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Immunology and Infection

इन विट्रो रोगजनक प्रेरित न्यूट्रोफिल ट्रांस-एपिथेलियल माइग्रेशन का आकलन करने के लिए कोकल्चर परख

Published: January 6, 2014 doi: 10.3791/50823
Automatic Translation
1,2,3, 1,3, 3, 1,3
1Department of Pediatrics, Harvard Medical School, 2Department of Pediatric Gastroenterology, MGH for Children, 3Mucosal Immunology and Biology Research Center, Massachusetts General Hospital

Summary

म्यूकोसल बैक्टीरियल संक्रमण के जवाब में न्यूट्रोफिल ट्रांस-एपिथेलियल माइग्रेशन एपिथेलियल चोट और नैदानिक रोग में योगदान देता है। एक इन विट्रो मॉडल विकसित किया गया है जो इस घटना को आर्केस्ट्रा करने वाले आणविक तंत्र को सुलझाने की दिशा में जांच को सुविधाजनक बनाने के लिए ट्रांसवेल फिल्टर पर उगाए गए रोगजनक, मानव न्यूट्रोफिल, और ध्रुवीकृत मानव एपिथेलियल सेल परतों को जोड़ती है।

Abstract

म्यूकोसल सतहें रोगजनक जीवों के खिलाफ सुरक्षात्मक बाधाओं के रूप में काम करती हैं। जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं रोगजनक को संवेदन पर सक्रिय करती हैं जिससे भड़काऊ कोशिकाओं, मुख्य रूप से न्यूट्रोफिल को माइग्रेट करने के साथ ऊतकों की घुसपैठ होती है। इस प्रक्रिया में ऊतकों के लिए विनाशकारी होने की क्षमता है यदि अत्यधिक या एक अनसुलझे राज्य में आयोजित किया जाता है।  रोगजनक प्रेरित न्यूट्रोफिल ट्रांस-एपिथेलियल माइग्रेशन में शामिल अद्वितीय आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए कॉकल्चर्ड इन विट्रो मॉडल का उपयोग किया जा सकता है। इस प्रकार का मॉडल रोगजनक, एपिथेलियल बैरियर या न्यूट्रोफिल के नियंत्रित हेरफेर के अवसर के साथ प्रयोगात्मक डिजाइन में बहुमुखी प्रतिभा प्रदान करता है। पारमीय ट्रांसवेल फिल्टर पर उगाए जाने वाले ध्रुवीकृत एपिथेलियल मोनोलेयर की एपिकल सतह का रोगजनक संक्रमण बेसोलेटरल सतह पर लागू न्यूट्रोफिल के एपिकल ट्रांस-एपिथेलियल माइग्रेशन के लिए शारीरिक रूप से प्रासंगिक बेसोलिटरल को भड़काता है। इन विट्रो मॉडल यहां वर्णित एक ध्रुवीकृत फेफड़ों एपिथेलियल मोनोलेयर में न्यूट्रोफिल माइग्रेशन का प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक कई चरणों को दर्शाता है जो रोगजनक पी एरुगिनोसा (PAO1) से संक्रमित है। मानव व्युत्पन्न फेफड़ों के एपिथेलियल कोशिकाओं के साथ पारगम्य ट्रांसवेल की सीडिंग और खेती का वर्णन किया गया है, साथ ही पूरे मानव रक्त से न्यूट्रोफिल के अलगाव और PAO1 और गैरपैथोजेनिक K12 ई. कोलाई (MC1000) की खेती के साथ।  उत्प्रवास प्रक्रिया और रोगजनक संक्रमण के प्रत्युत्तर में जुटाए गए सफलतापूर्वक माइग्रेट न्यूट्रोफिल का मात्रात्मक विश्लेषण सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रणों सहित प्रतिनिधि डेटा के साथ दिखाया गया है। इस इन विट्रो मॉडल सिस्टम को हेरफेर किया जा सकता है और अन्य म्यूकोसल सतहों पर लागू किया जा सकता है। अत्यधिक न्यूट्रोफिल घुसपैठ शामिल भड़काऊ प्रतिक्रियाएं ऊतकों की मेजबानी के लिए विनाशकारी हो सकती हैं और रोगजनक संक्रमणों के अभाव में हो सकती हैं। आणविक तंत्र की एक बेहतर समझ है कि इन विट्रो coculture परख प्रणाली के प्रयोगात्मक हेरफेर के माध्यम से न्यूट्रोफिल ट्रांस-एपिथेलियल माइग्रेशन को बढ़ावा देने के लिए यहां वर्णित म्यूकोसल संक्रामक के साथ-साथ भड़काऊ रोगों की एक श्रृंखला के लिए उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने की महत्वपूर्ण क्षमता है ।

Introduction

म्यूकोसल सतहें पर्यावरण में व्यापक बाहरी खतरों से सुरक्षा प्रदान करने वाली भौतिक और प्रतिरक्षा बाधाओं के रूप में काम करती हैं1,2. रोगजनक जीवों केआक्रमणकरने पर इस सुरक्षात्मक एपिथेलियल बैरियर से समझौता किया जा सकता है . एक जीवाणु रोगजनक के मामले में, यह मुठभेड़ अक्सर जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली को सक्रिय करके और न्यूट्रोफिल2-4के रूप में जाने वाले पहले उत्तरदाता ग्रैनुलोसाइट्स के तेजी से जुड़ाव को ट्रिगर करके एक भड़काऊ प्रक्रिया को भड़काती है। न्यूट्रोफिल भर्ती की सुविधा देने वाले केमोटैक्टिक एजेंटों का उत्पादन म्यूकोसल एपिथेलियल कोशिकाओं द्वारा किया जाता है जो अपमानजनक रोगजनक2-4की मेजबानी से छुटकारा पाने की मांग करते हैं। म्यूकोसल एपिथेलियल सतह की अत्यधिक या अनसुलझी न्यूट्रोफिल घुसपैठ महत्वपूर्ण विकृति का कारण बन सकती है1,5. यह एंटी बैक्टीरियल न्यूट्रोफिल आर्सेनल5-7के कारण गैर-विशिष्ट ऊतक क्षति का परिणाम है। ऐसे मामलों में, न्यूट्रोफिल की बैक्टीरियल क्लीयरेंस क्षमता संक्रामक अपमान के दौरान मेजबान ऊतक के विनाश से दब जाती है।  सुरक्षात्मक एपिथेलियल बैरियर फ़ंक्शन के व्यवधान से सूक्ष्मजीवों और/या विषाक्त पदार्थों के अंतर्निहित ऊतकों का संपर्क बढ़ सकता है, और रोग विकृति8,9को बढ़ा सकता है। ये परिणाम फेफड़ों और पाचन तंत्र सहित कई अंग प्रणालियों में देखे जा सकते हैं1,5. इसके अलावा, अस्थमा के गंभीर मुकाबलों, क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज (सीओपीडी), तीव्र श्वसन संकट सिंड्रोम (एआरडीएस), और भड़काऊ आंत्र रोग (आईबीडी) जैसी गैर-संक्रामक भड़काऊ स्थितियों को अत्यधिक न्यूट्रोफिलिक प्रतिक्रिया4,5,10-12द्वारा म्यूकोसल एपिथेलियल बैरियर के रोग उल्लंघन द्वारा चिह्नित किया जाता है।

म्यूकोसल संक्रमण के बाद न्यूट्रोफिल भर्ती की जटिल प्रक्रिया में कई विभाजित कदम शामिल हैं1,5,13,14. सबसे पहले, न्यूट्रोफिल को सेल-टू-सेल इंटरैक्शन की एक श्रृंखला के माध्यम से परिसंचरण से रवाना होना चाहिए जो ट्रांस-एंडोथेलियल माइग्रेशन1,13की सुविधा प्रदान करता है। न्यूट्रोफिल अगले एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स1,14युक्त मौजूदा इंटरस्टिशियल स्पेस को नेविगेट करते हैं। संक्रमित म्यूकोसा के ल्यूमेन तक पहुंचने के लिए, न्यूट्रोफिल को फिर एपिथेलियल बैरियर1,4,5में स्थानांतरित करना होगा। इस जटिल मल्टीस्टेप घटना की जांच अक्सर संक्रमणके वीवो पशु मॉडल में कुल मिलाकर की जाती है । इस तरह के मॉडल विशिष्ट कारकों की आवश्यकता स्थापित करने के लिए उपयोगी होते हैं, जैसे कि केमोकिंस, आसंजन अणु, या सिग्नलिंग रास्ते जो समग्र प्रक्रिया में भाग लेते हैं, लेकिन प्रत्येक अलग-अलग विभाजित चरण16के लिए महत्वपूर्ण आणविक योगदान को हल करने के लिए काफी हद तक अपर्याप्त हैं। कोकल्चर्ड इन विट्रो सिस्टम मॉडलिंग ट्रांस-एंडोथेलियल, ट्रांस-मैट्रिक्स, या न्यूट्रोफिल के ट्रांस-एपिथेलियल माइग्रेशन इस संबंध में विशेष रूप से उपयोगी रहे हैं1,14,16,17।

रोगजनक संक्रमण18-22के जवाब में न्यूट्रोफिल ट्रांस-एपिथेलियल माइग्रेशन के लिए जिम्मेदार तंत्र को समझने के उद्देश्य से एक मजबूत सहसंस्कृति परख प्रणाली विकसित की गई है। इस मॉडल में ध्रुवीकृत मानव एपिथेलियल सेल परतों की एपिकल सतह को जीवाणु रोगजनक के साथ संक्रमित करना शामिल है जिसके बाद18-22के बेसोलाटरल सतह पर ताजा अलग मानव न्यूट्रोफिल का उपयोग किया जाता है। न्यूट्रोफिल रोगजनक संक्रमण18,21-23के बाद गुप्त एपिथेलियल-व्युत्पन्न रसायनीय उत्पादों के जवाब में एपिथेलियल बैरियर के पार प्रवास करते हैं। इस मॉडल प्रणाली को उचित ऊतक विशिष्ट जीवाणु रोगजनकों के संपर्क में आंतों और फेफड़ों की एपिथेलियल संस्कृतियों का उपयोग करके नियोजित किया गया है और म्यूकोसल संक्रमण3,8,19,24-28के दौरान न्यूट्रोफिल भर्ती प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण उपन्यास आणविक तंत्र का अनावरण किया गया है। इस इन विट्रो कॉकल्चर मॉडल की ताकत यह है कि एक न्यूनीकरणवादी दृष्टिकोण अन्वेषक को प्रायोगिक रूप से रोगजनक, एपिथेलियल बैरियर, और/या न्यूट्रोफिल को एक अच्छी तरह से नियंत्रित, अत्यधिक प्रजनन योग्य, काफी सस्ती प्रणाली में हेरफेर करने में सक्षम बनाता है । इस दृष्टिकोण से एकत्र की गई अंतर्दृष्टि को वीवो संक्रमण मॉडल22,29,30में उपयोग करके न्यूट्रोफिल भर्ती के दौरान विभाजित घटनाओं का केंद्रित विश्लेषण करने के लिए प्रभावी ढंग से लाभ उठाया जा सकता है।

