Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Анализы для идентификации новых видов Antivirals против вируса катаральной лихорадки овец

Published: October 11, 2013 doi: 10.3791/50820
Automatic Translation
1, 2, 1
1Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 2Molette Laboratory for Drug Discovery, Department of Chemistry and Biochemistry, Auburn University

Summary

Три анализы, в том числе цитопатического эффекта (CPE) на основе анализа, доза-реакция для анализа и Время-дополнение (ToA) анализа были разработаны, оптимизированы, проверены и использованы для идентификации новых противовирусных препаратов против вируса синего языка (BTV), а также как определить возможный механизм-о-Action (MOA) для вновь выявленных противовирусных препаратов.

Abstract

Для выявления потенциальных противовирусных препаратов против BTV, мы разработали, оптимизированы и проверены три анализов, представленные здесь. CPE на основе анализа был первый анализ, разработанный для оценки соединение показало ли какие-либо противовирусную эффективность и были использованы для скрининга большой библиотеки соединений. Между тем, цитотоксичность противовирусных препаратов могут быть также оценивали с помощью CPE на основе анализа. Анализ доза-реакция была разработана, чтобы определить диапазон эффективности для выбранного антивирусного, т.е. 50% ингибирующей концентрации (IC 50) или эффективную концентрацию (ЕС 50), а также свой ​​ассортимент цитотоксичности (CC 50). Тоа анализ был использован для первоначального исследования МСХ, чтобы определить основной механизм романа противовирусных препаратов во время BTV вирусной жизненного цикла или возможного влияния на хозяина сотового оборудования. Эти анализы являются жизненно важными для оценки противовирусной эффективности в системе культуры клеток, и были использованы для наших недавних исследований, проведенныхING к идентификации ряда новых противовирусных препаратов против BTV.

Introduction

BTV является прототипом двухцепочечной РНК вируса в род Orbivirus, семейного Reoviridae. BTV является одним из наиболее важных заболеваний домашнего скота, в том числе овец, коз, крупного рогатого скота и других домашних животных, с потерей $ 3 млрд / год по всему миру 1,2. Экзотический BTV серотип является важным патогеном животных перечислены в "Министерство сельского хозяйства США повышенной животноводства патогенов." В последнее время вновь возникающие из BTV вызвало серьезную вспышку болезни у крупного рогатого скота и овец в ряде стран по всему Северной Европы 3,4. В результате его экономической значимости и в качестве модельной системы, BTV была предметом обширных молекулярных, генетических и структурных исследований, а также несколько вакцины были разработаны. Однако в связи с отсутствием надлежащих анализов для противовирусной лекарственных препаратов, нет противовирусных препаратов, доступных на BTV.

В недавнем скрининга высокой пропускной (HTS) кампании с использованием BTV как модельной системы, мы гeveloped, оптимизированы и проверены на CPE основе анализа для выявления потенциальных противовирусных препаратов широкого спектра действия против арбовирусы 5. CPE на основе анализа является хорошо известным анализ, который был использован в противовирусной лекарственных препаратов против ряда вирусов, индуцированного быстрое и наблюдаемый CPE / апоптоз 5-7. В нашей системе сообщение BTV инфекция, CPE проявляется в клетках позвоночных, в том числе HeLa, BSR, и НЕК 293Т 8. BTV-индуцированной CPE может контролироваться и количественно, используя различные методы обнаружения жизнеспособность клеток, в том числе жизнеспособность клеток Набор реагентов CellTiter Glo (КТГ комплекте) 9. Этот набор определяет количество жизнеспособных клеток в культуре на основе количественного клеточного АТФ представлены, который сигнализирует о наличии метаболически активных живых клеток. В оптимальных условиях, СРЕ основе анализа представленных здесь показала свою целесообразность с "смешивать и измерения" один шаг протокола, и гибкости с устойчивых сигналов люминесцентных. Между тем, токсичные соединения РедуCing жизнеспособность клеток будут исключены в этом CPE основе анализа. CPE основе Анализ показал свою устойчивость и надежность для противовирусной лекарственных препаратов против BTV, и был использован для скрининга NIH Молекулярные Библиотеки маленькая молекула Repository (MLSMR), что приводит к идентификации шести нового кластера потенциальной противовирусной ведущего компонента (ов ) 5.

