Summary
Tre saggi, tra cui l'effetto citopatico (CPE) a base di test, analisi dose-risposta e Time-of-Addition (ToA) test sono stati sviluppati, ottimizzati, validati ed utilizzati per identificare nuovi farmaci antivirali contro il virus della Bluetongue (BTV), nonché per determinare il meccanismo d'azione possibile (MOA) per i farmaci antivirali di nuova identificazione.
Abstract
Per identificare potenziali farmaci antivirali contro il BTV, abbiamo sviluppato, ottimizzato e validato tre saggi qui presentati. Il saggio basato CPE-è stato il primo test sviluppato per valutare se un composto ha mostrato alcuna efficacia antivirale e sono stati utilizzati per lo screening grande libreria di composti. Nel frattempo, la citotossicità di farmaci antivirali potrebbe anche essere valutata utilizzando il saggio basato CPE-. Il dosaggio dose-risposta è stato progettato per determinare il campo di efficacia per l'antivirale prescelto, cioè il 50% della concentrazione inibente (IC 50) o la concentrazione effettiva (EC 50), così come la sua gamma di citotossicità (CC 50). Il saggio ToA è stato impiegato per lo studio iniziale MoA per determinare il meccanismo alla base dei nuovi farmaci antivirali durante il ciclo di vita virale del virus o il possibile effetto su un host macchinario cellulare. Questi test sono essenziali per la valutazione dell'efficacia antivirale nel sistema di coltura cellulare, e sono stati utilizzati per le nostre ricerche recenti portarezione per l'identificazione di una serie di nuovi farmaci antivirali contro il BTV.
Introduction
BTV è un prototipo di virus a RNA a doppio filamento in genere Orbivirus, famiglia Reoviridae. BTV è una delle malattie più importanti del bestiame domestico, tra cui ovini, caprini, bovini e altri animali domestici, con la perdita di 3.000 milioni dollari / anno nel mondo 1,2. La BTV sierotipo esotico è un importante patogeno animale elencati nella sezione "USDA alta Consequence Bestiame patogeni." Recentemente, il riemergere di BTV ha causato una grave focolaio di malattia in bovini e ovini in diversi paesi in tutto il Nord Europa 3,4. Come risultato della sua rilevanza economica e come sistema modello, BTV è stato oggetto di approfonditi studi molecolari, genetici e strutturali, e sono stati sviluppati diversi vaccini. Tuttavia, a causa della mancanza di test adeguati per la scoperta di farmaci antivirali, non ci sono disponibili antivirali contro BTV.
In un recente screening ad alto rendimento (HTS) campagna usando BTV come sistema modello, Developed, ottimizzato e convalidato un saggio basato CPE-per identificare i potenziali antivirali ad ampio spettro contro arbovirus 5. Saggio basato CPE-è un saggio ben riconosciuto che è stato usato nella scoperta di farmaci antivirali contro una serie di virus che ha indotto un rapido e osservabile CPE / apoptosi 5-7. Nel nostro sistema, infezioni post BTV, CPE è evidente nelle cellule dei vertebrati, tra cui HeLa, BSR, e HEK 293T 8. CPE BTV-indotta potrebbe essere monitorato e quantificato utilizzando vari metodi di rilevamento vitalità cellulare, compreso il kit di reagenti vitalità cellulare CellTiter Glo (kit CTG) 9. Questo kit determina il numero di cellule vitali in coltura a base di quantificazione di ATP cellulare presentato, che segnala la presenza di cellule viventi metabolicamente attive. In condizioni ottimali, il saggio basato CPE-qui presentato ha dimostrato la sua fattibilità con il protocollo di un passo "mix e misura", e la flessibilità con i segnali luminescenti stabili. Nel frattempo, composti tossici riduziamento vitalità cellulare sarà escluso in questo saggio basato CPE. Il saggio basato CPE-ha mostrato la sua robustezza e affidabilità per la scoperta di farmaci antivirali contro BTV, ed è stato utilizzato per schermare il NIH molecolare Biblioteche Piccolo Molecola Repository (MLSMR), che porta alla identificazione di sei romanzo gruppo di potenziali lead compound antivirale (s ) 5.
Quando un composto antivirale potenziale è stato identificato utilizzando il saggio basato CPE-, esso dovrà essere sottoposto al dieci concentrazione dosaggio dose-risposta per determinare l'intervallo di efficacia antivirale e citotossicità 2. L'efficacia antivirale, rappresentata come la concentrazione inibitoria del 50% (IC 50) o la concentrazione efficace 50% (EC 50), è la concentrazione di un farmaco che inibisce virus-indotto CPE metà strada tra la linea di base e massimo. La citotossicità dei farmaci antivirali, cioè la concentrazione citotossicità 50% (CC 50), è la concentrazionedi un farmaco che induce il 50% di citotossicità tra la linea base e massimo. L'indice selettivo (SI), indicato come 50% SI (SI 50) è calcolata da CC 50 / IC 50 che determina la specificità del CPE antivirale contro virus-indotta. L'IC 50 (o 50 CE), CC 50 e SI 50 valori sono misure fondamentali per determinare se un composto antivirale è potente e selettivo per l'ulteriore sviluppo della droga.
Quando un antivirale ha mostrato alcuna tossicità manifesta in vitro, ma virus impedito indotto CPE e il ciclo di vita virale produttiva, è importante per determinarne la MoA 2. Abbiamo avviato tale caratterizzazione effettuando test ToA per determinare l'eventuale fase (s) di virale ciclo di vita che è influenzata dal antivirale. In generale, composto antivirale sono stati aggiunti alle cellule in diversi momenti pre-o post-infezione da virus. Se gli antivirali sono stati aggiunti alle cellule infettate rispondere alla sua destinazione step durante il corso dell'infezione, ne risulterebbe minore attività rispetto a quella che è stata aggiunta prima della fase. Così, studio ToA è critica per determinare l'efficacia di un composto antivirale, e il suo potenziale bersaglio, sia sul ciclo di vita virale o della macchina ospitante coinvolti nel ciclo di vita virale.
Per tutti e tre saggi, la vitalità cellulare è stata determinata utilizzando il kit CTG seguenti istruzioni del produttore 5. Questo sistema di rilevamento emette adeguati segnali di luminescenza che potrebbero essere analizzate utilizzando i vari software in-house. Ogni test è stato convalidato ed eseguito in almeno tre esemplari con otto repliche. Per tutti i dati ottenuti, tre parametri, con un valore medio (AVE), deviazione standard (DEVST), e coefficiente di variazione (CV) sono stati analizzati per determinare la robustezza del dosaggio. Una volta che la robustezza del saggio è stata determinata, i dati saranno ulteriormente analizzati e tracciati utilizzando vari biostatics e graficamentestrumenti di C 2.
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Protocol
1. Le cellule, virus e antivirale Compounds
- Mantenere cellule BSR, un derivato di criceto neonato (BHK) rene alveoli 10, in mezzo di Eagle modificato da Dulbecco (DMEM) contenente siero fetale di vitello al 5% (FCS), 100U/ml penicillina e 100 pg / ml streptomicina.
- Per tutti e tre saggi, cellule piastra in DMEM con 1% FCS, 100U/ml penicillina e 100 pg / ml streptomicina, ottimizzata in precedenza 5. Questo mezzo è indicato come terreno di coltura per tutti e tre saggi.
- Incubare tutte le celle in incubatrice a 37 ° C, con 5% di CO 2 e 80-95% di umidità.
- Targa-purificare e propagare il tipo 10 BTV (BTV-10) come descritto in precedenza 8. Diluire BTV-10 nel mezzo di saggio per ogni saggi designati.
- Sciogliere tutti i composti di prova in DMSO per formare uno stock con concentrazione a 10 mm. Conservare le scorte a -20 ° C.