यह लेख रोगजनक प्रेरित न्यूट्रोफिल ट्रांस-एपिथेलियल माइग्रेशन का पता लगाने के लिए इस प्रजनन मॉडल की सफल स्थापना के लिए आवश्यक कई कदमों को दर्शाता है। इस लेख में रोगजनक स्यूडोमोनास एरुगिनोसा से संक्रमित फेफड़ों के एपिथेलियल बाधाओं को चित्रित किया गया है; हालांकि, अन्य ऊतक एपिथेलिया और रोगजनकों को मामूली संशोधनों के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है। उल्टे कोलेजन लेपित पारगम्य ट्रांसवेल फिल्टर पर ध्रुवीकृत फेफड़ों एपिथेलियल सेल परतों की सीडिंग और संस्कृति यहां विस्तृत है, जैसा कि रोगजनक पी एरुगिनोसा का विकास और पूरे रक्त से न्यूट्रोफिल का अलगाव है। कैसे इन घटकों को रोगजनक प्रेरित न्यूट्रोफिल ट्रांस-एपिथेलियल माइग्रेशन का निरीक्षण करने के लिए संयुक्त किया जाता है, एक प्रजनन योग्य परख स्थापित करने के लिए उचित सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के साथ प्रस्तुत किया जाता है। रोगजनक प्रेरित न्यूट्रोफिल ट्रांस-एपिथेलियल माइग्रेशन के विभिन्न पहलुओं की जांच करने के लिए इस दृष्टिकोण की बहुमुखी प्रतिभा पर साहित्य में विशिष्ट अध्ययनों के संदर्भ में चर्चा की गई है।

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Protocol

कदम (1-3) एक लैमिनार प्रवाह हुड के तहत एक बाँझ वातावरण में किया जाना चाहिए।

1. कोलेजन कोटिंग ट्रांसवेल्स

  1. 30 माइक्रोन/एमएल कोलेजन का घोल बनाएं। तनु 3 मिलीग्राम/मिलीलीटर कोलेजन स्टॉक 1:100 में 60% इथेनॉल जो 0.2 माइक्रोन फिल्टर यूनिट के माध्यम से पारित किया गया है।
  2. भंवर पतला 30 μg/ml समाधान । नोट: 3 मिलीग्राम/मिलीग्राम कोलेजन स्टॉक समाधान को भंवर करना आवश्यक नहीं है, क्योंकि यह समाधान काफी चिपचिपा है और हवा के बुलबुले पेश किए जा सकते हैं, संभावित रूप से पिपटिंग करते समय सटीकता कम हो सकती है।
  3. बाहर पैकेजिंग से3 माइक्रोन के पोर आकार के साथ 0.33 सेमी 2 विकास क्षेत्र ट्रांसवेल निकालें और हुड के अंदर उल्टा 12 ट्रांसवेल युक्त 24-अच्छी तरह से प्लेट रखें।
  4. नीचे की प्लेट को उठाएं और एक तरफ रखें। नोट: ट्रांसवेल्स अब उल्टा होगा 24 अच्छी तरह से थाली के ढक्कन के ऊपर आराम
  5. बुनसेन बर्नर चालू करें। बाँझ के लिए लौ हीमोस्टेट और शांत करते हैं।
  6. बाँझ हीमोस्टेट के साथ, ट्रांसवेल को 150 मिमी x 25 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें, उन्हें उल्टे स्थिति में रखते हुए। नोट: खाली 24-अच्छी तरह से प्लेट प्लस ढक्कन की बंध्याकरण बनाए रखने के लिए सुनिश्चित करें कि एक बार वे एपिथेलियल कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त किया गया है ट्रांसवेल घर के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।
  7. प्रत्येक उल्टे ट्रांसवेल की फिल्टर झिल्ली पर 30 माइक्रोन/एमएल कोलेजन समाधान के पिपेट 70 माइक्रोन। नोट: सतह तनाव जगह में समाधान की इस मात्रा पकड़ चाहिए के रूप में वहां फिल्टर झिल्ली के आसपास कोई दीवारों जब नीचे की सतह तक पहुंचने रहे हैं । सावधान रहें कि कोलेजन समाधान ट्रांसवेल के किनारे को ड्रिप नहीं करता है और कोटिंग प्रक्रिया के दौरान ट्रांसवेल ले जाने से बचता है।
  8. इथेनॉल समाधान को वाष्पित करने की अनुमति देने के लिए पेट्री डिश के ढक्कन को न्यूनतम 4 घंटे के लिए छोड़ दें। इस प्रक्रिया के दौरान बंध्यता बनाए रखने के लिए हुड फैन और पराबैंगनी प्रकाश को चालू रखें।
  9. ट्रांसवेल सूख जाने के बाद, उन्हें तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है या एक सप्ताह तक कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है बशर्ते पेट्री डिश कवर जगह में हो और बंध्यता बनाए रखी जाए।

2. सीडिंग ट्रांसवेल के लिए एपिथेलियल कोशिकाओं का मार्ग फ्लास्क

(यह प्रोटोकॉल विशेष रूप से ट्रांसवेल पर उगाए जाने वाले एपिथेलियल बाधाओं की पीढ़ी के लिए फेफड़ों के एपिथेलियल सेल लाइन एच 2 9 2 की हैंडलिंग का वर्णन करता है। अन्य एपिथेलियल सेल लाइनों का उपयोग मामूली संशोधनों के साथ किया जा सकता है।

  1. आरपीएमआई 1640 में 10% हीट-इनएक्टिवेटेड भ्रूण गोजातीय सीरम (एचआई-एफबीएस) और 1x पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन जोड़कर संस्कृति माध्यम तैयार करें।
  2. गर्म मीडिया, ट्रिप्पसिन-EDTA (टी-EDTA), और डी-पीबीएस में ३७ ºC पानी स्नान ।
  3. इनक्यूबेटर से कोशिकाओं युक्त टी-75 फ्लास्क निकालें और उल्टे माइक्रोस्कोप के साथ नेत्रहीन संगम का आकलन करें। नोट: H292 कोशिकाओं का उपयोग करते समय, फ्लास्क के करीब या पूरी तरह से ढुलमुल होना चाहिए।
  4. फ्लास्क से मीडिया को एस्पिरेट करें । समय की लंबाई को कम करें कि कोशिकाएं कैप के साथ हुड में अगला समाधान करके सूखी हैं।
  5. टी-75 फ्लास्क और भंवर में 5 एमएल डी-पीबीएस जोड़ें। बुलबुले बनाने से बचें। आकांक्षा द्वारा पीबीएस निकालें।
  6. टी-75 फ्लास्क में 3 एमएल टी-एड्टा जोड़ें और नीचे कवर करने के लिए भंवर।
  7. टी-EDTA के अधिकांश निकालें, टी-75 फ्लास्क में लगभग 0.3 मिलीलीटर छोड़ दें।
  8. कोशिकाओं की सतह क्षेत्र पर टी-ईडीटीए की छोटी शेष मात्रा वितरित करें और मानक संस्कृति स्थितियों (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)के तहत एक आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में रखें।
  9. कुछ समय बाद, इनक्यूबेटर से फ्लास्क निकालें। नोट: कोशिकाओं को धीरे से अपनी तरफ फ्लास्क दोहन द्वारा फ्लास्क की सतह से आसानी से अलग करना चाहिए । कोशिकाओं को अब गोल और फ्लोटिंग होना चाहिए जब माइक्रोस्कोप के नीचे कल्पना की जानी चाहिए। औसत समय यह H292 कोशिकाओं के लिए ले जाएगा 5-10 मिनट है ।
  10. टी-EDTA और resuspend कोशिकाओं को बेअसर करने के लिए फ्लास्क करने के लिए 10 मिलीलीटर संस्कृति मीडिया जोड़ें। सेल समाधान को पिपेट टिप में खींचें और सभी कोशिकाओं को पुनर्सुकृत करने के लिए लगभग पांच बार कोशिकाओं वाले फ्लास्क की सतह पर बाहर निकालें।
  11. सीडिंग ट्रांसवेल के लिए 15 एमएल ट्यूब में पुनर्नं निलंबित कोशिकाओं को स्थानांतरित करें। नोट: इस तरीके से तैयार पुनर् निलंबित H292 कोशिकाओं की एकाग्रता लगभग 1 x 10 6-1.8 x 106 कोशिकाओं/मिलीलीटर के बीच होनी चाहिए ।

3. एपिथेलियल कोशिकाओं के साथ सीडिंग कोलेजन कोटेड ट्रांसवेल

  1. प्रत्येक उल्टे कोलेजन कोटेड ट्रांसवेल में 15 मिलीलीटर ट्यूब से पुनर् निलंबित सेल समाधान का 70 माइक्रोन जोड़ें। नोट: H292 सेल समाधान 1 x 106-1.8 x 106 कोशिकाओं/मिलीलीटर के बीच एकाग्रता सीमा के साथ लगभग 70,000-120,000 कोशिकाओं/ट्रांसवेल निकलेगा ।
  2. ट्रांसवेल को सीडिंग करते समय कोशिकाओं को 15 मिलीलीटर ट्यूब के नीचे बसने से रोकने के लिए समय-समय पर धीरे-धीरे ट्यूब को उलटा करके कोशिका निलंबन मिलाएं। नोट: भंवर कोशिकाओं को न करें और सतर्क रहें कि पिपेट टिप कोलेजन कोटेड झिल्ली फिल्टर के सीधे संपर्क में न आए।
  3. एक बार सभी उल्टे ट्रांसवेल को एपिथेलियल कोशिकाओं के साथ वरीयता दी गई है, पेट्री डिश कवर को प्रतिस्थापित करें और सावधानी से ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर, आर्द्रीकृत, 37 ºC, 5% सीओ2में रखें। कोलेजन कोटेड फिल्टर झिल्ली में जोड़े गए सेल निलंबन को परेशान करने से बचने के लिए ध्यान रखें।
  4. ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर, आर्द्रीकृत, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 रातोंरात में उल्टे ट्रांसवेल बनाए रखें। नोट: तरल युक्त कोशिकाओं का बुलबुला रात भर इनक्यूबेशन में ट्रांसवेल की पारमीय फिल्टर झिल्ली से जुड़ा रहना चाहिए। यदि तरल वाष्पीकरण के कारण फिल्टर झिल्ली सूखी हो जाती है या क्योंकि तरल ट्रांसवेल के किनारे नीचे टपकता है, तो एपिथेलियल परतें ठीक से नहीं बढ़ सकती हैं।
  5. अगले दिन, मूल बाँझ 24-अच्छी तरह से प्लेट में 1 मिलीलीटर मीडिया जोड़ें और प्रत्येक उलटा ट्रांसवेल को प्रत्येक कुएं में एक निष्फल हेमोस्टेट का उपयोग करके फ्लिप करें जिसमें 1 मिलीलीटर मीडिया होता है।
  6. प्रत्येक ट्रांसवेल के शीर्ष कक्ष में 0.2 मिलीलीटर मीडिया जोड़ें और ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर, आर्द्रीकृत, 37   डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 परलौटें।
  7. सीडिंग के बाद 8 दिनों से 1 महीने तक H292 उल्टे ट्रांसवेल का उपयोग किया जा सकता है। नोट: हम यह सुनिश्चित करने के लिए ट्रांसवेल के कम से कम 8 दिनों के बाद की प्रतीक्षा करने का सुझाव देते हैं कि एपिथेलियल मोनोलेयर पूरी तरह से बन चुके हैं और एक कार्यात्मक बाधा प्रदर्शित करते हैं। कोई भी यह निर्धारित करके H292 एपिथेलियल बैरियर का परीक्षण कर सकता है कि क्या मोनोलेयर बेसोटेरल सतह18के अलावा प्रोटीन हॉर्स मूली पेरोक्सिडेस (एचआरपी) के ट्रांस-एपिथेलियल फ्लक्स को प्रतिबंधित करने में सक्षम है या नहीं।

4. ट्रांसवेल पर एपिथेलियल परतों के संक्रमण के लिए बैक्टीरिया की तैयारी

  1. प्रयोग से एक दिन पहले, एक स्यूडोमोनास आइसोलेशन एगर प्लेट से पी एरुगिनोसा PAO1 की एक कॉलोनी निकालें और एक लुरिया-बर्टानी (एलबी) एगर प्लेट से K12 ई कोलाई MC1000 की एक कॉलोनी और एलबी शोरबा के 3 मिलीलीटर युक्त अलग ट्यूबों में रखें। सावधानी: पी एरुगिनोसा एक मानव रोगजनक है, इस जीव को संभालते समय मानक BSL2 सुरक्षा उपाय अपनाए जाने चाहिए।
  2. एक ३७ ºC वातावरण में २२५ आरपीएम पर रात भर हिला ।
  3. अगले दिन, घने बैक्टीरियल संस्कृतियों से 1 मिलीलीटर निकालें और 1.5 मिलीलीटर एपेंडोर्फ ट्यूब में रखें।
  4. माइक्रोफ्यूज में 5 मिनट के लिए 15,800 x ग्राम पर स्पिन करें और फिर सुपरनैंट निकालें।
  5. कैल्शियम और मैग्नीशियम (एचबीएसएस +) के साथ हैंक्स का संतुलित नमक समाधान पहले से तैयार करें। 9.5 एल आसुत पानी में 23.8 ग्राम एचईपी और 97.5 ग्राम एचबीएसएस + पाउडर जोड़ें। समाधान के लिए 10 एम NaOH की छोटी मात्रा जोड़ें, जबकि पीएच की निगरानी जब तक ७.४ के एक स्थिर पीएच तक पहुंच गया है । वॉल्यूम को 10 एल तक लाएं और 4 डिग्रीसी पर स्टोर करें।
  6. प्रत्येक बैक्टीरियल पेलेट को 1 मिलीलीटर एचबीएसएस + के साथ फिर से खर्च करें। भंवर यह सुनिश्चित करने के लिए कि एक भी बैक्टीरियल निलंबन हासिल किया गया है।
  7. 5 मिनट के लिए 15,800 x ग्राम पर फिर से स्पिन करें और सुपरनैंट निकालें।
  8. 0.6 मिलीलीटर एचबीएस + और एमसी1000 गोली के साथ 0.5 मिलीलीटर एचबीएसएस + के साथ PAO1 गोली को फिर से खर्च करें। भंवर बैक्टीरियल निलंबन।
  9. इसके अलावा PAO1 और MC1000 पुनर् निलंबित छर्रों 1:100 HBSS + में पतला । उदाहरण के लिए, 0.6 मिली पाओ1 पुनर्संपित गोली के 50 माइक्रोन को 5 मिलीलीटर एचबीएसएस + में जोड़ें। नोट: संस्कृति घनत्व के साथ-साथ मानक कॉलोनी बनाने इकाई (सीएलयू) कमजोर पड़ने चढ़ाना पद्धति, PAO1 और MC1000 समाधान इस तरीके से तैयार करने के लिए ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) माप का उपयोग लगातार 3 x 107-6x 107 7 नीचेयू/मिलीलीटर के बीच उपज । एक जीवाणु संस्कृति का घनत्व सकारात्मक 600 एनएम पर संस्कृति के ओडी माप के साथ सहसंबद्ध है और इस सहसंबंध बैक्टीरियल सेल एकाग्रता का अनुमान लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। बैक्टीरियल सेल एकाग्रता की पुष्टि करने के लिए, संस्कृति को बहुत कम अनुमानित एकाग्रता से पतला किया जा सकता है और एक आगर प्लेट पर चढ़ाया जा सकता है जैसे कि प्लेट पर 30-200 बैक्टीरियल कोशिकाओं के बीच मौजूद होने की उम्मीद होगी। कोशिकाओं को थाली में फैला दिया जाता है और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेटेड किया जाता है ताकि प्रत्येक कोशिका कोशिकाओं की एक व्यक्तिगत कॉलोनी बनाती है जो दिखाई देने के लिए काफी बड़ी होती है और उपनिवेशों को फिर गिना जा सकता है।