Когда потенциальный противовирусное соединение было идентифицировано с помощью CPE основе анализа, он должен быть подвергнут десятилетнего концентрации доза-реакция анализа, чтобы определить диапазон противовирусной эффективности и цитотоксичность 2. Противовирусная эффективность, представлены как 50% ингибирующую концентрацию (IC 50) или 50% эффективной концентрации (ЕС50), концентрация лекарственного средства, которая ингибирует вирус-индуцированной CPE на полпути между базовой линией и максимума. Цитотоксичность противовирусных препаратов, то есть 50% концентрации цитотоксичности (CC 50), представляет собой концентрациюпрепарата, вызывающего 50% цитотоксичности между базовой и максимумом. Селективный показатель (SI), обозначается как 50% Si (SI 50) вычисляется из CC 50 / IC 50, которая определяет специфичность противовирусное против индуцированного вирусом CPE. IC 50 (или EC 50), CC 50 и SI 50 значения являются критическими меры, чтобы определить, является ли противовирусное соединение является мощным и селективным для дальнейшего развития наркотиков.

Когда противовирусный не показали явной токсичности в пробирке, но предотвратить вирус индуцированных CPE и продуктивной вирусной жизненного цикла, важно, чтобы характеризовать его МСХ 2. Мы инициировали такую ​​характеристику путем проведения Тоа анализа для определения возможного шаг (ы) вирусного жизненного цикла, которая зависит от противовирусного. Как правило, противовирусное соединение добавляют к клеткам в различные моменты времени предварительно или после вирусной инфекции. Если противовирусные были добавлены к инфицированных клеток прикреплять к своей цели сТЭФ в ходе инфекции, было бы привести к снижению активности по сравнению с той, которая была добавлена ​​перед стадией. Таким образом, ToA исследование является критическим для определения противовирусной эффективности соединения, и его потенциальную цель, либо на вирусного жизненного цикла или в хост-машин, участвующих в вирусной жизненного цикла.

Для всех трех анализах, жизнеспособность клеток определяли с использованием набора CTG следующие инструкции производителя 5. Это система обнаружения выводит адекватные сигналы люминесценции, которые могут быть проанализированы с помощью различного программного обеспечения в доме. Каждый анализ проверены и выполнены по крайней мере, в трех экземплярах с восемью копиями. Для всех полученных данных, три параметра, в том числе среднего значения (AVE), стандартное отклонение (отклонение), и коэффициент вариации (CV) были проанализированы, чтобы определить надежность анализа. После того, надежность анализа было определено, данные будут проанализированы и нанесены с использованием различных biostatics и графическигрн инструменты 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Клетки, Вирус и противовирусных соединений

  1. Поддержание BSR клеток, производное почки детеныша хомячка (ВНК) ячеек 10, в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM), содержащей 5% эмбриональной сыворотки теленка (FCS), 100U/ml пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина.
  2. Для всех трех анализов, пластины клеток в DMEM с 1% FCS, 100U/ml пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина, как ранее оптимизированный 5. Эту среду называют как среды для анализа всех трех анализов.
  3. Инкубируйте все клетки в инкубаторе при 37 ° С, 5% СО 2 и 80-95% влажности.
  4. Налет-очистить и распространяться тип 10 BTV (BTV-10), как описано ранее 8. Развести BTV-10 в среде для анализа для каждого указанного анализов.
  5. Растворить всех испытаний соединений в ДМСО с получением шток с концентрацией в 10 мМ. Храните запасы при температуре -20 ° С.
  6. Развести соединений в требуемой концентрации с использованием среды для анализа для назначенногод анализы 2.

2. CPE основе анализа Использование CTG Kit

  1. Семенной BSR клеток в микропланшете 384-а (черный; формате на 16 х 24) через MicroFlo выберите дозатора. Плотность посева составляет 5000 клеток / лунку, а объем посева составляет 20 мкл для противовирусной анализ эффективности.
  2. Инкубируйте клетки в течение 2-3 часов до клетки получают приверженцем тщательно пластины.
  3. Добавить антивирусное соединение с конечной концентрации 10 мкМ в каждую лунку. Смешайте его полностью.
  4. Развести BTV до желаемой титра и добавить 5 мкл BTV с обозначают как МВД в каждую лунку. Для контроля также, добавить 5 мкл среде для анализа. Инкубируйте инфицированные клетки в течение 72 ч при 37 ° С, 5% СО 2 и 80-95% влажности.
  5. На 72 HPI, оттепели и уравновешивают буфером CTG и лиофилизированную CTG подложку до комнатной температуры перед использованием. Развести гомогенного раствора реагента CTG путем смешивания лиофилизированного фермента / субстрат и буфер реагент в соответствии с гоИнструкции е изготовителя.
  6. Равновесие аналитические планшеты до комнатной температуры в течение 15 мин.
  7. Добавить равный объем (25 мкл) CTG реагентов в каждую лунку по дозатора. После инкубации в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте, измерения люминесценции сигналов с использованием читателю многорежимный со временем интегрирования 0,1 сек.