- Diluire composti a concentrazioni desiderate utilizzando terreno di coltura per il designatod saggi 2.
2. Saggio-based CPE Uso CTG Kit
- Seed cellule BSR in una micropiastra 384 pozzetti (nero, formato da 16 x 24) con MicroFlo selezionare dispenser. La densità di semina è di 5.000 cellule / pozzetto, e il volume di semina è di 20 microlitri per l'analisi di efficacia antivirale.
- Incubare le cellule per 2-3 ore sino cellule ottenere aderente alla piastra di fondo.
- Aggiungere composto antivirale con una concentrazione finale di 10 mM di ciascun pozzetto. Mescolare completamente.
- Diluire BTV a titolo desiderato e aggiungere 5 ml BTV con denotato MOI a ciascun bene. Per il controllo bene, aggiungere 5 ml di mezzi di dosaggio. Incubare le cellule infettate per 72 ore a 37 ° C, con 5% di CO 2 e 80-95% di umidità.
- A 72 hpi, disgelo ed equilibrare tampone CTG e il substrato CTG liofilizzato a temperatura ambiente prima dell'uso. Ricostituire la soluzione omogenea reagente CTG miscelando il liofilizzato enzima / substrato e il reagente tampone secondo thle istruzioni e del produttore.
- Equilibrare le piastre di saggio a temperatura ambiente per 15 min.
- Aggiungere un volume uguale (25 microlitri) di reagenti CTG a ciascun pozzetto da un dispenser. Dopo incubazione per 15 minuti a temperatura ambiente al buio, misurare segnali di luminescenza utilizzando un lettore multi-mode con un tempo di integrazione di 0,1 sec.
3. Dose-risposta Assay
- Seme cellule BSR in una micropiastra a 384 pozzetti (nero, formato da 16 x 24) tramite un distributore, con una densità di semina di 5000 cellule / pozzetto in un volume semina di 20 microlitri per saggio antivirale efficacia e 25 pl per test di citotossicità, rispettivamente .
- Incubare le cellule per 2-3 ore a 37 ° C, con 5% di CO 2 e 80-95% di umidità fino cellule sono ben attaccato alla piastra.
- Saggio processo in una zona quarto della piastra a 384 pozzetti per ogni composto (equivalente ad una piastra a 96 pozzetti), come mostrato nella Tabella 1. Allocare otto repliche per ogni concentrazionein un singolo dosaggio. Assegnare la prima colonna come controllo positivo senza aggiungere composti e virus, e l'ultima colonna (12 °) come controllo negativo aggiungendo virus solo senza composti.
- Diluire composti a 50 mM in mezzo di saggio e aggiungere alla colonna 2 ° a 20 pl / pozzetto di saggio antivirale efficacia. Mescolare il composto cinque volte usando 8 canali pipetta semiautomatico ad una concentrazione di 25 mM.
- Utilizzando 8-channel pipetta semi-automatico, trasferire 20 microlitri miscela in 2 ° colonna per colonna successiva (3 °), mescolare bene per formare una concentrazione di 12,5 micron. Ripetere questo processo trasferendo 20 microlitri miscela di colonna 3 al colonna successiva (4 °) per formare un altro diluizioni doppie con una concentrazione di 6,25 pM. Ripetere questa diluizione seriale duplice fino al 11 esima colonna. Aspirare ed eliminare 20 microlitri della miscela nella 11 esima colonna dopo l'aggiunta e la miscelazione del compound.
- Aggiungere BTV-10, sulla base MOI di 0,01, ad ogni pozzetto da colonna a colonna 2 11 con un volume di 5 ml / pozzetto. Dopo aver aggiunto il virus, la concentrazione del composto finale in ciascuna colonna deve essere: 20 mM in colonna 2, 10 mM in colonna 3, e prosegue con una diluizione duplice giù a colonna 11 con una concentrazione finale di 0,04 pM.
- Aggiungere 5 ml di gamma medio colonna 1 come cellule di controllo solo (positivo) e 5 ml / pozzetto di BTV alla colonna 12 come infezione BTV unico controllo (negativo).
- Diluire composti ad una concentrazione iniziale di 200 pM per test di citotossicità. Analogamente, aggiungere 25 microlitri / pozzetto di composto alla colonna 2 e 5x mescolato con 8 canali pipetta semiautomatico ad una concentrazione di 100 mM. Non aggiungere BTV.
- Eseguire la diluizione serie duplice aspirando a 25 microlitri dalla colonna 2 alla colonna vicina 3, e continuò fino all'ultima colonna (12 °). Alla colonna 12, dopo la miscelazione, aspirare e scartare 25 ml di mixture. La concentrazione finale in colonna 2 dovrebbe essere di 100 micron e la 12 esima colonna deve essere di 0,2 micron. La colonna 1 è l'unico controllo cella.
- Per entrambi l'efficacia e la citotossicità saggi antivirali, incubare le piastre a 37 ° C, con il 5% di CO 2 e 80-95% di umidità per 72 ore dopo il trattamento. Misurare la vitalità cellulare utilizzando il kit di CTG come descritto sopra (protocollo passaggi 2,5-2,7).
4. Time-of-Addition (ToA) Assay
- Seme cellule BSR da 1-24 colonna in una micropiastra a 384 pozzetti (nero, formato da 16 x 24) tramite un dispenser a 5.000 cellule / pozzetto e il volume semina è 15 microlitri / pozzetto.
- Per ogni composto, utilizzare tutti ventiquattro colonne con otto repliche per ogni punto temporale in una metà della piastra a 384 pozzetti (Tabella 2). Assegnare colonna 1 come cellule controllo solo con l'aggiunta di 10 microlitri / pozzetto terreno di coltura. Mark colonna 24 come infezione BTV solo controllo (controllo negativo) aggiungendo 5 microlitri / pozzetto dosaggio medio divirus d 5 microlitri / pozzetto a MOI di 0,01 ad un volume finale di 25 microlitri / pozzetto.
- Selezionare le colonne con numeri da colonna 2-22 come antivirale colonna di valutazione di efficacia in diverse ore dopo l'infezione (HPI). In queste colonne, infettare le cellule con 5 ml / pozzetto BTV al MOI di 0.01. Al diversa hpi, aggiungi 5 microlitri / composto ben diluito ad ogni pozzetto per formare un volume finale di 25 microlitri / pozzetto. Per il indicati -2 e -1 HPI aggiungono composto da cellule BSR prima infezione BTV. Per 0 hpi, aggiungere il composto e BTV alla cultura contemporanea.
- Parallelamente, designare le colonne dispari da colonna 3-23 come composto controlla solo, dei quali composto sono stati aggiunti a diversi punti temporali come designato (-2, -1, 0, 1, 2, 4, 8, 16, 24, 48 HPI). In queste colonne, aggiungere 5 microlitri medio / pozzetto dosaggio e 5 microlitri / pozzetto diluito composto per formare un volume finale di 25 microlitri / pozzetto.
- Dopo il trattamento, incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 con 80-95% di umidità.
- Determinare la vitalità cellulare a 72 HPI utilizzando il kit CellTiter-Glo come descritto in precedenza (protocollo passaggi 2,5-2,7).
5. Analisi dei dati
- Elaborare tutti i dati del primo utilizzo corretto del software in-house in base ai segnali luminescenti ottenuti tramite il lettore multi-mode. Determinare il valore medio (media), la deviazione standard (DEVST) per ogni trattamento, nonché le variazioni coefficiente (CV), che richiede un valore non superiore al 10%.
- Trasferire i dati elaborati dal software di cui sopra per un software biostatico e grafica. Effettuare l'analisi di regressione non lineare per determinare i valori di EC 50 e CC 50.