5. पूरे रक्त से न्यूट्रोफिल का अलगाव

  1. एसिड साइट्रेट डेक्सट्रोस सॉल्यूशन (एसीडी) का उपयोग एंटीकोगुलैंट के रूप में किया जाता है और इसे 6.9 ग्राम साइट्रिक एसिड, 12.5 ग्राम सोडियम साइट्रेट और 10 ग्राम डेक्सट्रोज से 500 मिली आसुत पानी जोड़कर तैयार किया जाता है। एक बार जब सभी घटकों को भंग कर दिया जाता है, तो एसीडी समाधान को 0.2 माइक्रोन फिल्टर यूनिट से गुजरकर निष्फल कर दिया जाता है। एसीडी समाधान को 4 डिग्री पर स्टोर करें।
  2. रक्त खींचने से पहले, 50 मिलीलीटर सिरिंज में 5 मिलीलीटर एसीडी जोड़ें और टयूबिंग में 12 के साथ 21 x 3/4 जी तितली सुई संलग्न करें।
  3. टूनीकेट लागू करें, शराब के साथ नस पोंछें, और सुई डालें। नोट: मानव विषयों से जुड़े किसी भी अनुसंधान प्रोटोकॉल को संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए और प्रत्येक रक्तदाता से लिखित सूचित सहमति प्रदान की जानी चाहिए । उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके किए गए प्रयोगों को मैसाचुसेट्स जनरल हॉस्पिटल इंस्टीट्यूशनल रिव्यू बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था और प्रोटोकॉल #1999-पी-007782 सौंपा गया था।
  4. धीरे-धीरे 45 मिलीलीटर रक्त खींचें यह सुनिश्चित करते हुए कि सिरिंज में एक बार रक्त एसीडी के साथ घोला जा सकता है।
  5. जब 45 मिलीलीटर (50 मिलीलीटर कुल मात्रा) तैयार किया गया है, तो सुई को हटाने से पहले टूनीकेट को खोलें। सुई हटाने पर बाँझ धुंध के साथ घाव करने के लिए तुरंत दबाव लागू करें।
  6. लगभग 5-10 सेकंड से अधिक 50 मिलीलीटर ट्यूब के किनारे धीरे-धीरे रक्त स्थानांतरित करें।
  7. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए निष्क्रिय ब्रेक के साथ 1,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र में स्पिन। नोट: पीबीएस में पूरे रक्त को कमजोर करने से जुड़े एक अतिरिक्त कदम- और अपकेंद्रित्र से पहले फिकोल-पैक पर पतला रक्त का सावधानीपूर्वक ओवरले नियोजित किया जा सकता है ताकि ग्रेनुलोसाइट्स 8 से बफी कोट को अधिक कुशलता से अलग करके न्यूट्रोफिल शुद्धता काथोड़ाउच्च स्तर प्राप्त किया जा सके। इस कदम को छोड़ने के लिए काफी इस परख के प्रयोजनों के लिए उपज या शुद्धता को प्रभावित किए बिना समय बचाने के लिए कार्य करता है, और इस तरह हम Ficoll-Paque कदम पर रक्त ओवरले शामिल नहीं एहसान ।
  8. जबकि रक्त घूम रहा है, बहुत धीरे-धीरे कैल्शियम और मैग्नीशियम (एचबीएसएस (-)) के बिना 50 मिलीलीटर गर्म हैंक्स के संतुलित नमक समाधान में 1 ग्राम जिलेटिन जोड़ें ताकि 2% जिलेटिन समाधान तैयार किया जा सके। 37 ºC पर समाधान रखें।
  9. एक ग्लास पिपेट टिप का उपयोग करके रक्त की 50 मिलीलीटर ट्यूब से प्लाज्मा को एस्पिरेट और त्यागें जिसे सिग्माकोटे के साथ इलाज किया गया है।
  10. बफी कोट को हटाने के लिए बहुत सावधानी से एस्पिरेशन जारी रखें, जिसमें लिम्फोसाइट्स सहित सफेद रक्त कोशिकाएं शामिल हैं।
  11. जैसे ही बफी कोट को धीरे-धीरे हटाया जा रहा है, लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) परत के ऊपर सफ़ेद पीले बादल सामग्री गायब हो जाएगी। एक बार बफी कोट को हटा दिए जाने के बाद आकांक्षा को बंद करें और ट्यूब के ऊपर से देखने पर आरबीसी परत को स्पष्ट रूप से कल्पना की जा सकती है।
  12. आरबीसी परत को परेशान न करने की कोशिश करें क्योंकि ग्रेनुलोसाइट्स, ज्यादातर न्यूट्रोफिल, आरबीसी परत की सतह के पास हैं, लेकिन दिखाई नहीं दे रहे हैं।
  13. 15 मिलीलीटर आरबीसी परत की मात्रा में, 30 मिलीलीटर गर्म 2% जिलेटिन समाधान (आरबीसी परत की 2x मात्रा) जोड़ें।
  14. इनवर्ट ट्यूब धीरे मिश्रण करने के लिए, बुलबुले के गठन को कम करने के लिए ध्यान रखते हुए।
  15. 25 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट   करें नोट: आरबीसी को कुल और नीचे बसना चाहिए। जिलेटिन के विकल्प के रूप में, बड़े आणविक वजन डेक्सट्रांस को तलछट आरबीसी 8 मेंनियोजितकिया जा सकता है।
  16. इनक्यूबेशन के बाद, शीर्ष परत हल्के लाल समाधान को स्थानांतरित करें जिसमें ग्रेनुलोसाइट्स को पिपेट के साथ एक नई 50 मिलीलीटर ट्यूब में शामिल किया गया है, स्थानांतरण के दौरान बसे हुए अंधेरे आरबीसी परत को परेशान न करने के लिए सावधान रहें। एक बार अलग होने के बाद, डार्क आरबीसी लेयर को त्यागें।
  17. स्पिन ने पैलेट कोशिकाओं के क्रम में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सक्रिय ब्रेक के साथ 1,000 x ग्राम पर सेंट्रलीफ्यूज में ग्रैनुलोसाइट्स और कुछ आरबीसी युक्त हल्के लाल समाधान स्थानांतरित किए।
  18. सुपरनेट को सावधानी से बंद करें या एस्पिरेट करें, क्योंकि रेडिश सेल पेलेट जो अपकेंद्रित्र के बाद बनेगी, आम तौर पर ढीला होता है।
  19. आरबीसी लाइसिस बफर को पहले से तैयार करें और एक बीकर में 8.29 ग्राम अमोनियम क्लोराइड (एनएच4 सीएल), 1ग्राम सोडियम बाइकार्बोनेट (एनएएचसीओ3)और 0.038 ग्राम ईडटा को 1 एल डिस्टिल्ड पानी जोड़कर 4 डिग्री पर स्टोर करें। 4 डिग्री पर आरबीसी लाइसिस बफर स्टोर करें।
  20. रिस्सुपेंड और ठंड आरबीसी लाइसिस बफर की एक छोटी मात्रा के साथ लाल सेल गोली को तोड़ने। एक बार सेल गोली समाधान में है, आरबीसी लाइसिस बफर के साथ 50 मिलीलीटर करने के लिए ट्यूब भरें। नोट: इस बिंदु पर और आगे जा रहा है, बर्फ पर या 4 ºC पर कोशिकाओं को रखें ।
  21. 4 ºC पर 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र में स्पिन   करें और फिर सुपरनेट को बंद या एस्पिरेट करें। नोट: सुपरनेट कुछ हद तक लाल होगा जिसमें lysed RBCs होंगे। इस बिंदु पर गोली पीले रंग की सफेद होनी चाहिए। यदि महत्वपूर्ण आरबीसी एक लाल गोली द्वारा इंगित के रूप में गोली में रहते हैं, कदम 5.20-5.21 दोहराया जा सकता है । महत्वपूर्ण RBCs सेल गोली में रहते है अगर कदम ५.२० से लाल गोली पर्याप्त रूप से टूट नहीं है ।
  22. पुनर्सुपेंड और एचबीएसएस (-) की एक छोटी मात्रा के साथ सफ़ेद गोली को तोड़ने और फिर HBSS (-) के साथ ५० मिलीलीटर करने के लिए ट्यूब भरें । नोट: एचबीएसएस (-) और नहीं एचबीएसएस + का उपयोग सफ़ेद सेल पेलेट को फिर से रीसुस्पेंड करने के लिए किया जाना चाहिए। एचबीएसएस में कैल्शियम और मैग्नीशियम की कमी होती है।
  23. 4 ºC पर 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र में फिर से स्पिन   करें।
  24. सुपरनैंट को बंद करें और 1 मिलीलीटर एचबीएसएस (-) की अंतिम मात्रा में गोली को फिर से खर्च करें।
  25. 1.5 मिलीलीटर एपेंडोर्फ ट्यूब में 1 मिलीलीटर सेल सस्पेंशन के 5 माइक्रोन जोड़ें और पिपेट द्वारा धीरे-धीरे ऊपर और नीचे मिलाएं।
  26. 25 माइक्रोन पतला सेल सस्पेंशन 25 माइक्रोन 0.4% ट्राइपैन ब्लू में जोड़ें।
  27. एक मानक हीमोसाइटोमीटर के प्रत्येक पक्ष में मिश्रण के 12 माइक्रोन जोड़ें।
  28. ट्राइपैन ब्लू डाई को बाहर रखने वाली जीवित कोशिकाओं की संख्या गिनें और हीमोसाइटोमीटर के दोनों किनारों के मध्य वर्ग में मौजूद हैं।
  29. कोशिका एकाग्रता की गणना करने के लिए, 2 वर्गों के औसत को 100 (कमजोर पड़ने वाला कारक) से गुणा करें और फिर कोशिकाओं/एमएल की संख्या देने के लिए10 4 से गुणा करें।
  30. अंतिम एकाग्रता को 5 x 107 कोशिकाओं/मिलीलीटर में समायोजित करें। यदि 5 x 107 कोशिकाओं/एमएल से अधिक है, तो एचबीबीएस (-) जोड़कर समायोजित करें। यदि कम है, तो कोशिकाओं को गोली करें और उचित मात्रा में पुनर्सीमित करें।
  31. माइग्रेशन परख के लिए तैयार होने तक बर्फ पर कोशिकाओं को रखें। नोट: ये कोशिकाएं सफेद रक्त कोशिकाओं की ग्रेनुलोसाइट आबादी का प्रतिनिधित्व करती हैं। पूरे मानव रक्त से अलग ग्रेनुलोसाइट्स के बहुमत न्यूट्रोफिल हैं। कोशिकाओं को एक शांत राज्य में कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए माइग्रेशन परख के अलावा तक एचबीएसएस (-) में निलंबित बर्फ पर रखा जाता है।

6. माइग्रेशन परख के लिए एपिथेलियल सेल लेयर्स की तैयारी

(इनचरणों को बाँझ हुड के भीतर किए जाने की आवश्यकता नहीं है।

  1. इनक्यूबेटर 24-अच्छी तरह से प्लेट से निकालें एपिथेलियल परतों का समर्थन है कि ट्रांसवेल फिल्टर झिल्ली के नीचे पर कम से कम आठ दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया है ।
  2. एक हीमोस्टेट के साथ प्रत्येक ट्रांसवेल के किनारे को समझें, 24-अच्छी प्लेट से बाहर उठाएं और ट्रांसवेल के भीतरी कक्ष से संस्कृति मीडिया को त्यागने के लिए एक बेकार बाल्टी पर ट्रांसवेल को उलट दें। एचबीएसएस + के साथ ट्रांसवेल के भीतरी कक्ष को भरने के लिए प्रत्येक ट्रांसवेल को एचबीएसएस + युक्त वॉश बीकर में डुबोएं। एक बेकार बाल्टी में भीतरी कक्ष से तरल पदार्थ त्यागें।
  3. एचबीएसएस + में दूसरे वॉश के लिए स्टेप 6.2 दोहराएं। दो वॉश के बाद, प्रत्येक कुएं में 1 मिलीलीटर एचबीएसएस + युक्त एक नई 24-अच्छी प्लेट में ट्रांसवेल रखें। नोट: सभी वॉश एचबीएसएस + के साथ किए जाने चाहिए जो 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म हैं।
  4. एपिथेलियल सेल लेयर अखंडता का आकलन करने के लिए प्रत्येक ट्रांसवेल के शीर्ष कक्ष का निरीक्षण करें। नोट: एचबीएसएस + में रिसाव नहीं करना चाहिए और ट्रांसवेल के शीर्ष कक्ष को भरने जब एक 24 अच्छी तरह से एचबीएसएस + के 1 मिलीलीटर युक्त थाली के कुएं में रखा ।
  5. प्रत्येक ट्रांसवेल को ध्यान से देखने के बाद, शीर्ष कक्ष में 0.2 मिलीलीटर एचबीएसएस + जोड़ें।
  6. 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में   रखें, 5% सीओ2 एक आर्द्रीकृत कक्ष में 30-60 मिनट के लिए एपिथेलियल सेल परतों को बराबर करने के लिए।

7. न्यूट्रोफिल ट्रांस-एपिथेलियल माइग्रेशन परख

  1. इनक्यूबेटर से निकालें 24-अच्छी तरह से एचबीएसएस + में समतुल्य धोया ट्रांसवेल की थाली ।
  2. प्रत्येक ट्रांसवेल को एक हीमोस्टेट के साथ पकड़ें और एक बेकार बाल्टी में अच्छी तरह से शीर्ष में तरल पदार्थ त्यागें।
  3. प्रत्येक ट्रांसवेल को 150 मिमी x 25 मिमी पेट्री डिश में उल्टा रखें।
  4. उल्टे ट्रांसवेल में से छह के लिए, एचबीएसएस + के 25 माइक्रोन जोड़ें । उल्टे ट्रांसवेल में से तीन को, एचबीएसएस + में पतला 25 माइक्रोन पी एरुगिनोसा (PAO1) के साथ संक्रमित जो चरण 4 में वर्णित है। अंतिम तीन उल्टे ट्रांसवेल के लिए, 25 माइक्रोन ई. कोलाई K12 (MC1000) HBSS में पतला + के रूप में चरण 4 में वर्णित के साथ संक्रमित । यह लगभग 0.8 x 106-1.5 x 106 CFUs/epithelial परत प्रत्येक जीवाणु प्रजातियों के लिए है क्योंकि चरण 4 में तैयार बैक्टीरियल समाधानों की एकाग्रता लगभग 3 x 107-6x 107 सीएफयू/मिलीलीटर है।
  5. 37 डिग्री सेल्सियस पर   इनक्यूबेट, 60 मिनट के लिए एक आर्द्रीकृत कक्ष में 5% सीओ2।
  6. 10 मिलीलीटर एचबीएसएस + में 10 एमएम एफएमएलपी स्टॉक के 5 माइक्रोन जोड़कर न्यूट्रोफिल माइग्रेशन के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में एफएमएलपी तैयार करें जो 10 माइक्रोन समाधान दे रहा है।
  7. एक हीमोस्टेट के साथ लोभी और नीचे कक्षों में 1 मिलीलीटर HBSS + शामिल है कि एक 24 अच्छी तरह से धोने की थाली में वापस फ्लिपिंग द्वारा ट्रांसवेल धोएं । शीर्ष कक्षों में 0.2 मिलीलीटर एचबीएसएस + जोड़ें।
  8. एक हीमोस्टेट के साथ ट्रांसवेल को पकड़ें और पहली वॉश प्लेट से हटा दें। ट्रांसवेल को 1 एमएल एचबीएसएस + युक्त दूसरी 24-अच्छी तरह से धोने की प्लेट में रखने से पहले, शीर्ष कक्ष से तरल पदार्थ को अपशिष्ट बाल्टी में छोड़ दें। शीर्ष कक्ष में 0.2 मिलीलीटर एचबीएसएस + जोड़ें।
  9. कुल 3 वॉश के लिए 7.8 एक बार और दोहराएं। नोट: सभी ट्रांसवेल एक ही हैंडलिंग और वाशिंग आहार के अधीन किया जाना चाहिए, चाहे या नहीं वे बैक्टीरिया से संक्रमित किया गया है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी ट्रांसवेल परख किया जा रहा है एक ही तरीके से हेरफेर किया गया है । पाओ 1 या एमसी1000 के साथ 60 मिनट का संक्रमण क्रमशः18,22,एक लैक्टेट डेहाइड्रोजनेज़ आधारित विष विज्ञान परख और एचआरपी फ्लक्स परख द्वारा मूल्यांकन किए गए एच2 9 2 मोनोलेयर के बाधा गुणों को कम या बदल नहीं देता है।
  10. 24-वेल प्लेट के 12 कुओं में 1 एमएल एचबीएसएस + जोड़कर 24-वेल माइग्रेशन प्लेट तैयार करें। नोट- इस प्लेट को पहले से तैयार किया जा सकता है।
  11. तीसरे धोने के बाद, ट्रांसवेल के शीर्ष कक्षों से तरल पदार्थ को एक हीमोस्टेट का उपयोग करके एक अपशिष्ट बाल्टी में त्यागें और असंक्रमित ट्रांसवेल के तीन को 24-अच्छी तरह से माइग्रेशन प्लेट के तीन कुओं में रखें जिसमें 1 मिलीलीटर एचबीएसएस + होता है, जो नकारात्मक नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करता है।
  12. 1 मिलीलीटर एचबीएसएस + (100 एनएम) वाले 24-वेल माइग्रेशन प्लेट के तीन कुओं में से प्रत्येक में एफएमएलपी के 10 माइक्रोन समाधान के पिपेट 10 माइक्रोन।
  13. 100 एनएम एफएमएलपी युक्त 24-वेल माइग्रेशन प्लेट के तीन कुओं में असंक्रमित ट्रांसवेल के तीन स्थान, जो स्थानांतरित करने के लिए अलग न्यूट्रोफिल की क्षमता के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करता है।
  14. PAO1 से संक्रमित तीन ट्रांसवेल और MC1000 से संक्रमित तीन ट्रांसवेल को क्रमशः तीन कुओं में रखें, जिसमें 1 मिलीलीटर एचबीएसएस + होता है । हर ट्रांसवेल के शीर्ष कक्ष में 0.1 मिलीलीटर एचबीएसएस + जोड़ें।
  15. प्रत्येक ट्रांसवेल में 0.1 मिलीलीटर एचबीएसएस + के शीर्ष पर, चरण 5 में वर्णित न्यूट्रोफिल सस्पेंशन (5 x 107 कोशिकाओं/एमएल) के 20 माइक्रोन को ध्यान से जोड़ें। नोट: यह लगभग 1 x 106 न्यूट्रोफिल/ट्रांसवेल का प्रतिनिधित्व करता है।
  16. न्यूट्रोफिल के ट्रांस-एपिथेलियल माइग्रेशन की अनुमति देने के लिए2 घंटे के लिए एक आर्द्रीकृत कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, 5% सीओ 2।
  17. 2 घंटे के बाद माइग्रेट हुए न्यूट्रोफिल की संख्या निर्धारित करने के लिए एक मानक वक्र तैयार करें। न्यूट्रोफिल सस्पेंशन (5 x 107 कोशिकाओं/मिलीलीटर) के 40 माइक्रोन को 2 मिलीलीटर एचबीएसएस (+) में जोड़ें और 1 मिलीलीटर एचबीएसएस (+) में 1 मिलीलीटर स्थानांतरित करें और लगभग 2,000 सेल/एमएल से लेकर 106 सेल/एमएल तक कुल 10 मानकों के लिए सीरियल 2-गुना कमजोर कर आठ अतिरिक्त बार करें। खाली के लिए 1 मिलीलीटर एचबीएसएस (+) शामिल करें।
  18. 2 घंटे के प्रवास के बाद, एक हीमोस्टेट के साथ लोभी द्वारा ट्रांसवेल उठाएं और 24-अच्छी तरह से माइग्रेशन प्लेट की अंदर की दीवारों के खिलाफ धीरे से टैप करें। ट्रांसवेल त्यागें।
  19. 10X उद्देश्य का उपयोग कर एक उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत 24 अच्छी तरह से प्रवास प्लेट के कुओं को देखने के द्वारा कुओं में मोटे तौर पर न्यूट्रोफिल के प्रवास का आकलन करें (प्रत्येक स्थिति में माइग्रेट न्यूट्रोफिल की छवियों के लिए चित्रा 1 देखें)।
  20. 24-अच्छी तरह से माइग्रेशन प्लेट, प्रत्येक मानक और खाली में उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक में 10% ट्राइटन एक्स-100 का 50 माइक्रोल जोड़ें।
  21. 4 ºC पर 20 मिनट के लिए कम गति से 24-अच्छी तरह से माइग्रेशन प्लेट, मानकों और खाली   घुमाएं।
  22. पहले से 1 एम साइट्रेट बफर तैयार करें। एक बीकर में 400 मिलीलीटर आसुत पानी में 52.5 ग्राम साइट्रिक एसिड और 73.5 ग्राम सोडियम साइट्रेट जोड़ें। पीएच को 4.2 पर लाएं। 500 मिलीलीटर के अंतिम समाधान के लिए आसुत पानी जोड़ें। 4 ºC पर समाधान स्टोर करें।
  23. उस दिन ताजा ABTS सब्सट्रेट समाधान तैयार करें। 3 ABTS गोलियां (10 मिलीग्राम प्रत्येक) और 45 मिलीलीटर आसुत पानी के लिए 1 मीटर साइट्रेट बफर के 5 मिलीलीटर जोड़ें। गोलियों को पूरी तरह से समाधान में भंग करने की अनुमति दें। एबीटीएस सब्सट्रेट समाधान की आवश्यकता होने तक 30% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के 50 माइक्रोन के अतिरिक्त रोक दें (चरण 7.27 देखें)।
  24. 24-अच्छी तरह से माइग्रेशन प्लेट, प्रत्येक मानक और खाली में उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक अच्छी तरह से उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक में साइट्रेट बफर के 50 माइक्रोन जोड़ें।
  25. प्रत्येक नमूने के 100 माइक्रोन को डुप्लिकेट में 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें। नोट: 96-अच्छी प्लेट में जाने से पहले प्रत्येक नमूने में सामग्री को अच्छी तरह से मिलाना बहुत महत्वपूर्ण है। स्थानांतरण से पहले कम से कम पांच बार समाधान को ऊपर और नीचे करें।
  26. मिश्रण (डुप्लिकेट में खाली) के बाद प्रत्येक मानक के 100 माइक्रोन और 96-वेल प्लेट में खाली स्थानांतरित करें।
  27. एबीटीएस सॉल्यूशन और भंवर में 30% हाइड्रोजन पेरोक्साइड का 50 माइक्रोन जोड़ें।
  28. 96-वेल प्लेट पर प्रत्येक नमूने में एबीटीएस सब्सट्रेट समाधान का 100 माइक्रोन जोड़ें।
  29. प्लेट को अंधेरे में 5-10 मिनट के लिए विकसित करने की अनुमति दें। नोट: कुछ कुओं में एक हरा रंग विकसित होना चाहिए, जो प्रत्येक कुएं में मौजूद न्यूट्रोफिल की संख्या से संबंधित है।
  30. एक माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग कर 405 एनएम की तरंगदैर्ध्य में पढ़ें।
  31. मानकों का उपयोग करके एपिथेलियल परत में स्थानांतरित हुए न्यूट्रोफिल की संख्या की गणना करें जिससे मानकों के रूप में तैयार न्यूट्रोफिल की ज्ञात संख्याओं और 405 एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व द्वारा मापा गया पेरोक्सिडेस गतिविधि की मात्रा के बीच एक रैखिक सकारात्मक संबंध मौजूद है (प्रतिनिधि डेटा के लिए आंकड़े 2 और 3 देखें)। नोट: न्यूट्रोफिल क्वांटिफिकेशन की यह विधि माइलोप्रोक्सिडेज अभिव्यक्ति के कारण न्यूट्रोफिल द्वारा प्रदर्शित पेरोक्सिडेस गतिविधि की बड़ी मात्रा का लाभ उठाती है। न्यूट्रोफिल को मात्रा देने के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोणों पर विचार किया जा सकता है, जैसे रेडियोधर्मिता या फ्लोरेसेंस यौगिकों के साथ प्रीलेबलिंग न्यूट्रोफिल शामिल तरीकों के रूप में।

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Representative Results

कई अध्ययनों से पता चला है कि रोगजनक-संक्रमित एपिथेलियल परतें न्यूट्रोफिल ट्रांस-एपिथेलियल माइग्रेशन3,8,19, 24-28,31,32की सुविधा प्रदान करती हैं। यह एक एपिथेलियल सेल-व्युत्पन्न न्यूट्रोफिल केमोटेक्टिक ग्रेडिएंट3,23के रोगजनक-विशिष्ट प्रेरण के माध्यम से होता है। उदाहरण के लिए, फेफड़ों की एपिथेलियल कोशिकाओं की एपिकल सतह के साथ बातचीत करने वाले रोगजनक पी एरुगिनोसा के कारण एपिथेलियल परत18,22,25,26,33,34में पर्याप्त संख्या में न्यूट्रोफिल स्थानांतरित हो जाते हैं। इस चिकित्सकीय प्रासंगिक परख प्रणाली कई मायनों में हेरफेर किया जा सकता है कुंजी रोगजनक अनावरण और मेजबान आणविक योगदानकर्ताओं जब उचित नियंत्रण के साथ बनती है ।

न्यूट्रोफिल को ध्रुवीकृत एपिथेलियल सेल परतों में जोड़ा गया है जो पूर्व संक्रमित नहीं हैं, प्रशंसनीय संख्या में स्थानांतरित करने में विफल रहते हैं। हालांकि, एक असंक्रमित एपिथेलियल परत में एक कीमो-आकर्षित ढाल का आवेदन पूरे न्यूट्रोफिल की महत्वपूर्ण संख्या को ड्राइव करेगा। रोगजनक संक्रमित एपिथेलियल परतों में न्यूट्रोफिल माइग्रेशन की जांच करते समय प्रत्येक परख के भीतर क्रमशः इन नकारात्मक और सकारात्मक दोनों नियंत्रणों को शामिल करना महत्वपूर्ण है। नकारात्मक नियंत्रण संकेत के अभाव में एपिथेलियल परत को पार करने वाले न्यूट्रोफिल की पृष्ठभूमि संख्या स्थापित करता है। यह संख्या बहुत कम होनी चाहिए जब सुसंस्कृत एपिथेलियल कोशिकाओं ने एक कार्यात्मक बाधा स्थापित की है। उच्च पृष्ठभूमि प्रवास रोगजनक-संक्रमित एपिथेलियम के साथ प्राप्त परिणामों की व्याख्या को जटिल बनाता है। सकारात्मक नियंत्रण में एपिथेलियल परत में एफएमएलपी जैसे न्यूट्रोफिल केमो-आकर्षित के ढाल को लागू करना शामिल है और यह पुष्टि करने के लिए कार्य करता है कि अलग-थलग न्यूट्रोफिल कार्यात्मक हैं। इसके अलावा, इस घटना में कि एपिथेलियल परतों को रोगजनक प्रेरित ट्रांस-एपिथेलियल माइग्रेशन पर उनके प्रभावों का आकलन करने के लिए कुछ अभिकर्मकों के साथ पूर्वउपचार किया जाता है, एफएमएलपी ढाल किसी भी प्रभाव के लिए नियंत्रण करने के लिए कार्य करता है, जो कि रेटेंट रोगजनक मध्यस्थता प्रभावों के बावजूद एपिथेलियल परत को नेविगेट करने की क्षमता पर हो सकता है। इस परख प्रणाली के भीतर अक्सर नियोजित एक अतिरिक्त नियंत्रण में रोगजनक के समानांतर गैर-पैथोजेनिक बैक्टीरिया के साथ एपिथेलियल परतों का संक्रमण शामिल होता है। इस नियंत्रण का फायदा बैक्टीरिया के साथ बातचीत के बाद प्रासंगिक एपिथेलियल प्रतिक्रियाओं को अलग करने के साथ-साथ न्यूट्रोफिल ट्रांस-एपिथेलियल माइग्रेशन को उत्तेजित करने के लिए आवश्यक रोगजनक कारकों की पहचान के साथ सहायता करने के लिए किया जा सकता है।

न्यूट्रोफिल ट्रांस-एपिथेलियल माइग्रेशन का मूल्यांकन गुणात्मक और मात्रात्मक दोनों रूप से किया जा सकता है। 2 घंटे के इनक्यूबेशन के पूरा होने पर बेसोटेरल सतह पर न्यूट्रोफिल के अलावा, ट्रांसवेल हटा दिए जाते हैं और न्यूट्रोफिल जो एपिथेलियल परत के पार पूरी तरह से एपीिकल चैंबर में चले गए हैं, उन्हें 24-अच्छी तरह से माइग्रेशन प्लेट के नीचे कुएं में देखा जा सकता है। प्रत्येक स्थिति की एक प्रतिनिधि छवि चित्रा 1में प्रदर्शित की जाती है, जो उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कल्पना की जाती है। एक लगाए गए केमोटेक्टिक ग्रेडिएंट (एचबीएसएस +) के बिना एक असंक्रमित एपिथेलियल परत में स्थानांतरित करने के लिए बहुत कम न्यूट्रोफिल देखे गए और परख(चित्रा 1 ए)में पृष्ठभूमि के स्तर का प्रतिनिधित्व करते हैं। इसके विपरीत, जब एक एफएमएलपी ढाल(चित्रा 1B)प्रदान किया जाता है तो ट्रांसल माइग्रेट न्यूट्रोफिल की बहुतायत स्पष्ट थी। गैर-पथिक ई. कोलाई MC1000 के साथ एपिथेलियम के संक्रमण के परिणामस्वरूप कुछ दृश्यमान ट्रांस माइग्रेट न्यूट्रोफिल हुए, जबकि कई ट्रांसलाइलियल न्यूट्रोफिल नमूदार थे जब एपिथेलियल परतें फेफड़ों के रोगजनक पी एरुगिनोसा (पीएओ 1) (आंकड़े 1C और 1D)से संक्रमित थीं।

प्रयोग में माइग्रेट किए गए न्यूट्रोफिल को उनकी माइलोप्रोक्सीडास गतिविधि को मापकर मात्रा निर्धारित की जाती है। ट्रांस माइग्रेट न्यूट्रोफिल की संख्या का अनुमान लगाने में सक्षम बनाने के लिए एक मानक वक्र का उपयोग किया जाता है। न्यूट्रोफिल की संख्या सकारात्मक रूप से न्यूट्रोफिल के लाइसिस के बाद मापी गई पेरोक्सीस गतिविधि की मात्रा से संबंधित है, जिसमें मानक वक्र (2 x 103-1 x 106 कोशिकाओं/एमएल)(चित्र 2)के लिए चयनित न्यूट्रोफिल संख्याओं की सीमा में एक रैखिक संबंध प्रदर्शित मूल्यों के साथ मापा जाता है। एक महत्वपूर्ण संख्या में न्यूट्रोफिल एक प्रदान किए गए एफएमएलपी ढाल के जवाब में या PAO1(चित्र 3)से संक्रमित एपिथेलियल परत के जवाब में एपिथेलियल परतों में स्थानांतरित हो जाते हैं। उत्तेजनाओं (एचबीएसएस +) की अनुपस्थिति में माइग्रेट होने वाले न्यूट्रोफिल की संख्या या नॉनपैथोजेनिक ई कोलाई एमसी1000 के साथ एपिकल एपिथेलियल संक्रमण का पालन करना परख के लिए पता लगाने की सीमा से नीचे है(चित्र 3)। चित्रा 3 में प्रस्तुत किए गए आंकड़े तीन स्वतंत्र कुओं/स्थिति के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करने वाली त्रुटि सलाखों के साथ ट्रांस माइग्रेट न्यूट्रोफिल की औसत संख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं । चित्र 3 में दर्शाए गए मात्रात्मक आंकड़े चित्र 1में प्रदर्शित प्रतिनिधि अच्छी छवियों के अनुरूप हैं ।

Figure 1
चित्रा 1. ट्रांस-एपिथेलियल माइग्रेशन के बाद न्यूट्रोफिल की छवि। छवियों को 2 घंटे की अवधि के बाद 24-वेल माइग्रेशन प्लेट के नीचे वेल (एपिकल चैंबर) के 10X आवर्धन पर एक उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ देखा गया इनक्यूबेशन था, जिसमें शीर्ष कुएं (बेसोलेटरल चैंबर) में जोड़ा गया था। (ए)निगेटिव कंट्रोल एचबीएसएस +। (ख)सकारात्मक नियंत्रण एफएमएलपी केमोटेक्टिक ग्रेडिएंट लगाया गया । (ग)एपिथेलियल सेल लेयर्स जो नॉनपैथोजेनिक ई कोलाई के12 (एमसी1000) से संक्रमित हैं। (घ)रोगजनक पी एरुगिनोसा (PAO1) से संक्रमित एपिथेलियल सेल परतें । बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2। 1 x 106 की शुरुआती एकाग्रता पर न्यूट्रोफिल नौ 2 गुना कमजोर पड़ने के अधीन थे। लाइसिस के बाद, पेरोक्सिडास गतिविधि की मात्रा निर्धारित की गई थी और एक्स-एक्सिस पर न्यूट्रोफिल की संख्या को वाई-एक्सिस पर पेरोक्सिडेज गतिविधि के साथ रेखांकन किया गया था। चित्रित समीकरण का उपयोग प्रत्येक कुएं में मापा जाने वाले पेरोक्सिडेज गतिविधि की मात्रा के आधार पर ट्रांसफ्यूजन के बाद प्रत्येक कुएं में मौजूद न्यूट्रोफिल की संख्या निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3। ट्रांसल माइग्रेट न्यूट्रोफिल का मात्राकरण। ट्रांसल माइग्रेट न्यूट्रोफिल की संख्या को सापेक्ष माइलेलोपॉक्सिडास गतिविधि द्वारा न्यूट्रोफिल की ज्ञात संख्याओं के रैखिक मानक वक्र तक निर्धारित किया जाता है। रोगजनक पी एरुगिनोसा (पीएओ 1) के साथ एपिथेलियल सेल संक्रमण या न्यूट्रोफिल केमो-आकर्षित एफएमएलपी के बेसोटेरल ग्रेडिएंट के लिए एक एपिकल की स्थापना के बाद ट्रांस माइग्रेट न्यूट्रोफिल की पर्याप्त संख्या देखी गई। गैर-रोगजनक ई. कोलाई K12 (MC1000) उपचार या नकारात्मक नियंत्रण बफर केवल (एचबीबीएस +) के साथ एपिथेलियल सेल संक्रमण के बाद ट्रांसल माइग्रेट न्यूट्रोफिल की अज्ञेय संख्या देखी गई। बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

बैक्टीरियल रोगजनकों के साथ संक्रमण के बाद रोग विकृति में म्यूकोसल एपिथेलियलसतहोंमें न्यूट्रोफिल माइग्रेशन एक आम विशेषता है। यहां वर्णित पद्धति एक तेजी से, सीधा दृष्टिकोण प्रदान करती है जो वायट्रो कोकल्चर परख प्रणाली में प्राप्त मानव कोशिका का उपयोग करके इस असतत घटना को प्रयोगात्मक रूप से अलग करने के लिए एक त्वरित, सीधा दृष्टिकोण प्रदान करती है जो बैक्टीरियल संक्रमणों से शुरू होने वाली भड़काऊ प्रक्रिया की एक विशेषता को मॉडल करती है। यह प्रणाली मूल रूप से एनर्लोनेला टाइफिमुरियम, शिगेला फ्लेक्सनेरीऔर विभिन्न रोगजनक ई. कोलाई8,19,24,27,28सहित आंत्रप्रेन्योर रोगजनकों से संक्रमित ध्रुवीकृत आंतों के एपिथेलियल कोशिकाओं का उपयोग करके विकसित की गई थी। इनमें से प्रत्येक रोगजनक जीव उल्टे कोलेजन लेपित पारमेबल ट्रांसवेल फिल्टर पर उगाए जाने वाले ध्रुवीकृत आंतों के एपिथेलियल मोनोलेयर में न्यूट्रोफिल चलाने में सक्षम है। इस प्रायोगिक प्रणाली को फेफड़ों के एपिथेलियल बाधाओं और रोगजनक प्रेरित न्यूट्रोफिल ट्रांस-एपिथेलियल माइग्रेशन18,26का पता लगाने के लिए संशोधनों के साथ अनुकूलित किया गया है। एच292 के अलावा कई वायुमार्ग एपिथेलियल सेल लाइनों का उपयोग इन अध्ययनों के लिए किया गया है जिसमें आमतौर पर उद्धृत A549, BEAS-2B, और Calu-3 फेफड़ों के एपिथेलियल सेललाइन22,26शामिल हैं। पी एरुगिनोसा फेफड़ों में सूजन को भड़काता है जिससे तीव्र निमोनिया और सिस्टिक फाइब्रोसिस35,36जैसे रोगों को काफी नुकसान होता है। जैसा कि वर्णित है, फेफड़ों के रोगजनक पी एरुगिनोसा आसानी से फेफड़ों के एपिथेलियल कोशिकाओं के संक्रमण पर न्यूट्रोफिल ट्रांस-एपिथेलियल माइग्रेशन को प्रेरित करता है, जो निमोनिया और सिस्टिक फाइब्रोसिस में देखी गई भड़काऊ प्रक्रिया की एक उल्लेखनीय विशेषता है। इसके अलावा, सिस्टिक फाइब्रोसिस रोगियों से नैदानिक आइसोलेट सहित पी एरुगिनोसा के कई अतिरिक्त उपभेदों को इस परख25में प्रेरकों के रूप में मान्य किया गया है। स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया और क्लेबसिएला निमोनिया,ग्राम-पॉजिटिव और ग्राम-नकारात्मक जीवाणु रोगजनक क्रमशः निमोनिया से जुड़े होते हैं और इन्हें इन विट्रो कॉकल्चर मॉडल26,32का उपयोग करके न्यूट्रोफिल ट्रांस-एपिथेलियल माइग्रेशन को प्रेरित करने में सक्षम दिखाया गया है। इस प्रकार, यह मॉडल प्रणाली म्यूकोसल रोगजनकों द्वारा भड़काई गई भड़काऊ प्रक्रियाओं का पता लगाने के लिए मानव व्युत्पन्न कोशिकाओं का उपयोग करके एक मजबूत इन विट्रो दृष्टिकोण प्रदान करती है।

मानक ऊतक संस्कृति आधारित मॉडल अक्सर मेजबान रोगजनक बातचीत का पता लगाने के लिए उपयोग किए जाते हैं, आम तौर पर फ्लैट प्लास्टिक की सतहों पर उगाई जाने वाली एपिथेलियल कोशिकाओं को नियोजित करते हैं16। इन विट्रो कोकल्चर परख प्रायोगिक डिजाइन16,37,38में बहुमुखी प्रतिभा प्रदान करने वाली जटिलता की एक बड़ी डिग्री प्रदान करती है। पारमशील ट्रांसवेल फिल्टर के नीचे पर उगाई जाने वाली ध्रुवीकृत एपिथेलियल कोशिकाएं एक एपिकल डिब्बे बनाती हैं जो 24-अच्छी प्लेट में रखे जाने पर नीचे के कक्ष का सामना करती हैं और एक बेसोलेटरल डिब्बे जो ट्रांसवेल14,17के अंदर के शीर्ष कुएं का सामना करती है। यह असतत विभाजन और दिशात्मक अभिविन्यास14,17,23के लिए लगाए गए या एपिथेलियल सेल-जनित केमोटेक्टिक ग्रेडिएंट्स के जवाब में न्यूट्रोफिल के एपिकल माइग्रेशन के लिए फिजियोलॉजिकल बेसोलारल के विश्लेषण की अनुमति देता है। इन विट्रो कोकल्चर प्रणाली ट्रांस-एपिथेलियल माइग्रेशन के कारण विशिष्ट आणविक तंत्र की जांच को सक्षम बनाती है, जिसे फेफड़े के संक्रमण1,15के वीवो मॉडल के जटिल परिवेश में हल करना मुश्किल हो सकता है। इन विट्रो कोकल्चर मॉडल का उपयोग करके न्यूट्रोफिल ट्रांस-एपिथेलियल माइग्रेशन में शामिल प्रमुख कारकों की पहचान के बारे में किसी भी निष्कर्ष को बाद में तीव्र निमोनिया15,22के वीवो मॉडल में उपयोग करके प्रासंगिकता के लिए मान्य किया जा सकता है।

इन विट्रो कॉकल्चर परख को कई तरीकों से छेड़छाड़ की जा सकती है ताकि कई तरह की घटनाओं का अध्ययन किया जा सके। न्यूट्रोफिल भर्ती में योगदान देने वाले जीवाणु जीन पर केंद्रित अध्ययन25,39,40के विशिष्ट रोगजनकों के लिए उपलब्ध उत्परिवर्ती पुस्तकालयों को बताकर किया जा सकता है। इस तरह के विश्लेषण से पता चला जीन उपंयास उग्रता कारकों और विरोधी संक्रमित एजेंटों के लिए संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं । न्यूट्रोफिल भी विश्लेषण के फोकस का प्रतिनिधित्व कर सकता है। उदाहरण के लिए, न्यूट्रोफिल ट्रांस-एपिथेलियल माइग्रेशन5,14,34,41,42की सुविधा के लिए कई सेल सतह आसंजन अणुओं को नियोजित करते हैं। मुख्य सेल-टू-सेल इंटरैक्शन कीमो-आकर्षित ड्राइविंग माइग्रेशन और ऊतक जिसके साथ न्यूट्रोफिल34बातचीत कर रहे हैं, के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। इसप्रक्रियाके लिए महत्वपूर्ण सतह अणुओं या संकेत रास्ते की पहचान करने के लिए रोगजनक प्रेरित ट्रांस-एपिथेलियल माइग्रेशन का आकलन करने से पहले न्यूट्रोफिल को अवरोधकों, एंटीबॉडी, या विरोधी के साथ पूर्वउपचार किया जा सकता है। एपिथेलियल कोशिकाएं संक्रमण और सूजन के दौरान संकेतों को भांपते हुए और घुलनशील मध्यस्थों के माध्यम से प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ संवादस्थापितकरके एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। सिग्नलिंग रास्ते, केमो-आकर्षित करने वालों के ध्रुवीकृत स्राव, और एपिथेलियल सतह आसंजन अणु या तो बैक्टीरिया या न्यूट्रोफिल के साथ बातचीत करते हैं जो रोगजनक प्रेरित न्यूट्रोफिल ट्रांस-एपिथेलियल माइग्रेशन को प्रभावित करते हैं, सभी इन विट्रो कॉकल्चर परख का उपयोग करके जांच की जा सकती है। इस कोकल्चर मॉडल के आवेदन से पहले से अप्राप्त लिपिड ईकोसानॉइड केमो-आकर्षित के महत्व का पता चला जिसे हेपोक्सलिन ए33,18,21के नाम से जाना जाता है। हेपोक्सिलिन ए3 विशिष्ट रोगजनकों के साथ संक्रमण के प्रत्युत्तर में फेफड़ों और आंतों की एपिथेलियल कोशिकाओं द्वारा उत्पादित होता है और यह बेसोलाटरल से संक्रमित एपिकल साइड3तक ध्रुवीकृत एपिथेलियल मोनोलेयर में न्यूट्रोफिल चलाने के लिए जिम्मेदार है। इस प्रकार इन विट्रो कोकल्चर परख महत्वपूर्ण तंत्रों की पहचान करने की क्षमता के साथ एक मजबूत अन्वेषणात्मक उपकरण के रूप में कार्य करता है जो मेजबान-रोगजनक बातचीत में मध्यस्थता करता है और सूजन को आर्केस्ट्रा करता है। इसके अलावा, इस मॉडल प्रणाली में चयनात्मक विरोधी-संक्रमित या विरोधी भड़काऊ चिकित्सीय की प्रभावशीलता का आकलन करने के लिए एक उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग दृष्टिकोण के रूप में अनुकूलित होने की क्षमता है।

संक्षेप में, हम पारगम्य ट्रांसवेल फिल्टर पर उगाए जाने वाले रोगजनक संक्रमित फेफड़ों के एपिथेलियल सेल परतों के मोनोलेयर में न्यूट्रोफिल के प्रवास की जांच के लिए एक विस्तृत कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। यहां वर्णित तकनीकों को अन्य म्यूकोसल सतहों में न्यूट्रोफिल माइग्रेशन का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है जहां न्यूट्रोफिल गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट या जेनिटोरिनरी ट्रैक्ट जैसे रोग राज्यों में घुसपैठ करते हैं। इसके अलावा, इन विट्रो कोकल्चर परख प्रणाली का उपयोग करके प्राप्त अंतर्दृष्टि विशिष्ट संक्रामक एजेंटों द्वारा संचालित भड़काऊ रोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए प्रासंगिक है। म्यूकोसल सतहों के भड़काऊ रोग जिनमें पैथोलॉजिकल डिग्री के लिए सुरक्षात्मक एपिथेलियल बैरियर को पार करने वाले न्यूट्रोफिल की सुविधा है, में सीओपीडी, एआरडीएस, अस्थमा और आईबीडी5,10-12शामिल हैं। न्यूट्रोफिल ट्रांस-एपिथेलियल माइग्रेशन को नियंत्रित करने वाले आणविक तंत्रों की गहरी समझ इन सामान्य बीमारियों से जुड़ी विनाशकारी भड़काऊ प्रक्रियाओं को समाप्त करने की दिशा में सक्षम चिकित्सीय रणनीतियों को सूचित करेगी, जो मानव स्वास्थ्य में सुधार के लिए नए रास्ते प्रदान करेगी।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

इस काम को एनआईएच (1 R01 AI095338-01A1) द्वारा आर्थिक रूप से समर्थन दिया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NCl-H292 cells ATCC CRL-1848
RPMI-1640 medium ATCC 30-2001
Pseudomonas aeruginosa PAO1 ATCC #47085
Escherichia coli MC1000 ATCC #39531
D-PBS (1x) liquid Invitrogen 14190-144 without calcium and magnesium
Heat Inactivated Fetal bovine serum Invitrogen 10082-147 10% added to culture medium
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140-122 100x: 10,000 units of penicillin and 10,000 µg of streptomycin per ml.
Trypsin-EDTA (0.05%) Invitrogen 25300-062 50 ml aliquots are stored frozen at -20 ºC.  Aliquot in use can be stored at 4 ºC short-term.  
Hank's Balanced Salt Solution - HBSS(-) Invitrogen 14175-079 Sterile, without calcium and magnesium
Trypan Blue Solution Invitrogen 15250-061. Stock = 0.4%
Collagen, Rat Tail Invitrogen A10483-01 Can also be isolated in the laboratory directly from the tails of rats using standard protocols
Citric acid Sigma-Aldrich C1909-500G Component of 1 M citrate buffer and acid citrate dextrose (ACD) solution
Sodium Citrate Sigma-Aldrich S4641-500G Component of 1 M citrate buffer
Dextrose anhydrous Sigma-Aldrich D8066-250G Component of acid citrate dextrose (ACD) solution
Ammonium Chloride Sigma-Aldrich 213330-500G Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6014-500G Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
EDTA Sigma-Aldrich ED-100G Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
HBSS(+) powder Sigma-Aldrich H1387-10L Key component of HBSS+
HEPES Sigma-Aldrich H3375-500G Component of HBSS+
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2-25ML Follow vendor instructions to coat glass pipette tips
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) Sigma-Aldrich A9941-50TAB Key component of ABTS substrate solution
30% Hydrogen Peroxide Solution Sigma-Aldrich H1009-100ML Component of ABTS substrate solution
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP or fMLF) Sigma-Aldrich F-3506 A Stock solution of 10 mM in DMSO should be prepared and aliquots stored at -20 ºC.
Gelatin Type B Fisher Scientific M-12026
Pseudomonas isolation agar  Fisher Scientific DF0927-17-1 Follow manufacturer’s instructions to make PIA plates
Ficoll-Paque PLUS  Fisher Scientific 45-001-749 Optional, can improve neutrophil purity
24-well migration plate Corning Incorporated #3524
24-well wash plate Falcon 35-1147 Can be reused if soaked in 70% ethanol and washed thoroughly prior to reuse
96-well plate Fisher Scientific #12565501
Transwell Permeable Supports  Corning Incorporated #3415 Polycarbonate; Diameter: 6.5 mm; Growth area: 0.33 cm2; Dish style: 24-well plate; Pore size: 3.0 µm
Petri dish Falcon 35-1013 Each Petri dish holds 24 inverted 0.33 cm2 Transwells.  
500 ml 0.2 μm filter / flask Fisher Scientific 09-740-25A To sterilize acid citrate dextrose (ACD) solution
5-3/4 in glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-20A Coat tips with Sigmacote prior to use
Hemostat Fisher Scientific 13-812-14 Curved, Serrated
Invertoskop Inverted Microscope Zeiss #342222
Versa-Max Microplate Reader Molecular Devices #432789

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References

  1. Burns, A. R., Smith, C. W., Walker, D. C. Unique structural features that influence neutrophil emigration into the lung. Physiol. Rev. 83, 309-336 (2003).
  2. Hurley, B. P., McCormick, B. A. Intestinal epithelial defense systems protect against bacterial threats. Curr. Gastroenterol. Rep. 6, 355-361 (2004).
  3. McCormick, B. A. Bacterial-induced hepoxilin A3 secretion as a pro-inflammatory mediator. FEBS J. 274, 3513-3518 (2007).
  4. Mumy, K. L., McCormick, B. A. The role of neutrophils in the event of intestinal inflammation. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 697-701 (2009).
  5. Chin, A. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury. Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).
  6. Segel, G. B., Halterman, M. W., Lichtman, M. A. The paradox of the neutrophil's role in tissue injury. J. Leukoc. Biol. 89, 359-372 (2011).
  7. Weiss, S. J. Tissue destruction by neutrophils. N. Engl. J. Med. 320, 365-376 (1989).
  8. Hurley, B. P., Thorpe, C. M., Acheson, D. W. Shiga toxin translocation across intestinal epithelial cells is enhanced by neutrophil transmigration. Infect. Immun. 69, 6148-6155 (2001).
  9. Kohler, H., et al. Salmonella enterica serovar Typhimurium regulates intercellular junction proteins and facilitates transepithelial neutrophil and bacterial passage. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 293, 178-187 (2007).
  10. Gane, J., Stockley, R. Mechanisms of neutrophil transmigration across the vascular endothelium in COPD. Thorax. 67, 553-561 (2012).
  11. Grommes, J., Soehnlein, O. Contribution of neutrophils to acute lung injury. Mol. Med. 17, 293-307 (2011).
  12. Nakagome, K., Matsushita, S., Nagata, M. Neutrophilic inflammation in severe asthma. Int. Arch. Allergy Immunol.. 158 Suppl 1, 96-102 (2012).
  13. Choi, E. Y., Santoso, S., Chavakis, T. Mechanisms of neutrophil transendothelial migration. Front. Biosci. 14, 1596-1605 (2009).
  14. Louis, N. A., Campbell, E., Colgan, S. P. Model systems to investigate neutrophil adhesion and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 412, 257-270 (2007).
  15. Craig, A., Mai, J., Cai, S., Jeyaseelan, S. Neutrophil recruitment to the lungs during bacterial pneumonia. Infect. Immun. 77, 568-575 (2009).
  16. Hurley, B. P., McCormick, B. A. Translating tissue culture results into animal models: the case of Salmonella typhimurium. Trends Microbiol. 11, 562-569 (2003).
  17. Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. In vitro neutrophil transepithelial migration. Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).
  18. Hurley, B. P., Siccardi, D., Mrsny, R. J., McCormick, B. A. Polymorphonuclear cell transmigration induced by Pseudomonas aeruginosa requires the eicosanoid hepoxilin A3. J. Immunol. 173, 5712-5720 (2004).
  19. McCormick, B. A., Colgan, S. P., Delp-Archer, C., Miller, S. I., Madara, J. L. Salmonella typhimurium attachment to human intestinal epithelial monolayers: transcellular signalling to subepithelial neutrophils. J. Cell Biol. 123, 895-907 (1993).
  20. McCormick, B. A., et al. Surface attachment of Salmonella typhimurium to intestinal epithelia imprints the subepithelial matrix with gradients chemotactic for neutrophils. J. Cell Biol. 131, 1599-1608 (1995).
  21. Mrsny, R. J., et al. Identification of hepoxilin A3 in inflammatory events: a required role in neutrophil migration across intestinal epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7421-7426 (2004).
  22. Tamang, D. L., et al. Hepoxilin A(3) facilitates neutrophilic breach of lipoxygenase-expressing airway epithelial barriers. J. Immunol. 189, 4960-4969 (2012).
  23. McCormick, B. A., Parkos, C. A., Colgan, S. P., Carnes, D. K., Madara, J. L. Apical secretion of a pathogen-elicited epithelial chemoattractant activity in response to surface colonization of intestinal epithelia by Salmonella typhimurium. J. Immunol. 160, 455-466 (1998).
  24. Boll, E. J., et al. Enteroaggregative Escherichia coli promotes transepithelial migration of neutrophils through a conserved 12-lipoxygenase pathway. Cell Microbiol. 14, 120-132 (2012).
  25. Hurley, B. P., et al. The two-component sensor response regulator RoxS/RoxR plays a role in Pseudomonas aeruginosa interactions with airway epithelial cells. Microbes Infect. 12, 190-198 (2010).
  26. Hurley, B. P., Williams, N. L., McCormick, B. A. Involvement of phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-mediated PMN transepithelial migration. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 290, L703-L709 (2006).
  27. McCormick, B. A., Siber, A. M., Maurelli, A. T. Requirement of the Shigella flexneri virulence plasmid in the ability to induce trafficking of neutrophils across polarized monolayers of the intestinal epithelium. Infect. Immun. 66, 4237-4243 (1998).
  28. Savkovic, S. D., Koutsouris, A., Hecht, G. Attachment of a noninvasive enteric pathogen, enteropathogenic Escherichia coli, to cultured human intestinal epithelial monolayers induces transmigration of neutrophils. Infect. Immun. 64, 4480-4487 (1996).
  29. Agbor, T. A., Demma, Z. C., Mumy, K. L., Bien, J. D., McCormick, B. A. The ERM protein, ezrin, regulates neutrophil transmigration by modulating the apical localization of MRP2 in response to the SipA effector protein during Salmonella typhimurium infection. Cell Microbiol. 13, 2007-2021 (2011).
  30. Pazos, M., et al. Multidrug resistance-associated transporter 2 regulates mucosal inflammation by facilitating the synthesis of hepoxilin A3. J. Immunol. 181, 8044-8052 (2008).
  31. Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism. Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).
  32. Bhowmick, R., et al. Systemic Disease during Streptococcus pneumoniae Acute Lung Infection Requires 12-Lipoxygenase-Dependent Inflammation. J. Immunol. , (2013).
  33. Hurley, B. P., Pirzai, W., Mumy, K. L., Gronert, K., McCormick, B. A. Selective eicosanoid-generating capacity of cytoplasmic phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-infected epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 300, 286-294 (2011).
  34. Hurley, B. P., Sin, A., McCormick, B. A. Adhesion molecules involved in hepoxilin A3-mediated neutrophil transepithelial migration. Clin. Exp. Immunol. 151, 297-305 (2008).
  35. Frank, D. W. Research Topic on Pseudomonas aeruginosa, Biology, Genetics, and Host-Pathogen Interactions. Front. Microbiol. 3, 20 (2012).
  36. Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Lung infections associated with cystic fibrosis. Clin. Microbiol. Rev. 15, 194-222 (2002).
  37. Bucior, I., Mostov, K., Engel, J. N. Pseudomonas aeruginosa-mediated damage requires distinct receptors at the apical and basolateral surfaces of the polarized epithelium. Infect. Immun. 78, 939-953 (2010).
  38. Kierbel, A., et al. Pseudomonas aeruginosa exploits a PIP3-dependent pathway to transform apical into basolateral membrane. J. Cell Biol. 177, 21-27 (2007).
  39. Lee, C. A., et al. A secreted Salmonella protein induces a proinflammatory response in epithelial cells, which promotes neutrophil migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12283-12288 (2000).
  40. Zurawski, D. V., Mumy, K. L., Faherty, C. S., McCormick, B. A., Maurelli, A. T. Shigella flexneri type III secretion system effectors OspB and OspF target the nucleus to downregulate the host inflammatory response via interactions with retinoblastoma protein. Mol. Microbiol. 71, 350-368 (2009).
  41. Brazil, J. C., et al. Neutrophil migration across intestinal epithelium: evidence for a role of CD44 in regulating detachment of migrating cells from the luminal surface. J. Immunol. 185, 7026-7036 (2010).
  42. Lawrence, D. W., et al. Antiadhesive role of apical decay-accelerating factor (CD55) in human neutrophil transmigration across mucosal epithelia. J. Exp. Med. 198, 999-1010 (2003).
  43. Hodges, K., Hecht, G. Interspecies communication in the gut, from bacterial delivery to host-cell response. J. Physiol. 590, 433-440 (2012).

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