3. Анализ доза-ответ

  1. Семенной BSR клеток в 384-а микропланшет (черный; формате на 16 х 24) через дозатор, с плотностью посева 5000 клеток / лунку в объеме высева 20 мкл для противовирусной эффективности анализа и 25 мкл для анализа цитотоксичности, соответственно .
  2. Инкубируйте клетки в течение 2-3 ч при 37 ° С, 5% СО 2 и 80-95% влажности до клетки хорошо прикреплен к пластине.
  3. Процесс анализа в четверть площади 384-луночный планшет для каждого соединения (эквивалент 96-луночный планшет), как показано в таблице 1. Выделение восьми одинаковых образцов для каждой концентрациив одном анализе. Связать первый столбец в качестве положительного контроля без добавления соединения и вирус, и последний столбец (12-е) в качестве отрицательного контроля, добавив вирус только без соединений.
  4. Развести соединений до 50 мкм в среде для анализа и добавления в столбец 2-й на 20 мкл / лунку для противовирусной эффективности анализа. Смешать соединение пять раз с использованием 8-канальный полу-автоматической пипетки до концентрации 25 мкМ.
  5. Использование 8-канальный полуавтоматический пипетки 20 мкл смеси в 2 колонки-й в следующую колонку (3-й), хорошо перемешать, чтобы сформировать концентрации 12,5 мкМ. Повторите этот процесс путем передачи 20 мкл смеси из 3-м столбце в следующую колонку (4-й), чтобы сформировать другой разбавление двукратное с концентрацией 6,25 мкМ. Повторите эту двукратное серийное разведение до колонны 11-й. Аспирируйте и выбросить 20 мкл смеси в 11-й колонке после добавления и смешивания компкруглый.
  6. Добавить BTV-10, по MOI 0,01, в каждую лунку из колонки 2 к колонке 11 с объемом 5 мкл / лунку. После добавления вирус, конечная концентрация соединения в каждом столбце должны быть: 20 мкм в колонке 2, 10 мкМ в колонке 3, и продолжали с двукратным разбавлением вплоть до колонки 11 с конечной концентрацией 0,04 мкМ.
  7. Добавьте 5 мкл среды в колонну 1 как сотовый только контроля (положительного) и 5 ​​мкл / лунку BTV к колонке 12 в качестве BTV инфекции только управления (отрицательный).
  8. Развести соединений к начальной концентрации 200 мкМ для анализа цитотоксичности. Аналогично, добавить 25 мкл / лунку соединения в колонну 2 и смешанной с 5x 8-канальной полуавтоматической пипетки до концентрации 100 мкМ. Не добавляйте BTV.
  9. Провести разбавления серии двукратное путем аспирации 25 мкл из колонки 2 в соседнюю колонку 3, и продолжалось до последней колонке (12-й). В колонке 12 после смешивания аспирации и выбросить 25 мкл мixture. Конечная концентрация в колонке 2 должна быть 100 мкм и 12-й столбец должен быть на 0,2 мкм. В столбце 1 является единственным элементом управления клеток.
  10. Для обоих противовирусной эффективности и цитотоксичность, инкубировать пластин при 37 ° С, 5% СО 2 и 80-95% влажности в течение 72 ч после обработки. Измерение жизнеспособность клеток с использованием набора CTG, как описано выше (протокол шаги 2,5-2,7).

4. Время-дополнение (ToA) Пробирной

  1. Семя BSR клетки из колонки 1-24 в микропланшете 384-а (черный; формат на 16 х 24) с помощью дозатора на 5000 клеток / лунку и объема посева на 15 мкл / лунку.
  2. Для каждого соединения использовать все двадцать четыре колонки с восемью реплик для каждой временной точке в половине 384-луночный планшет (табл. 2). Столбец 1, как клетки только контроль Назначение путем добавления 10 мкл / лунку среды для анализа. Марк колонка 24, как BTV инфекции только управления (отрицательный контроль), добавив 5 мкл / лунку среды для анализа апВирус д 5 мкл / лунку в МВД 0,01 до конечного объема 25 мкл / лунку.
  3. Выберите четные столбцы из колонки 2-22, как противовирусное колонке оценка эффективности при различных часов после заражения (HPI). В этих столбцов инфицировать клетки с 5 мкл / лунку BTV при MOI 0,01. В другом HPI, добавить 5 мкл / лунку разведенного соединения в каждую лунку с получением конечного объема 25 мкл / лунку. Для обозначается -2 и -1 HPI добавить соединение к BSR клеток до BTV инфекции. При 0 HPI, добавьте соединение и BTV к культуре одновременно.
  4. Параллельно обозначают столбцах с нечетными номерами из колонки 3-23, как только контролирует соединение, из которых соединение добавляли при различных временных точках, обозначенных (-2, -1, 0, 1, 2, 4, 8, 16, 24, 48 HPI). В этих колонн, добавляют 5 мкл / лунку среды для анализа и 5 мкл / лунку разведенного соединения с образованием конечного объема 25 мкл / лунку.
  5. После лечения, инкубировать клетки при 37 ° С, 5% СО 2 с 80-95%-ной влажности.
  6. Определение жизнеспособности клеток при 72 HPI с использованием набора CellTiter-Glo как описано ранее (шаги протокол 2,5-2,7).

5. Анализ данных

  1. Процесс все данные сначала с помощью соответствующего программного обеспечения в доме на основе люминесцентных сигналов, полученных с помощью считывателя многомодового. Определить среднее значение (в среднем), стандартное отклонение (отклонение) для каждого лечения, а также вариации коэффициента (CV), который необходимо ввести значение не более 10%.
  2. Трансфер обработанные данные от выше программного обеспечения к биостатические и графического программного инструмента. Провести нелинейный регрессионный анализ, чтобы определить значения EC 50 и CC 50.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

1. Противовирусный механизм действия соединения

На основе клеток CPE был разработан анализ, оптимизированы и проверены в лабораторных помощью люминесцентного основе CTG комплект для идентификации новых противовирусных препаратов против BTV, как описано выше 2,5. Реакция анализ десять дозы был использован, чтобы отразить противовирусную эффективность и цитотоксичность идентифицированного соединения свинца путем измерения количества метаболически жизнеспособных клеток в культуре на основе количественного клеточного АТФ, представленной в живых клетках 5,11. В нашем предыдущем докладе, ряд потенциальных противовирусных соединений были оценены, в том числе соединений из каждого кластера, выявленных с помощью HTS против BTV 5, и их производные с помощью нового синтеза 2. На основе их EC 50, CC 50 и SI 50, некоторые перспективные соединения свинца были определены с мощной противовирусной эффективности, низкой токсичности и высокой селективностью. Например, compound052 (C052)был полон решимости иметь ЕС 50 0,27 ± 0,12 мкм (рис. 1) 2 и CC 50 из 82,69 мкм, оба показывая типичные регрессивные кривые под нелинейного регрессионного анализа 2. С.И. 50 C052 была определена в 306 на основе своих EC 50 и CC 50 значений. Наномоль масштаб противовирусная эффективность, низкая токсичность, и, следовательно, высокой С.И. 50 указал, что C052 может быть мощным и селективным противовирусное против BTV.

2. Потенциал МСХ для противовирусного соединения

Тоа анализ был направлен для определения возможного этап (ы) вирусного жизненного цикла целевой соединениями. При добавлении C052 на 1 или 2 часа до заражения BTV, т.е. -1 и -2 HPI, противовирусные полезного действия осталась на наномолярной шкале (рис. 2) 2, что указывает на C052 может действовать за пределами ранней стадии вирусной жизненного цикла, такие как запись вируса. Furthermore, противовирусная эффективность оставалась неизменной до C052 не был добавлен в инфицированных клетках, как позже 24 HPI. При добавлении в 32 HPI, процент жизнеспособных клеток уменьшается в клетках лечения C052, C052, указывающий, что было меньше, защитный на этой стадии вирусной жизненного цикла. При добавлении в 48 HPI, не было никакой защиты в РБМ клеток от BTV-индуцированной CPE. С первого цикла BTV репликации вируса, как правило, завершена в инфицированных клетках в течение 24 HPI, наши результаты показали, что C052 может действовать на поздних стадиях BTV вирусной жизненного цикла, таких как вирус репликации, упаковки, созревания и выхода. Между тем, также возможно, что C052 может действовать на хост-клеточных механизмов, которые были вовлечены в течение конца вирусного жизненного цикла 2.

Таблица 1
Таблица 1. Макет пластина для доза-реакция анализа. Противовирусное эффективность C052 был оценитьд в масштабе 96-луночного внутри пластины 384-луночный. Каждая процедура, в том числе BTV инфекции плюс различных концентрациях C052, использовались восемь реплик. На 72 HPI, жизнеспособность клеток определяли с использованием набора CTG.

Таблица 2
Таблица. 2 Схема пластина для Время-дополнение (ToA) анализа. Тоа анализ из C052 оценивали в 384-луночный планшет, как указано в макете. Каждая процедура, в том числе BTV инфекции плюс время добавления C052, была проведена с восемью копиями. В -2 и -1 HPI показывают, что C052 был добавлен к клеткам перед BTV инфекции. При 0 HPI, BTV и C052 были добавлены одновременно. В 72 HPI, жизнеспособность клеток определяли с использованием набора CTG. Нажмите здесь, чтобы посмотреть таблицу .


Рисунок 1. Противовирусная эффективность C052. Клетки инфицировали BTV в МВД 0,01 в присутствии десяти различных концентраций C052, как показано на рисунке. Жизнеспособность клеток определяли при 72 HPI, с использованием набора CTG. Каждая точка данных представляет средства и SD из пяти повторов. Эта цифра была изменена с Гу и соавт. 2012 2.

Рисунок 2
Рисунок 2. Время-дополнение тест для C052. C052 на 2,5 мм и 0,27 мм соответственно, был добавлен в BTV инфицированных клеток при различных HPI, как указано, а также защита C052 против BTV индуцированной CPE, или жизнеспособности клеток, измеряли с помощью КТГ комплект на 72 HPI Each точек данных представлены среднее значениес и SD от восьми независимых повторах. Эта цифра была изменена с Гу и др.. 2012 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Для первоначальной идентификации противовирусных хитов, одним из ключевых шагов для противовирусной открытия и разработки лекарственных является разработка надежных анализов, которые включает в себя выбор количественные маркер, разработки простой протокол, получения достаточных сигналы и менее 10% резюме. Большинство биохимических или на основе ячеек экраны предназначены для обеспечения химической отправную точку, основанную на самой надежной, простой и недорогой анализа, в связи с необходимой воспроизводимости в процессе скрининга и потенциально большого числа молекул, которые будут экранированных. CPE основе анализа был определен с учетом этих требований для определения эффективных хиты из большого составного библиотеки. CPE относится к вредного воздействия на культуре клеток, связанных с размножение вирусов. Различные анализы доступны использовать индикатор CPE путем измерения различные маркеры, указывающие на количество мертвых клеток (цитотоксичности), количество живых клеток (жизнеспособность), а механизмгибели клеток (апоптоз). Коммерческие реагенты для CPE основе анализа доступны с простым протоколом анализа. Например, в комплект КТГ включает сингл "смешивать и измерения" шаг и широко используется для количественного вируса индуцированных CPE. Тем не менее, CPE основе анализа ограничивается вирусов, которые могут вести к возникновению быстрого CPE. Для вирусов, которые не вызывают быстрое CPE, различные анализы были разработаны. Например, репликон на основе анализа с помощью репликона-клеточной линии, несущие позволяет скрининга на ингибиторы репликации вируса, в том числе перевода, обработки полипротеина, и минус-и плюс-цепи РНК синтеза 12-14. Стратегии РНК антисмысловые и виртуальный скрининг низкомолекулярных библиотек также могут быть использованы для выявления возможных противовирусных препаратов 15,16. Тем не менее, очень важно, что эффективность противовирусного препарата быть подтверждено в клеточной основе анализа в пробирке, который позволяет оценить противовирусной эффективности против всего вирусного жизненного цикла. CPE основеАнализ был успешно адаптирован в формате высокой пропускной и является одним из самых надежных и надежных тест для скрининга больших библиотек соединений, в том числе недавно совершенных ВТСП показы против вируса гриппа 6,17, тяжелый острый респираторный синдром коронавируса (SARS-коронавирус) 18 , аренавирусов 19, и реовирус (вирус катаральной) 5.

Анализ доза-реакция была обозначена для дальнейшей проверки противовирусную эффективность хитов выявленных с помощью однократной дозы CPE основе анализа, как правило, после скрининга большого библиотеки соединений. Эти хиты, хотя отождествлять с противовирусной активностью, необходимо дальнейшее подтверждение раскрыть свои потенциалы, чтобы стать наркотиков. Противовирусный механизм действия соединения может быть раскрыта путем анализа с помощью EC 50, CC 50 и С. И. 50 значения, используя анализ реакции от дозы. Между тем, из офф-мишени или ложных срабатываний будут определены, а количество свинца компounds может быть сужен. С помощью этого анализа, порядок составных потенций и токсичности могут быть ранжированы направить будущую открытие противовирусный препарат, особенно для соотношение структура-активность (SAR) анализа и будущего модификации медицинской химии. На самом деле, соединение C052 был производным от составного C003, который, связанного с хорошими свойствами наркотиков, как в пробирке и в естественных условиях.

Для удовлетворения требованиям, предъявляемым к препарату, он является обязательным, чтобы определить его МСХ, т.е. характеризовать взаимодействие соединения с своей цели при физиологических концентрациях. Различные анализы были разработаны конкретных противовирусных препаратов, то есть не только подавляют цель, но, чтобы иметь приемлемый растворимость, проницаемость, связывания с белками, селективности, метаболизм и токсичность профилей. Так как исследования МСХ были низкими пропускной анализ необходимости трудоемких усилий, лишь несколько отобранных молекул, с мощным EC 50, высокой CC 50 и ч.кайф С.И. 50 значение, может быть легко проанализированы. Понимания МСХ соединения на данном этапе может добавить глубины интерпретации клеточной активности или ее отсутствие. Исследование ToA обозначается сузить тот этап, когда противовирусный взаимодействует с вирусной или принимающих целей. Зная соединение является конкурентоспособной с подложкой в ​​определенном этапе вирусного жизненного цикла может обеспечить немедленное направление для дальнейшего анализа МСХ. Кроме того, более мощным клеток на основе анализа с известными механизма, в том числе анализа непосредственно на экране для ВИЧ-1 ингибиторов интегразы 20, ингибирования вируса привязки к поверхности белка 21 могут быть использованы которые обеспечивают известный МСХ до реальных показов 22. В то время как хиты от этих скрининга может хорошо связан с назначенным МСХ, там на самом деле МСХ также может потребоваться подвергать Тоа и другой механизм исследований действий.

Таким образом, с помощью трех анализов сообщили здесь, мы успешно проверены и определенынесколько мощных противовирусных препаратов против BTV, в том числе C003 и C052 2. В частности, SI 50 (C052 был выше на 306, который предположил, что C052 обладает высокой селективностью в отношении BTV. Через TOA и других исследований МСХ, представленных в оригинальной работе, мы предположили, что C052 может быть потенциальным противовирусное средство взаимодействия с хостом аутофагия машины, могут быть разработаны в средство против BTV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Acknowledgments

Этот проект был поддержан грантом 1R03MH08127-01 и 7R03MH08127-02 от NIH к Q. Ли, и в результате воздействия средств из Отдела Медицины на UAB, чтобы Q. Ли. Поддержка со стороны Molette фонда и Auburn University ценится. Мы также благодарим технические помощь за г-жой Пулин Че и г-н Владимир Musiienko в ходе работы.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM medium Gibco 1134218 For cell culture
FBS Gibco 16000044 For cell culture
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 1000185 For cell culture
DPBS Gbico 1049769 For cell culture
CellTiter-Glo (CTG) kit Promega TB288 For cell viability measurement
70% ethanol Fisher S25309B Diluted from 95%
Antiviral huashilcompounds NIH MLSMR and de novo synthesis
BTV-10 ATCC VR-187
BSR cell Developed in house
Synergy-II multi-mode microplate reader BioTek For luminescent signal reading
MicroFlo select dispenser BioTek Adding cells, virus, and reagents
384-well flat-bottom microplate CORNING 28908031 For cell culture
Gen. 5 software BioTek For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader
GraphPad Prism 5 GraphPad Version 5 For biostatic analysis and plot

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hemati, B., et al. Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph. J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).
  2. Gu, L., et al. Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus. PLoS ONE. 7, e43341 (2012).
  3. Meiswinkel, R., et al. The 2006 outbreak of bluetongue in northern Europe--the entomological perspective. Prev. Vet. Med. 87, 55-63 (2008).
  4. Szmaragd, C., et al. Mortality and case fatality during the recurrence of BTV-8 in northern Europe in 2007. Vet. Rec. 161, 571-572 (2007).
  5. Li, Q., Maddox, C., Rasmussen, L., Hobrath, J. V., White, L. E. Assay development and high throughput antiviral drug screening against Bluetongue virus. Antiviral Research. 83, 267-273 (2009).
  6. Noah, J. W., et al. A cell-based luminescence assay is effective for high-throughput screening of potential influenza antivirals. Antiviral Res. 73, 50-59 (2007).
  7. Che, P., Wang, L., Li, Q. The development, optimization and validation of an assay for high throughput antiviral drug screening against Dengue virus. Int. J. Clin. Exp. Med. 2, 363-373 (2009).
  8. Li, Q., Li, H., Blitvich, B. J., Zhang, J. The Aedes albopictus inhibitor of apoptosis 1 gene protects vertebrate cells from bluetongue virus-induced apoptosis. Insect Mol. Biol. 16, 93-105 (2007).
  9. Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell number. J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).
  10. Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J. Virol. 73, 251-259 (1999).
  11. Phillips, T., Jenkinson, L., McCrae, C., Thong, B., Unitt, J. Development of a high-throughput human rhinovirus infectivity cell-based assay for identifying antiviral compounds. J. Virol. Methods. 173, 182-188 (2011).
  12. Harvey, T. J., et al. Tetracycline-inducible packaging cell line for production of flavivirus replicon particles. J. Virol. 78, 531-538 (2004).
  13. Puig-Basagoiti, F., et al. High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 4980-4988 (2005).
  14. Puig-Basagoiti, F., et al. Triaryl pyrazoline compound inhibits flavivirus RNA replication. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 1320-1329 (2006).
  15. Duan, M., et al. In vitro and in vivo protection against the highly pathogenic H5N1 influenza virus by an antisense phosphorothioate oligonucleotide. Antivir. Ther. 13, 109-114 (2008).
  16. Ray, D., Shi, P. Y. Recent advances in flavivirus antiviral drug discovery and vaccine development. Recent Pat. Antiinfect. Drug Discov. 1, 45-55 (2006).
  17. Severson, W. E., et al. High-throughput screening of a 100,000-compound library for inhibitors of influenza A virus (H3N2). J. Biomol. Screen. 13, 879-887 (2008).
  18. Severson, W. E., et al. Development and validation of a high-throughput screen for inhibitors of SARS CoV and its application in screening of a 100,000-compound library. J. Biomol. Screen. 12, 33-40 (2007).
  19. Bolken, T. C., et al. Identification and characterization of potent small molecule inhibitor of hemorrhagic fever New World arenaviruses. Antivir. Res. 69, 86-97 (2006).
  20. Van Loock, M., et al. A novel high-throughput cellular screening assay for the discovery of HIV-1 integrase inhibitors. J. Virol. Methods. 179, 396-401 (2012).
  21. Kampmann, T., et al. In silico screening of small molecule libraries using the dengue virus envelope E protein has identified compounds with antiviral activity against multiple flaviviruses. Antiviral Res. 84, 234-241 (2009).
  22. Kirchmair, J., et al. Development of anti-viral agents using molecular modeling and virtual screening techniques. Infect. Disord. Drug Targets. 11, 64-93 (2011).

Tags

Иммунология выпуск 80 Drug Discovery наркотиками по оценке Доклинические оценки Исследования как тема с наркотиками по оценке технико-экономических обоснований биологического анализа Технологии фармацевтической высокопроизводительного скрининга Анализы болезни животных методы расследования противовирусные Эффективность катаральной Вирус Цитопатический эффект доза ответ время-дополнение механизм-из-Действие
Анализы для идентификации новых видов Antivirals против вируса катаральной лихорадки овец
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gu, L., Schneller, S. W., Li, Q.… More

Gu, L., Schneller, S. W., Li, Q. Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus. J. Vis. Exp. (80), e50820, doi:10.3791/50820 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter