Summary
Tre analyser, inkludert den cytopatiske effekt (CPE)-baserte assay, dose-respons-analyse og Time-of-Addition (TOA) assay er blitt utviklet, optimalisert, validert og anvendt for å identifisere nye antivirale midler mot blutetonguevirus (BTV), samt som å bestemme mulige Mechanism-of-Handling (MoA) for nylig identifiserte antivirals.
Abstract
Å identifisere potensielle antivirale midler mot BTV, har vi utviklet, optimalisert og validert tre analysene som presenteres her. Den CPE-baserte analysen var det første assay utviklet for å evaluere hvorvidt en forbindelse viste noen antiviral effekt, og har blitt brukt for å screene store sammensatte bibliotek. Samtidig cytotoksisitet av antivirale midler kan også bli evaluert ved hjelp av CPE-basert assay. Dose-respons-analyse ble utviklet for å bestemme omfanget av effekt for den valgte antivirale, dvs. 50% hemmende konsentrasjon (IC 50), eller den effektive konsentrasjon (EC 50), så vel som dets spekter av cytotoksisitet (CC 50). Toa analysen ble ansatt for den innledende MoA studie for å fastslå den underliggende mekanismen for de nye antivirale midler under BTV viral livssyklus eller den mulige effekt på verten cellulære maskiner. Disse analyser er viktig for vurdering av antiviral effekt i cellekultursystem, og har vært brukt i våre nylige undersøkelser førering til identifisering av en rekke nye antivirale midler mot BTV.
Introduction
BTV er en prototype dobbel-strandet RNA-virus i slekten Orbivirus, familie Reoviridae. BTV er en av de viktigste sykdommer i husdyr, inkludert sau, geit, storfe og andre husdyr, med $ 3000000000 / år tap på verdensbasis 1,2. Den eksotiske BTV serotype er et viktig dyr patogen oppført i "USDA høy konsekvens oppdrett patogener." Nylig re-fremvoksende av BTV har forårsaket et stort utbrudd av sykdom hos storfe og sau i flere land over hele Nord-Europa 3,4. Som et resultat av dens økonomiske betydning og som et modellsystem, og BTV vært gjenstand for omfattende molekylære genetiske og strukturelle studier, og flere vaksiner har blitt utviklet. Imidlertid, på grunn av mangel på riktig analyser for antiviral medisiner, er det ingen tilgjengelige antivirale midler mot BTV.
I en nylig høy gjennomstrømming screening (HTS) kampanjen ved hjelp av BTV som modellsystem, vi developed, optimalisert og validert en CPE-basert analyse for å identifisere potensielle bredspekt antivirals mot arboviruses fem. CPE-baserte analysen er en velkjent metode som har vært brukt i antiviral medisiner mot en rekke virus som induseres hurtig og observerbar CPE / apoptose 5-7. I vårt system, post BTV infeksjon, er CPE tydelig i virveldyr celler, inkludert HeLa, BSR, og HEK 293T åtte. BTV-indusert CPE kunne overvåkes og kvantifisert ved hjelp av ulike celle levedyktighet deteksjonsmetoder, inkludert CellTiter Glo celleviabilitet agenssettet (CTG kit) 9. Dette settet bestemmer antallet levedyktige celler i kulturen basert på kvantifisering av cellulære ATP presentert, som signaliserer tilstedeværelsen av metabolsk aktive levende celler. Under optimale forhold, CPE-baserte analysen som presenteres her viste sin mulighetsstudie med "mikse og måle" ett skritt protokollen, og fleksibilitet med stabile selvlysende signaler. I mellomtiden, giftige forbindelser reduprosjektfinansiering celleviabilitet vil bli ekskludert i denne CPE-baserte analysen. CPE-baserte analysen viste sin robusthet og pålitelighet for antiviral medisiner mot BTV, og har blitt brukt til å skjerme NIH Molekylær biblioteker Small Molecule Repository (MLSMR), noe som fører til identifisering av seks roman klynge av potensiell antiviral lead compound (s ) 5.
Når en potensiell antivirale forbindelsen har blitt identifisert ved hjelp av CPE-baserte assay, må den bli utsatt for ti-konsentrasjonen dose-respons-analyse for å bestemme området for antiviral effekt og cytotoksisitet 2.. Den antivirale effekt, representert som den 50% hemmende konsentrasjon (IC 50), eller den 50% effektive konsentrasjon (EC 50), er konsentrasjonen av et stoff som inhiberer virus-indusert CPE midt mellom grunnlinjen og maksimum. Cytotoksisiteten av de antivirale midler, dvs. 50% cytotoksisitet konsentrasjon (CC 50), er konsentrasjonenav et medikament som induserer 50% av cytotoksisitet mellom grunnlinjen og maksimum. Den selektiv indeks (SI), betegnet som 50% SI (SI 50) beregnes ut fra CC 50 / IC 50 som bestemmer spesifisiteten av antiviral mot virus-indusert CPE. IC 50 (eller EF 50), CC 50 og SI 50 verdier er kritiske tiltak for å avgjøre om en antiviral compound er potent og selektiv for videreutvikling av narkotika.
Når et antiviralt viste ingen åpenbar toksisitet in vitro, men forhindret virus indusert CPE og produktiv viral livssyklus, er det viktig å karakterisere dens MoA 2. Vi har satt i gang en slik karakteristikk ved å utføre TOA assay for å bestemme den mulige trinn (e) av viral livssyklus som påvirkes av den antivirale. Vanligvis ble antiviral forbindelse tilsatt til cellene ved forskjellige tider før-eller etter-virus-infeksjon. Dersom antivirale ble tilsatt til de infiserte cellene selv legge til dens target step i løpet av infeksjon, vil det resultere i lavere aktivitet sammenlignet med den som ble tilsatt før trinnet. Således er TOA studie kritisk for å bestemme den antivirale effekt av en forbindelse, og dens potensielt mål, enten på den virale livssyklus, eller vertsmaskiner som er involvert i den virale livssyklusen.
For alle tre analysene, ble celle levedyktighet bestemmes ved hjelp av CTG kit etter produsentens anvisninger fem. Denne deteksjonssystem utganger tilstrekkelig luminescensparametere signaler som kunne analyseres ved hjelp av ulike in-house software. Hver analyse ble validert og utført i det minste i tre eksemplarer med åtte kopier. For alle de innhentede data, ble tre parametere, inkludert normalen (AVE), standardavvik (STDEV), og co-effektiv variasjon (CV) analysert for å fastslå robusthet av analysen. Når robustheten av analysen er fastsatt, vil dataene bli ytterligere analysert og plottet ved hjelp av ulike biostatics og grafiskc verktøy to.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Celler, virus og den antivirale forbindelser
- Oppretthold BSR-celler, et derivat av hamsterunge nyre (BHK) celler 10, i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) inneholdende 5% føtalt kalveserum (FCS), 100U/ml penicillin og 100 pg / ml streptomycin.
- I alle tre analysene, plate-celler i DMEM med 1% FCS, 100U/ml penicillin og 100 pg / ml streptomycin, som er optimalisert som tidligere 5. Dette medium omtales i analysemedium for alle tre analyser.
- Inkuber alle celler i inkubatoren ved 37 ° C med 5% CO2 og 80 til 95% fuktighet.
- Plaque-rensing og spre type 10 BTV (BTV-10) som beskrevet tidligere 8.. Fortynne BTV-10 i analysemedium for hver utpekt analyser.
- Oppløs alle testforbindelser i DMSO for å danne et lager med konsentrasjon på 10 mM. Oppbevar Beholdningen på -20 ° C.
- Fortynn forbindelser til ønskede konsentrasjoner ved bruk av analysemedium for utpeked analyser to.
2. CPE-baserte analysen Bruke CTG Kit
- Seed BSR celler i en 384-brønns mikro (svart; format med 16 x 24) via MicroFlo velger dispenser. Den seeding tetthet er 5,000 celler / brønn, og seeding volum er 20 ul av antiviral effekt analyse.
- Inkuber cellene i 2-3 timer før cellene får vedheftende til platen grundig.
- Legg antivirale forbindelsen med en endelig konsentrasjon på 10 uM til hver brønn. Bland det helt.
- Spe BTV til ønsket titer og legge 5 mL BTV med betegnes MOI til hver brønn. For kontrollen brønn, tilsett 5 pl prøvemedier. Inkuber de infiserte celler i 72 timer ved 37 ° C med 5% CO2 og 80 til 95% fuktighet.
- Ved 72 hpi, tin og likevekt CTG buffer og lyofilisert CTG substratet til romtemperatur før bruk. Rekonstituer homogen CTG reagens-løsning ved blanding av det lyofiliserte enzym / substrat og buffer-reagens i henhold til the produsentens anvisninger.
- Stabilanalyseplatene til romtemperatur i 15 min.
- Til et likt volum (25 ul) av CTG-reagenser til hver brønn av en dispenser. Etter inkubering i 15 min ved romtemperatur i mørke, måle luminescens-signaler ved hjelp av en flermodus-leser med en integrasjonstid på 0,1 sek.
Tre. Dose-respons-analyse
- Seed BSR-celler i en 384-brønners mikroplate (svart, format med 16 x 24) via en dispenser med et seeding densitet på 5000 celler / brønn i en seeding volum på 20 ul for antiviral effekt assay og 25 pl for cytotoksisitet assay, hhv .
- Inkuber cellene i 2-3 timer ved 37 ° C med 5% CO2 og 80 til 95% fuktighet inntil cellene er godt festet til platen.
- Prosess-assay i en kvart område av 384-brønners plate for hver forbindelse (tilsvarende en 96-brønns plate), som vist i tabell 1. Bevilge åtte replikater for hver konsentrasjoni en enkelt analyse. Tildel den første kolonnen som den positive kontrollen uten tilsetning av forbindelse og virus, og den siste kolonne (12.) som negativ kontroll ved tilsetning av virus bare uten forbindelser.
- Fortynn forbindelser til 50 uM i analysemedium og legge til den 2. kolonne på 20 ul / brønn for antiviral effekt assay. Bland forbindelsen fem ganger ved å bruke 8-kanals halvautomatisk pipette til en konsentrasjon på 25 uM.
- Ved å bruke 8-kanalers halv-automatisk pipette, overføre 20 ul blanding i 2. kolonne til den neste kolonne (3.), blandes godt for å danne en konsentrasjon på 12.5 mM. Gjenta denne fremgangsmåten ved å overføre 20 ul blandingen fra 3. kolonne til den neste kolonne (4.) for å danne en to-ganger fortynning med en konsentrasjon på 6,25 uM. Gjenta dette to-fold seriell fortynning till den 11. kolonnen. Aspirer og kast 20 pl av blandingen i 11 th kolonnen etter tilsetning og blanding av kompound.
- Legg BTV-10, basert på MOI på 0,01, til hver brønn fra kolonne 2 til kolonne 11 med et volum på 5 pl / brønn. Etter tilsetning av virus, bør den endelige forbindelseskonsentrasjon i hver søyle være: 20 uM i kolonne 2, 10 uM i kolonne 3, og fortsatte med en to-gangers fortynning ned til kolonne 11 med en endelig konsentrasjon på 0,04 uM.
- Tilsett 5 ul av medium i kolonne 1 i cellen bare kontroll (positiv) og 5 pl / brønn av BTV til kolonne 12 som BTV smitte eneste kontroll (negativ).
- Fortynn forbindelser til en initial konsentrasjon på 200 pM for cytotoksisitet assay. På samme måte, tilsett 25 ul / brønn av en forbindelse til kolonne 2 og blandet med 5 x 8-kanals halvautomatisk pipette til en konsentrasjon på 100 uM. Ikke legg til BTV.
- Gjennomføre de to-fold serie fortynning ved å aspirere 25 mL fra kolonne 2 til nabo kolonne 3, og fortsatte til den siste kolonnen (12 th). I kolonnen 12, etter blanding, aspirat og kast 25 pl av mixture. Den endelige konsentrasjonen i kolonne 2 bør være 100 mikrometer og 12. kolonnen bør være ved 0,2 pM. Kolonnen 1 er cellen bare kontroll.
- For begge antiviral effekt og cytotoksisitet assays, inkuberes platene ved 37 ° C med 5% CO2 og 80 til 95% fuktighet i 72 timer etter behandlingen. Mål celleviabilitet hjelp CTG settet som beskrevet ovenfor (protokoll trinn 2.5 til 2.7).
4. Time-of-Tilsetting (TOA) Assay
- Seed BSR celler fra kolonne 1-24 i en 384-brønns mikro (svart; format med 16 x 24) via en dispenser på 5000 celler / brønn og seeding volum er 15 mL / brønn.
- For hver forbindelse, utnytte alle tjuefire kolonner med åtte replikaer for hver tids-punkt i en halvdel av det 384-brønn plate (tabell 2). Tildel en kolonne som celler bare kontroll ved å tilsette 10 ul / brønn analysemedium. Mark kolonne 24 som BTV smitte eneste kontroll (negativ kontroll) ved tilsetning av 5 pl / brønn analysemedium end 5 pl / brønn virus ved MOI på 0,01 til et endelig volum på 25 ul / brønn.
- Velg partalls kolonner fra kolonne 2-22 som antiviral effekt evaluering kolonne på ulike timer etter infeksjon (HPI). I disse kolonner, infisere celler med 5 pl / brønn BTV ved MOI på 0,01. Ved forskjellig HPI, også legge til 5 pl / brønn fortynnet forbindelse til hver brønn for å danne et endelig volum på 25 ul / brønn. For den betegnet -2 og -1 HPI legge sammensatte til BSR celler før BTV infeksjon. For 0 HPI, legge det sammensatte og BTV til kulturen samtidig.
- Parallelt utpeke oddetalls kolonner fra kolonne 3-23 som sammensatte styrer bare, hvorav sammensatte ble lagt på ulike tidspunkter som angitt (-2, -1, 0, 1, 2, 4, 8, 16, 24, 48 hpi). I disse kolonner, tilsett 5 pl / brønn analysemedium og 5 pl / brønn fortynnet forbindelsen for å danne et endelig volum på 25 ul / brønn.
- Etter behandling, inkubere cellene ved 37 ° C, 5% CO 2 med 80 til 95% fuktighet.
- Bestem celle levedyktighet på 72 hpi bruker CellTiter-Glo kit som beskrevet tidligere (protokoll trinn 02.05 til 02.07).
5. Data Analysis
- Behandle alle dataene først med skikkelig intern programvare basert på de selvlysende signaler innhentet via flermodusleser. Bestem gjennomsnittsverdien (gjennomsnitt), standardavvik (STDEV) for hver behandling samt koeffisienten variasjoner (CV), som krever en verdi som ikke er større enn 10%.
- Overfør bearbeidet data fra ovenstående programvare til en biostatiske og grafisk programvare verktøyet. Gjennomfør den ikke-lineær regresjonsanalyse for å bestemme verdiene av EC 50 og CC 50.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En. Antiviral effekt av sammensatte
Den cellebaserte analysen CPE ble utviklet, optimalisert og validert in vitro ved hjelp av luminescerende baserte CTG kit for å identifisere nye antivirale midler mot BTV som beskrevet tidligere enn 2,5. Den ti-doserespons-analyse ble anvendt til å gjenspeile den antiviral effekt og cytotoksisitet til et identifisert bly forbindelsen ved å måle antallet av metabolisk levedyktige celler i kultur basert på kvantifisering av cellulære ATP presentert i de levende cellene 5,11. I vår forrige rapport, ble en rekke potensielle antivirale forbindelser evaluert, inkludert forbindelser fra hver klynge identifisert via HTS mot BTV fem, og deres derivater via de novo syntese to. Basert på deres EC 50, CC 50 og SI 50, flere lovende blyforbindelser ble identifisert med potente antiviral effekt, lav toksisitet og høy selektivitet. For eksempel, compound052 (C052)ble bestemt til å ha en EC50 på 0,27 ± 0,12 uM (figur 1) to og en CC 50 av 82,69 uM, begge som viser typiske kurver regressive under ikke-lineære regresjonsanalyser 2. SI 50 av C052 ble bestemt på 306 basert på sine EC 50 og CC 50 verdier. Den nanomolar skala antiviral effekt, lav toksisitet, og følgelig høy SI 50 indikerte at C052 kan være en potent og selektiv antivirale mot BTV.
2. Potensielle MoA for antiviral sammensatte
TOA-analysen var rettet til å bestemme den mulige trinn (e) av viral livssyklus målrettet av forbindelsene. Ved å legge til C052 på 1 eller 2 timer før BTV smitte, forble dvs. -1 og -2 hpi de antivirale efficacies ved nanomolar skala (figur 2) 2, noe som indikerer at C052 kan opptre ut over den tidlige fasen av viral livssyklus, som for eksempel virus oppføring. Furthermore, forble den antiviral effekt uendret inntil C052 ble lagt inn i infiserte celler som senere som 24 HPI. Når lagt på 32 HPI, prosentandelen av levedyktige celler redusert i C052 behandlings celler, noe som indikerer at C052 var mindre beskyttende på dette stadiet av viral livssyklus. Når lagt på 48 HPI, det var ingen beskyttelse til BSR celler fra BTV-indusert CPE. Siden den første syklusen av BTV virusreplikasjon gjort direkte i infiserte celler i løpet av 24 HPI, foreslo våre resultater at C052 kan handle på de sene stadier av BTV viral livssyklus, for eksempel virusreplikasjon, emballasje, modning og avstigning. Samtidig er det også mulig at C052 kan handle på verts cellulære machineries som var involvert i slutten av viral livssyklus to.
Tabell 1. Platen layout for dose-respons-analyse. Den antivirale effekten av C052 var evaluered i en 96-brønns fordeler i 384-brønn plate. Hver behandling, inkludert BTV infeksjon pluss forskjellige C052 konsentrasjoner, ble utført med åtte kopier. På 72 HPI, ble celle levedyktighet bestemmes ved hjelp av CTG kit.
Tabell. 2. Platen layout for Time-of-Addition (TOA) assay. Toa assay of C052 ble målt i 384-brønns plate som angitt i layouten. Hver behandling, inkludert BTV infeksjon pluss tid til å legge C052, ble utført med åtte kopier. De -2 og -1 HPI viser at C052 ble lagt inn i cellene før BTV infeksjon. Ved 0 HPI, ble BTV og C052 lagt samtidig. På 72 HPI, ble celle levedyktighet bestemmes ved hjelp av CTG kit. Klikk her for å se tabellen .
Figur 1. Den antivirale effekten av C052. Celler ble infisert med BTV ved MOI på 0,01 i nærvær av ti forskjellige konsentrasjoner av C052, som indikert i figuren. Cellenes levedyktighet ble bestemt ved 72 hpi, ved hjelp CTG kit. Hvert datapunkt representerer midler og SD fra fem replikater. Dette tallet har blitt forandret fra Gu et al. 2012 2.
Figur 2. Den time-of-tillegg assay for C052. C052 på 2,5 mM og 0,27 mM henholdsvis ble tilsatt til BTV infiserte celler ved forskjellig hpi som angitt, og beskyttelse av C052 mot BTV indusert CPE, eller celle-levedyktighet, ble målt ved å bruke CTG kit på 72 hpi Hver datapunkter representert gjennomsnittsverdiens og SD fra åtte uavhengige replikater. Dette tallet har blitt forandret fra Gu et al. 2012 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For den innledende identifisering av antivirale hits, er en av de viktigste trinnene for antiviral medisiner og utvikling for å utvikle robuste analyser, som inkluderer å velge en målbar markør, utvikle en enkel protokoll, skaffe tilstrekkelige signaler og mindre enn 10% CV. De fleste biokjemiske eller cellebaserte skjermer er utformet for å gi en kjemisk utgangspunktet basert på den mest robuste, enkle og rimelige analyse, på grunn av den ønskede reproduserbarhet i screeningprosessen og potensielt store antall molekyler som skal screenes. CPE-baserte analysen ble utpekt til å møte disse kravene for å identifisere effektive hits fra et stort kompleks bibliotek. CPE refererer til negativ effekt på de dyrkede celler som er knyttet til multiplikasjonen av virus. Ulike analyser er tilgjengelige for bruk i CPE-indikatoren ved måling av en rekke forskjellige markører som angir antallet av døde celler (cytotoksisitet), antall levende celler (levedyktighet), og mekanismenav celledød (apoptose). Kommersielle reagenser for CPE-baserte analysen kan leveres med et enkelt assay-forskrift. For eksempel omfatter CTG kit singelen "mikse og måle" steg og har vært mye brukt for å kvantifisere virus indusert CPE. Imidlertid er CPE-baserte analysen begrenset av virus som kan fremkalle hurtig CPE. For virus som ikke induserer rask CPE, har ulike analyser blitt utviklet. For eksempel replikonet basert assay ved bruk av replikon-husing cellelinje tillater screening for inhibitorer av viral replikasjon, inkludert translasjon, polyprotein prosessering, og minus-og pluss-tråd-RNA-syntesen 12-14. De antisense-RNA-strategier og virtuelle screening av små-molekyl-biblioteker også kunne brukes til å identifisere mulige antivirale 15,16. Ikke desto mindre er det viktig at effekten av et antiviralt medikament bli validert i det in vitro celle-baserte assay, som tillater evaluering av antiviral effekt mot hele den virale livssyklus. CPE-baserteAnalysen har blitt tilpasset til høy gjennomstrømning format og er en av de mest pålitelige og robuste assay for screening av store sammensatte biblioteker, inkludert nylig oppnådd HTS screenings mot influensavirus 6,17, alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus (SARS-CoV) 18 , arenaviruses 19, og reovirus (Bluetongue virus) 5.
Dose-respons-analyse ble utpekt for ytterligere å validere den antivirale effekten av treff som er identifisert via den enkle dose CPE-baserte assay, vanligvis etter screening av et stort sammensatt bibliotek. Disse treff, men identifiseres med antiviral aktivitet, trenger ytterligere bekreftelse for å avsløre sine potensialer til å bli et rusmiddel. Antiviral effekt av en forbindelse som kan bli avdekket gjennom analyse via EF-50, CC 50 og SI 50 verdi ved hjelp av dose-responsanalyser. I mellomtiden ut off-target-eller falske positiver vil bli identifisert, og antallet av bly kompounds kunne begrenses. Via denne analysen, kan rekkefølgen av sammensatte potens og toksisitet rangeres for å dirigere tidig antiviral medisiner, spesielt for struktur-aktivitetsforhold (SAR) analyse og fremtidige medisinsk kjemi modifikasjon. Faktisk sammensatte C052 var et derivat av forbindelsen med formelen C003, som forbundet med god stoff-lignende egenskaper både in vitro og in vivo.
For å møte kravene til et stoff, er det et must å bestemme sin MoA, dvs. å karakterisere samspillet mellom et sammensatt med sitt mål på fysiologiske konsentrasjoner. Ulike analyser har blitt utviklet av denne antivirale midler, det vil si ikke bare inhibere målet, men å ha akseptabel oppløselighet, permeabilitet, proteinbinding, selektivitet, metabolisme-og toksisitetsprofil. Siden MoA studiene var lav gjennomstrømming analysen trenger møysommelig innsats, bare noen få utvalgte molekyler, med potent EC 50, høy CC 50 og high SI 50 verdi, kan lett bli analysert. En forstå MoA av et sammensatt på dette stadiet kan legge dybde til tolkningen av cellulær aktivitet eller sitt fravær. Toa Studien er utpekt til å innskrenke scenen når den antivirale samhandler med viral eller verts mål. Å vite en sammensatt er konkurransedyktig med et substrat i visse stadium viral livssyklus kunne gi en umiddelbar retning for videre MoA analyse. Alternativt, mer potent cellebasert assay med kjent mekanisme, inkludert analysen direkte screene for HIV-1 integrasehemmere 20, hemmer virus binding til overflaten protein 21 kunne brukes som gir kjent MoA før selve screenings 22. Mens treff fra disse screening kan godt relatert til den utpekte MoA, det faktisk MoA kan også bli nødt til å utsette til Toa og annen mekanisme av aksjonsforskning.
I sammendraget, ved hjelp av de tre analysene som presenteres her, vi har med hell screenet og identifisertflere potente antivirale midler mot BTV, inkludert C003 og C052 to. Spesielt SI 50 (av C052 var opp til 306, noe som antydet at C052 er sterkt selektiv mot BTV. Via TOA og andre MoA studiene er presentert i det opprinnelige papir, har vi foreslått at C052 kan være en potensiell antivirusmiddel interaksjon med verts autophagy maskiner, kunne utvikles til en anti-BTV narkotika.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette prosjektet ble støttet av stipend 1R03MH08127-01 og 7R03MH08127-02 fra NIH til Q. Li, og av effekten midler fra Institutt for indremedisin ved UAB til Q. Li. Støtte fra Molette Fondet og Auburn University er verdsatt. Vi takker også de tekniske assistanser fra Ms Pulin Che og Mr. Volodymyr Musiienko i løpet av arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM medium | Gibco | 1134218 | For cell culture |
| FBS | Gibco | 16000044 | For cell culture |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 1000185 | For cell culture |
| DPBS | Gbico | 1049769 | For cell culture |
| CellTiter-Glo (CTG) kit | Promega | TB288 | For cell viability measurement |
| 70% ethanol | Fisher | S25309B | Diluted from 95% |
| Antiviral huashilcompounds | NIH MLSMR and de novo synthesis | ||
| BTV-10 | ATCC | VR-187 | |
| BSR cell | Developed in house | ||
| Synergy-II multi-mode microplate reader | BioTek | For luminescent signal reading | |
| MicroFlo select dispenser | BioTek | Adding cells, virus, and reagents | |
| 384-well flat-bottom microplate | CORNING | 28908031 | For cell culture |
| Gen. 5 software | BioTek | For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader | |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad | Version 5 | For biostatic analysis and plot |
References
- Hemati, B., et al. Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph. J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).
- Gu, L., et al. Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus. PLoS ONE. 7, e43341 (2012).
- Meiswinkel, R., et al. The 2006 outbreak of bluetongue in northern Europe--the entomological perspective. Prev. Vet. Med. 87, 55-63 (2008).
- Szmaragd, C., et al. Mortality and case fatality during the recurrence of BTV-8 in northern Europe in 2007. Vet. Rec. 161, 571-572 (2007).
- Li, Q., Maddox, C., Rasmussen, L., Hobrath, J. V., White, L. E. Assay development and high throughput antiviral drug screening against Bluetongue virus. Antiviral Research. 83, 267-273 (2009).
- Noah, J. W., et al. A cell-based luminescence assay is effective for high-throughput screening of potential influenza antivirals. Antiviral Res. 73, 50-59 (2007).
- Che, P., Wang, L., Li, Q. The development, optimization and validation of an assay for high throughput antiviral drug screening against Dengue virus. Int. J. Clin. Exp. Med. 2, 363-373 (2009).
- Li, Q., Li, H., Blitvich, B. J., Zhang, J. The Aedes albopictus inhibitor of apoptosis 1 gene protects vertebrate cells from bluetongue virus-induced apoptosis. Insect Mol. Biol. 16, 93-105 (2007).
- Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell number. J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J. Virol. 73, 251-259 (1999).
- Phillips, T., Jenkinson, L., McCrae, C., Thong, B., Unitt, J. Development of a high-throughput human rhinovirus infectivity cell-based assay for identifying antiviral compounds. J. Virol. Methods. 173, 182-188 (2011).
- Harvey, T. J., et al. Tetracycline-inducible packaging cell line for production of flavivirus replicon particles. J. Virol. 78, 531-538 (2004).
- Puig-Basagoiti, F., et al. High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 4980-4988 (2005).
- Puig-Basagoiti, F., et al. Triaryl pyrazoline compound inhibits flavivirus RNA replication. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 1320-1329 (2006).
- Duan, M., et al. In vitro and in vivo protection against the highly pathogenic H5N1 influenza virus by an antisense phosphorothioate oligonucleotide. Antivir. Ther. 13, 109-114 (2008).
- Ray, D., Shi, P. Y. Recent advances in flavivirus antiviral drug discovery and vaccine development. Recent Pat. Antiinfect. Drug Discov. 1, 45-55 (2006).
- Severson, W. E., et al. High-throughput screening of a 100,000-compound library for inhibitors of influenza A virus (H3N2). J. Biomol. Screen. 13, 879-887 (2008).
- Severson, W. E., et al. Development and validation of a high-throughput screen for inhibitors of SARS CoV and its application in screening of a 100,000-compound library. J. Biomol. Screen. 12, 33-40 (2007).
- Bolken, T. C., et al. Identification and characterization of potent small molecule inhibitor of hemorrhagic fever New World arenaviruses. Antivir. Res. 69, 86-97 (2006).
- Van Loock, M., et al. A novel high-throughput cellular screening assay for the discovery of HIV-1 integrase inhibitors. J. Virol. Methods. 179, 396-401 (2012).
- Kampmann, T., et al. In silico screening of small molecule libraries using the dengue virus envelope E protein has identified compounds with antiviral activity against multiple flaviviruses. Antiviral Res. 84, 234-241 (2009).
- Kirchmair, J., et al. Development of anti-viral agents using molecular modeling and virtual screening techniques. Infect. Disord. Drug Targets. 11, 64-93 (2011).