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Representative Results
1. Efficacia antivirale del composto
Il saggio CPE a base di cellule è stato sviluppato, ottimizzato e validato in vitro utilizzando il kit CTG basata luminescenti a identificare nuovi farmaci antivirali contro BTV come descritto in precedenza 2,5. Il test di risposta ten-dose è stata impiegata per riflettere l'efficacia antivirale e citotossicità di un composto guida identificato misurando il numero di cellule metabolicamente vitali in coltura a base di quantificazione di ATP cellulare presentato nelle cellule viventi 5,11. Nella nostra precedente relazione, un numero di potenziali composti antivirali sono stati valutati, compresi i composti di ciascun cluster identificati tramite HTS contro BTV 5, e loro derivati mediante sintesi de novo 2. Sulla base della loro EC 50, CC 50 e SI 50, vari composti di piombo promettenti sono stati identificati con potente efficacia antivirale, bassa tossicità ed elevata selettività. Ad esempio, compound052 (C052)è stato determinato per avere un EC 50 di 0,27 ± 0,12 mM (Figura 1) 2 e un CC 50 del 82.69 mM, sia mostrando curve tipiche regressive sotto la regressione non lineare analisi 2. Il SI 50 del C052 è stato determinato in 306 sulla base delle sue 50 CE, 50 e CC valori. L'efficacia scala nanomolar antivirale, bassa tossicità, e di conseguenza elevata SI 50 hanno indicato che C052 potrebbe essere un antivirale potente e selettivo contro BTV.
2. Potenziale MoA per il composto antivirale
Il saggio ToA mirava a determinare l'eventuale fase (s) di virale ciclo di vita di mira dai composti. Quando si aggiunge C052 a 1 o 2 ore prima dell'infezione BTV, vale a dire -1 e -2 HPI, i valori di efficacia antivirale sono rimasti alla scala nanomolare (Figura 2) 2, che indica che C052 potrebbe agire al di là della fase iniziale di viral ciclo di vita, come la voce virus. Furthermore, l'efficacia antivirale è rimasto invariato fino C052 è stato aggiunto alle cellule infette come più tardi come 24 hpi. Quando aggiunto a 32 hpi, la percentuale di cellule vitali è diminuita in cellule di trattamento C052, C052 indicando che era meno protettivo in questa fase del ciclo di vita virale. Quando aggiunto a 48 hpi, non vi era alcuna protezione per le cellule BSR da CPE BTV-indotta. Dal momento che il primo ciclo di replicazione virale BTV normalmente completata nelle cellule infette entro 24 hpi, i nostri risultati suggeriscono che C052 potrebbe agire nelle ultime fasi della BTV virale ciclo di vita, come la replicazione del virus, l'imballaggio, la maturazione e l'uscita. Nel frattempo, è anche possibile che C052 può agire sulla ospitanti macchinari cellulari che sono stati coinvolti durante virale ciclo di vita ritardo 2.
Tabella 1. Il layout di piastra per il dosaggio dose-risposta. L'efficacia antivirale di C052 è stata valutatad in una scala 96 pozzetti nella piastra a 384 pozzetti. Ogni trattamento, compresa l'infezione BTV più diverse concentrazioni C052, è stata eseguita con otto repliche. Al 72 hpi, la vitalità cellulare è stata determinata utilizzando il kit CTG.
Tabella. 2 Il layout di piastra per il saggio Time-of-Addition (ToA). Il dosaggio TOA C052 è stata valutata la piastra a 384 pozzetti come indicato nel layout. Ogni trattamento, compresa l'infezione BTV più il tempo di aggiunta C052, è stata effettuata con otto repliche. HPI -2 e -1 indicano che il C052 è stato aggiunto alle cellule prima dell'infezione BTV. A 0 HPI, BTV e C052 sono stati aggiunti contemporaneamente. Al 72 hpi, la vitalità cellulare è stata determinata utilizzando il kit CTG. Clicca qui per vedere tabella .
Figura 1. L'efficacia antivirale di C052. Cellule sono state infettate con BTV a MOI di 0,01 in presenza di dieci differenti concentrazioni di C052, come indicato in figura. La vitalità cellulare è stata determinata in 72 hpi, utilizzando il kit CTG. Ogni punto di dati rappresenta mezzi e SD da cinque repliche. Questa cifra è stata modificata da Gu et al. 2012 2.
Figura 2. Il dosaggio tempo di aggiunta per C052. C052 a 2,5 mm e 0,27 mm rispettivamente, è stato aggiunto alle cellule infettate BTV a diversi hpi come indicato, e la tutela della C052 contro il CPE BTV indotto, o la vitalità cellulare, è stata misurata utilizzando la kit CTG a 72 hpi Ogni punti dati rappresentato il valore medios e SD da otto repliche indipendenti. Questa cifra è stata modificata da Gu et al. 2012 2.
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Discussion
Per l'identificazione iniziale di colpi antivirali, uno dei passaggi chiave per la scoperta di farmaci antivirali e di sviluppo è quello di sviluppare analisi robuste, che prevede la selezione di un indicatore quantificabile, lo sviluppo di un protocollo semplice, ottenendo segnali sufficienti e meno del 10% CV. Quasi tutte le schermate biochimiche o basati su cellule sono progettati per fornire un punto di partenza chimica basato sulla più robusta, semplice e poco costoso saggio, causa la riproducibilità richiesta nel processo di selezione e potenzialmente elevato numero di molecole che saranno proiettati. Il saggio basato CPE-è stato designato per soddisfare tali requisiti di identificare colpi efficaci da una grande libreria composto. CPE riferisce effetto negativo sulle cellule coltivate associate alla proliferazione dei virus. Vari metodi sono disponibili per utilizzare l'indicatore CPE mediante misurazione di una varietà di differenti marcatori indicanti il numero di cellule morte (citotossicità), il numero di cellule vive (vitalità), e il meccanismodi morte cellulare (apoptosi). Reagenti commerciali per saggio basato CPE-sono disponibili con un semplice protocollo di dosaggio. Ad esempio, il kit comprende CTG singolo passo "mescolare e misurare" ed è stato ampiamente utilizzato per quantificare virus indotta CPE. Tuttavia, saggio basato CPE-è limitata a virus che potrebbero indurre una rapida CPE. Per i virus che non inducono rapida CPE, sono stati sviluppati vari metodi. Ad esempio, il saggio basato replicone-utilizzando la linea cellulare-replicone ospitare permette lo screening per gli inibitori della replicazione virale, compresa la traduzione, trasformazione poliproteina, e meno-piú filamento sintesi dell'RNA 12-14. Le strategie di RNA antisenso e screening virtuale di librerie di piccole molecole potrebbero anche essere usati per identificare possibili antivirali 15,16. Tuttavia, è fondamentale che l'efficacia di un farmaco antivirale convalidato nel saggio basato su cellule in vitro che consente la valutazione dell'efficacia antivirale contro l'intero ciclo di vita virale. A base di CPEsaggio è stato adattato con successo in formato throughput elevato ed è uno dei test più affidabile e robusto per la proiezione di grandi librerie di composti, tra cui recentemente compiuto HTS proiezioni contro il virus dell'influenza 6,17, grave sindrome respiratoria acuta coronavirus (SARS-CoV) 18 , arenaviruses 19, e Reovirus (virus della Bluetongue) 5.
Il dosaggio dose-risposta è stato designato per convalidare ulteriormente l'efficacia antivirale dei risultati identificati tramite il singolo saggio basato CPE dosi, di solito dopo screening di una grande libreria di composti. Questi risultati, anche se identificata con attività antivirale, bisogno di ulteriore conferma a rivelare le loro potenzialità per diventare una droga. Efficacia antivirale di un composto potrebbe essere rivelata attraverso l'analisi tramite EC 50, CC 50 e SI 50 valore utilizzando l'analisi dose-risposta. Nel frattempo, fuori fuori bersaglio o falsi positivi saranno identificati, e il numero di piombo compounds potrebbero essere ristretti verso il basso. Via questa analisi, l'ordine delle potenze composti e tossicità potrebbe essere classificato per dirigere futuro scoperta di nuovi farmaci antivirali, in particolare per il rapporto struttura-attività (SAR) analisi e futura modifica chimica farmaceutica. Infatti, composto C052 è un derivato del composto C003, che associata con buone proprietà farmacologiche sia in vitro che in vivo.
Per soddisfare i requisiti di un farmaco, è un must per determinare la sua MoA, cioè per caratterizzare l'interazione di un composto con il suo bersaglio a concentrazioni fisiologiche. Vari metodi sono stati sviluppati dei particolari antivirali, cioè di inibire non solo il bersaglio ma per avere solubilità accettabile, permeabilità, proteina di legame, selettività, metabolismo e tossicità profili. Poiché gli studi ministero dell'Agricoltura erano basso throughput test che necessitano di sforzi laboriosi, solo poche molecole selezionate, con potenti EC 50, alta CC 50 high SI 50 valore, potrebbe essere facilmente analizzati. Una comprensione della MoA di un composto in questa fase può aggiungere profondità alla interpretazione di attività cellulare o la sua assenza. Lo studio ToA è designato per restringere la fase in cui l'antivirale interagisce con gli obiettivi virali o di accoglienza. Conoscere un composto è competitivo con un substrato in certa fase del ciclo di vita virale potrebbe fornire una direzione immediata per ulteriori analisi MoA. In alternativa, saggio basato più potente cellulare con meccanismo conosciuto, compreso saggio di schermo direttamente per l'HIV-1 inibitori dell'integrasi 20, inibendo legame alle proteine di superficie del virus 21 potrebbero essere utilizzati che forniscono noto MoA prima proiezioni attuali 22. Mentre i risultati di questi controlli potrebbero legati alla MoA designato, in realtà ci MoA può anche essere necessario sottoporre a ToA e altro meccanismo degli studi di azione.
In sintesi, utilizzando i tre saggi qui riportati, abbiamo proiettato con successo e identificatidiversi farmaci antivirali potenti contro il BTV, tra cui C003 e C052 2. In particolare, il SI 50 (di C052 era fino a 306, che suggerisce che C052 è altamente selettiva contro BTV. Via Toa e altri studi ministero dell'Agricoltura presentate nel documento originale, abbiamo proposto che C052 potrebbe essere un potenziale agente antivirale interagire con l'host Macchine autofagia, potrebbe essere sviluppato in un farmaco anti-BTV.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Questo progetto è stato sostenuto dalla concessione 1R03MH08127-01 e 7R03MH08127-02 dal NIH per Q. Li, e dai fondi IMPACT dal Dipartimento di Medicina a UAB di Q. Li. Il sostegno del Fondo Molette e Auburn University è apprezzato. Ringraziamo anche le assistenze tecniche da Ms. Pulin Che e Mr. Volodymyr Musiienko durante il corso dei lavori.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM medium | Gibco | 1134218 | For cell culture |
| FBS | Gibco | 16000044 | For cell culture |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 1000185 | For cell culture |
| DPBS | Gbico | 1049769 | For cell culture |
| CellTiter-Glo (CTG) kit | Promega | TB288 | For cell viability measurement |
| 70% ethanol | Fisher | S25309B | Diluted from 95% |
| Antiviral huashilcompounds | NIH MLSMR and de novo synthesis | ||
| BTV-10 | ATCC | VR-187 | |
| BSR cell | Developed in house | ||
| Synergy-II multi-mode microplate reader | BioTek | For luminescent signal reading | |
| MicroFlo select dispenser | BioTek | Adding cells, virus, and reagents | |
| 384-well flat-bottom microplate | CORNING | 28908031 | For cell culture |
| Gen. 5 software | BioTek | For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader | |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad | Version 5 | For biostatic analysis and plot |
References
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