 (2006).
  15. Duan, M., et al. In vitro and in vivo protection against the highly pathogenic H5N1 influenza virus by an antisense phosphorothioate oligonucleotide. Antivir. Ther. 13, 109-114 (2008).
  16. Ray, D., Shi, P. Y. Recent advances in flavivirus antiviral drug discovery and vaccine development. Recent Pat. Antiinfect. Drug Discov. 1, 45-55 (2006).
  17. Severson, W. E., et al. High-throughput screening of a 100,000-compound library for inhibitors of influenza A virus (H3N2). J. Biomol. Screen. 13, 879-887 (2008).
  18. Severson, W. E., et al. Development and validation of a high-throughput screen for inhibitors of SARS CoV and its application in screening of a 100,000-compound library. J. Biomol. Screen. 12, 33-40 (2007).
  19. Bolken, T. C., et al. Identification and characterization of potent small molecule inhibitor of hemorrhagic fever New World arenaviruses. Antivir. Res. 69, 86-97 (2006).
  20. Van Loock, M., et al. A novel high-throughput cellular screening assay for the discovery of HIV-1 integrase inhibitors. J. Virol. Methods. 179, 396-401 (2012).
  21. Kampmann, T., et al. In silico screening of small molecule libraries using the dengue virus envelope E protein has identified compounds with antiviral activity against multiple flaviviruses. Antiviral Res. 84, 234-241 (2009).
  22. Kirchmair, J., et al. Development of anti-viral agents using molecular modeling and virtual screening techniques. Infect. Disord. Drug Targets. 11, 64-93 (2011).

Tags

इम्यूनोलॉजी अंक 80 दवाओं की खोज दवा मूल्यांकन preclinical मूल्यांकन अध्ययन विषय दवा मूल्यांकन व्यवहार्यता अध्ययन के रूप में जैविक परख प्रौद्योगिकी औषधि उच्च throughput स्क्रीनिंग assays पशु रोग तकनीक खोजी विषाणु क्षमता Bluetongue वायरस कोशिकाविकृति संबंधी प्रभाव खुराक प्रतिक्रिया समय के अलावा तंत्र की कार्रवाई
Bluetongue वायरस के खिलाफ उपन्यास antivirals की पहचान के लिए assays
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gu, L., Schneller, S. W., Li, Q.… More

Gu, L., Schneller, S. W., Li, Q. Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus. J. Vis. Exp. (80), e50820, doi:10.3791/50820 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter