Summary
여기에 디테일이 조직 헬기를 이용하여 하악 조각 문화 치아 세균에 방법을 우리는. 이 방법은 전통적인 배양 방법을 사용하여 사용 가능한 조작과 혈통 추적하지를위한 절호의 기회를 제공하고, 개발하는 동안 치아에 고유 한 액세스 할 수 있습니다.
Abstract
이식편의 문화는 특정 시점에서 장기를 개발하고 조작 따라서 발달 생물학을위한 중요한 방법입니다 수 있습니다. 많은 기관의 경우는 체외 배양시 모니터링 할 수 있도록 개발 조직에 접근하기가 어렵습니다. 슬라이스 문화 방법은 수 있습니다 조직에 액세스 할 수 있도록 형태 형성의 움직임이 따라 할 수있는 특정 세포 집단이 조작 또는 계보 추적 대상이 될 수있다.
본 논문에서 우리는 종의 범위에서 치아 세균의 문화에 매우 성공적이었다 슬라이스 문화의 방법을 설명합니다. 방법은 다른 턱 조직으로 둘러싸인 생체 내에서 관찰되는 것과 유사한 비율로 개발 치아 세균에 우수한 액세스를 제공한다. 이것은 치아와 주위 조직 사이의 조직 상호 작용을 모니터링 할 수있다. 이 논문은 치아 세균에 집중되지만, 동일한 프로토콜이 수의 개발을 수행하도록 적용될 수있다이러한 침샘, 메켈의 연골, 코 분비, 혀, 귀 등 다른 장기의.
Introduction
실험의 번호는 문화 조직 생체 개발을 따르도록하는 것이 중요합니다. 조직 개발 농경 개발의 정의 기간에 액세스를 제공하고, 배양 배지에 요소를 첨가하여 유전자의 조작, 또는로드 구슬 및 형질 및 일렉트로 하나의 사용에 의해 허용한다. 많은 실험을 위해 그것이 성장함 조직 형태 형성을 겪는다로서 혈통 표지화 된 세포의 운명을 따라, 예를 들어, 조직을 시각화 할 수있는 것이 중요하다. 이 배아에서 조직의 블록을 배양 할 때 분명하지 않은 깊은 배아 내 개발 조직에 특히 문제가 될 수 있습니다. 그들은 하악, 상악과 정면 코 프로세스 내에서 개발로 이빨이 좋은 예입니다. 전체 하악이 배양되면 고정 된 조직으로 구획 한 후, 치아의 표면 구조는 볼 수 있지만, 형태 변화만을 분석 할 수있다
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Protocol
1. 설정
- (미네랄 오일로 윤활 숫돌을 사용하여) 해부 도구를 선명하게 및 70 % 에탄올 스프레이 건조 가열 살균을 사용하는 기관 배양을 위해 사용하기 전에 소독. 12 V 공급 장치를 사용하여 2 M 수산화 나트륨을 사용하여 전기 분해 해부 바늘을 선명.
- 1 % 루타와 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신과 보충 고급 둘 베코의 수정 이글 중간 F12 (DMEM의 F12)으로 구성된 배아 기관의 해부와 문화에 사용되는 배지를 준비합니다.
2. 배아 해부
- 홈 오피스 또는 기타 관리위원회가 승인 한 일정 하나의 방법을 사용하여 일정 시간 성관계 임신 여성을 추려. 낮은 복부 주위의 피부를 멀리 해부 가위를 사용하여 복부를 열 컷. 낮은 중간 선에 함께 연결하는 두 개의 자궁 뿔을 찾습니다.
- 얼음 매체로 채워진 튜브에 자궁과 장소를 해부하다. 갔지N 얼음에, 조직은 몇 시간 동안 남아있을 수 있습니다.
- 현미경으로 중간에있는 페트리 접시에있는 자궁과 장소를 제거합니다. 가능한 배아 해부 오염을 최소화하기 위해 층류 흐름 후드에서 수행되어야하는 위치.
- 자궁에서 배아를 해부하고 자신의 배외 (extraembryonic) 조직에서 그들을 해방.
- 텅스텐 바늘을 사용하여 배아를 참살하고 매체의 신선한 접시에 머리를 전송합니다.
- 구강에 바늘을 배치하여 헤드의 턱을 분리하고 머리 뒤쪽 (그림 1A와 1B)으로 극복. 초핑 기다리는 동안 격리 하악골 일시적 얼음 매체에 저장 될 수있다.
- 전체 하악 슬라이스 E11.5-E15.5 치아 세균 배양에 적합하다 스테이지. E15.5 후 하악의 개발 뼈 자르고 너무 어렵다. 치아 조각은 여전히 할 수 있지만 뼈 (치골과 형성 치조골) 먼저 제거해야합니다9 자르고 전에 해부. 텅스텐 바늘과 집게를 사용하여 조심스럽게 뼈를 제거합니다.
3. 배아 슬라이스
- 표준 테이블 조직 헬기 (그림 1C)를 사용하여 하악 조직 조각을 준비합니다. 약 200 턱 후 신선한 잎을 사용하고 떨어질 때 설치 디스크와 같은 높이가 놓여 있는지 확인하십시오.
- 설치 디스크를 청소하고 사용하기 전에 70 %의 에탄올로 블레이드. 컴퓨터를 사용할 때 칼날이 매우 날카로운 있으므로주의는주의해야합니다.
- 표본의 연령에 따라 200 ~ 400 μm의 사이의 절단 거리에 헬기를 설정하고 전체 치아 세균이 필요한지 여부에 따라 달라집니다. 최대의 블레이드의 힘을 설정합니다.
- 피펫이나 집게를 사용하여 플라스틱 설치 디스크에 하악을 전송합니다. 방향이 아직 확실 있는지 디스크 만들기에 하악을 정렬합니다. 현상 혀 방향을 결정하기위한 유용한 마크로서 사용할 수있다. 어금니 사용 AF에 대한앞니에 그들은 (그림 2A에 자르고면 참조) 성장이 치아의 서로 다른 방향을 반영하기 위해 하악을 통해 시상 슬라이스를 사용하는 동안 rontal / 가로 방향 (그림 1B에서 자르고면 참조).
- 약간 설치 디스크의 하악골을 건조하기 위해 필터 종이를 사용하여 조직의 주위에서 초과 매체를 제거합니다.
- 즉시 건조 후, 헬기의 원형 스테인리스 테이블에 디스크를 놓습니다. 에 컴퓨터를 켜고 키를 눌러 시작. 표 동시에 블레이드를 운반 초핑 아암가 발생 / 분까지 200 스트로크 삭제하면서 왼쪽에서 오른쪽으로 자동 이송.
- 조직이 완전히 분리 한 후 컴퓨터의 전원을 끄십시오. 블레이드 암이 발생한 위치에 있는지 확인하고 디스크를 제거합니다. 블레이드 팔에서 손가락을하거나 자르고 때 무인 기계를 방치하지 마십시오.
- 설치 디스크를 가지고 즉시 매체 t을 추가O 순서의 디스크 조각은 과도한 건조를 방지한다. 정중 매체의 소규모 배양 접시 (도 2A)에 텅스텐 바늘 후 피펫을 이용하여 디스크의 바닥으로부터 분리 된 조직을 제거.
- 바늘을 사용하여 조각을 분리하고 입체 (그림 1D, 1E, 및 2B)에서 관심의 조직을 포함하는 조직 조각을 선택합니다. 매체 신선한 배양 접시에서 선택한 슬라이스를 놓습니다.
4. 슬라이스 문화
- 탈수를 방지하기 위해 외부 웰에 멸균 물을 약 2 ㎖를 추가하고 요리의 중심에 걸쳐 금속 격자를 배치하여 문화에 대한 준비가 중앙 아니라 장기 배양 접시를 준비합니다 (그림 3a 및 3b).
- 약 4cm 스테인레스 스틸 메쉬 시트에서 1.5 센티미터 x 다음 스트립을 절단하여 금속 그리드를 준비합니다. 중앙에 구멍을 뚫어 구부려 구멍 펀치를 사용하여엇갈린 말을 만들 수있는면. 그리드는 접시 (그림 3a 및 3b)의 바닥에 평행하게 누워, 중앙도에 걸쳐 평면 적합해야한다. 사용하기 전에 소독 그리드를 압력솥.
- 투명 폴리에틸렌 테레 프탈레이트의 조각 그리드에 구멍을 커버하기에 충분한 크기 (PET) 막 (기공 크기 0.4 μm의) 절단. 선택한 슬라이스를 접시에 잘라 막 놓습니다.
- 막 위에 슬라이스를 놓고 조심스럽게 중앙에 평평하게 슬라이스, 매체 밖으로 막을 올립니다.
- 중앙에 원형 구멍을 통해 그리드에 필터를 배치하고, 멤브레인의 수준까지, 웰에 배지의 약 1 ㎖를 추가합니다.
- 조작 (예 8) 매체에 단백질 또는 작은 분자 억제제를 추가하십시오.
- 문화의 날 0시 형태의 레코드의 조각을 촬영하고 있습니다.
- 5 % CO의 가습 분위기에서 요리를 배치
- 평균을 7 일 동안 정기적으로 문화를 사진. 문화 매체마다 48 ~ 72 시간을 변경합니다. 촬영을 위해 아래 (그림 2C-E)에서 광원으로 조각을 볼 수 있습니다.
5. 리니지 추적
계보 추적이 요구되는 경우에, 그러한 DII 또는 DIO 같은 친 유성 염료는 단계 4, 슬라이스 배양 전에 치아 세균에 주입 될 수있다.
- 바늘 풀러를 사용하여 유리 모세관 바늘을 빼냅니다.
- 집게를 사용하여 바늘의 끝을 중단하고 아래로 염료 용액에 팁을 배치합니다. 염료는 모세관 작용에 의해 팁을 채우는 동안 몇 분 동안 둡니다.
- 홀더에 가득 바늘을 놓고 인젝터 입 흡입기에 튜브를 통해 연결합니다.
- 표시 될 예정 조각의 영역을 감동 배지에서 바늘의 끝을 배치합니다. 니들 중 염료의 소량 변위 공기압 적용조직에 거라고.
- 바늘을 제거하고 형광에 따라 라벨을 확인합니다.
- 성공적 표지 슬라이스 필터에 전송하고, 단계 4에 설명 된대로 배양 될 수있다.
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Representative Results
제 어금니 치과 여포의 움직임에 추종하기 위하여, 250 μM 정면 슬라이스는 상기 한 방법을 사용하여 하악 통해 촬영했다. 치아 뿌리는 개발 치아의 바깥 쪽 에나멜 상피 (OEE)을 둘러싸는 중간 엽의 층이며, 이전에 치주 6의 조직의 형성에 참여하는 것으로 나타났다. 턱은 E14.5, 치아 개발의 캡 단계에서 해부했다. 슬라이스 내의 치과 상피의 윤곽이 맑아 응축 치과 간엽은 치아 상피 세포 (도 4a)의 주위에 어두운 링으로서 식별 될 수있다. DII는 설측 (그림 4A)에 치아 조각의 외부 에나멜 상피 옆에있는 중간 엽에 주입 하였다. 라벨 후 조각은 4 일 동안 배양 및 간격 (그림 4B 및 4C)에서 촬영. 생체 치아 세균에 도달 할 것E18.5 바이 벨 스테이지와 별개 종 단 형상은이 기간 동안 유사한 진행을 나타내는 슬라이스에서 관찰되었다. DII의 자리는 치아가 (그림 4B 및 4C) 증가로 외부 치아 상피 세포의 확장 주변 세포의 대역으로 확장 보였다.
그림 1. 살아있는 조각의 형성. (A) E14.5 배아. 점선은 참형에 대한 낮은 컷을 시작으로 해부 바늘로 잘라면을 나타냅니다. (B) 아래 턱뼈를 해부. 혀 아래에 직면하고있다. 조직 헬기 섹션의 평면은 점선을 사용하여 표시됩니다. (C) 준비된 시편 (화살표)와 블레이드 팔 (BA)과 흰색 설치 디스크 (MD)를 표시하는 조직 헬기. 몰을 통해 (D) 대표 조각지역. 화살표는 어금니 세균을 가리 킵니다. 몰 슬라이스 (E) 고성능보기. 치아 배아 상피 검은 반점이 설명되어 있습니다. 이미지는 포토샵을 사용하여 날카롭게. T = 혀, DB = 치골 뼈, MC = 메켈의 연골. A = 3mm의 스케일 바. B & D = 1mm의 스케일 바. E = 500 μm의에서 스케일 바. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 앞니와 선 문화. (A) sagittally 다진 된 E12.5 하악골. 개발 앞니 (별표와 흰색 테두리의 반점)과 턱밑 샘 (검은 반점과 함께 설명하고 화살표로 나타낸)는 그냥 할 수있다. (B) 중앙 4 조각을 보여주는 동일 하악 밖으로 분리. 개발 악하선의 C이 두 개 더 측면부 (이미지 위에)에 응축 된 중간 엽 (화살촉)로 둘러싸인 꽃 봉오리로 볼 수. 글 랜드 주변의 응축 중간 엽은 빨간색으로 설명되어 있습니다. 앞니 두 중앙 조각 (이미지 아래)의 상피 두껍게 단계 (별표)에 있습니다. (C) 일 0시 E14.0에서 앞니를 통해 시상 조각. 일일 이상 (D) 같은 조각. 문화 후에 3 일 (E) 같은 조각. (CE) 화살표가 앞니와 입술 자궁 루프를 형성합니다. 화살촉 악하선 개발 가리 킵니다. 자궁 루프가 성장 침샘이 형태 형성 및 루멘 형성 분기 받아야 계속하는 동안 문화 치아 세균, 뒤로 확장합니다. 이미지는 포토샵을 사용하여 날카롭게. T = 혀, MC = 메켈의 연골. A & B = 1 mm 단위 스케일 바. C, D, E = 500 μm의에서 스케일 바. 여기를 클릭하십시오더 큰 그림을 볼 수 있습니다.
그림 3. 배양 방법. (A) 교양 조각. 문화는 금속 격자를 통해 매체를 통해 일시 중단 된 투명 필터에 앉아있다. 그리드에 구멍이 슬라이스가 아래에서 빛으로 시각화 할 수 있습니다. 배양 방법의 (B) 도식.
그림 4. 치아 뿌리의 DII 표시. (AC)는 어금니 세균 및 DII 계보 라벨의 위치를 개발 보여주는 빛과 어둠 필드 이미지를 병합. (A) 일 0. 치아 세균 (화살촉) 캡 단계에있다. DII는 치아의 설측에 치과 난포 세포를 라벨. (B (C) 4 일. 치아의 세균 종의 단계에 도달하고 DII 표시된 셀은 개발 외부 에나멜 상피 세포 주위에 호에서 확산 볼 수 있습니다. 이미지가 화면 모드를 사용하여 레이어를 병합 한 후 포토샵에서 날카롭게했다. 치아의 상피 세포는 검은 반점으로 설명했다. 내부 에나멜 상피 세포 내에서 거짓말 DP는 = 치과 유두. 외부 에나멜 상피 세포 주위에 실행 DF는 = 치아 뿌리. MC는 메켈의 연골을 =. 의 스케일 바, B, C = 500 μm의. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
치아 배양이 방법은 치아의 세균에 대한 액세스 장점은 정확한 계보가 상피 세포 또는 중간 엽에서 추적 및 구슬의 배치를 허용, 우수한 있습니다. 개발 치아 세균의 정의 영역은 따라서 구체적으로 타겟팅 할 수 있습니다. 배양 중에 치아 세균의 변화 형태는 다음 될 수 있고, 조작의 효과는 빠르게 평가.
이 정확하게 다진 할 수있는 방법은, 그러나, 이러한 덴틴과 에나멜과 같은 단단한 조직의 실질적인 형성하기 전에 젊은 치아 세균에만 적합합니다. 턱의 경우 후 E15.5는 마 전에 뼈를 제거 할 필요가있다. 이것은 잠재적 밀접 E16.5에서 뼈와 관련된 치아 세균, 손상의 단점이있다. 우리는 성공적으로 치아로 인해 에나멜의 증착에 잘라 헬기 너무 어렵게되어 그 후, 생후 4 해부 치아의 세균을 분리했다. 슬라이스 Method는 꽃 봉오리 단계 1,6 즉, E13.5에서 치아 세균에 잘 작동합니다. 치아 상피 두껍게 단계에있을 때이 시간 지점 전에, 치아의 세균을 개발해야하지만 성공률은 감소되고 형태가 장기적으로 영향을받을 수 있습니다.
방법에 하나의 주요 단점은 마 치아를 통해 무작위로 발생하는 것입니다. 다른 사람에 헬기가 중간을 통해 치아의 세균을 잘라 수 있지만 일부 조각에서 전체 치아 세균, 조각에서 찾을 수 있습니다. 이것은 동일한 슬라이스 다수 구하는 것이 어려울 수 있다는 것을 의미한다. 이 문제에 대처하기 위해, 미들 슬라이스 나누어 실험 및 대조군으로 좌우 양측을 사용하는 것이 가능하다. 이를 위해, 그러나, 하악은 신중하게 슬라이스 대칭 절단하기 위해 마 디스크에 배치해야합니다. 일부 실험은 치아를 해부 조각을 가지고 활용 될 수 있도록 같은 에나멜과 같은 내부 구조,매듭은, 혈통 라벨 4에 액세스 할 수 있습니다. 치아 세균은 매우 강력한 나타나고 이전에 절반 가까이 떨어졌다 어금니 세균 (12, 13)에 나타낸 바와 같은 절반이 세균은 문화에서 잘 개발할 수 있습니다.
문화 슬라이스에 대한 대안으로, 치아 세균은 하악과 고립 14에서 배양 밖으로 해부 할 수 있습니다. 이 조직의 큰 블록을 배양과 관련된 영양 부족과 산소의 문제를 제거하고 좋은 치아 개발로 연결하지만, 결과적으로 치아 주위 조직과의 상호 작용없이 개발하고 있습니다. 주변 간엽 다량이 제거 될 때 형성 치아 세균의 수는 통상 치아 개발 15 주변 간엽의 중요성을 강조하는, 변경 될 수있다. 슬라이스 문화 따라서 뼈와 치아가 치조골의 형성에 상호 작용하는 방법을 예를 들어, 조직의 상호 작용을 연구, 또는 어떻게 SalI을위한 좋은 방법입니다샘은 혀와 구강 상피 세포, 이러한 조직이 분리에서 배양 할 때 손실되는 것을 상호 작용에 따라 다릅니다.
이 논문은 치아의 세균을 배양하기위한이 방법의 사용을 강조하지만, 같은 방법도 개발 턱밑과 혀 밑 동맥을 배양하고 메켈의 연골 (그림 2)와 같은 구조의 개발을 다음 우수합니다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
사라 A. Alfaqeeh은 치과, 전문대, 교육부, 사우디 아라비아 왕국의 종류 사우드 대학 재정 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR | 101077Y | 100% ethanol was diluted in distilled H2O to 70%. |
| DMEM F12 | Gibco | 12634-010 | Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P0781 | |
| DiI (Molecular probes) | Vybrant | V-22885 | Cell-labeling solution |
| Invitrogen | Cell tracker CM-DiI, C-7000 | ||
| DiO (Molecular probes) | Vybrant | V22886 | |
| Geminator 500 | Thomas | Thomas No. 3885A20 | Dry-heat sterilization |
| McIlwain tissue chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | Standard table |
| Organ culture dish (Center-Well Organ Culture Dish) | Falcon | 353037 | |
| Membranes (Cell Culture Inserts, 0.4 μm pore size) | BD Falcon | 353090 | PET track-etched membrane, 6-well format |
| Metal grids (Stainless Steel - AISI 304 - Mesh) | Goodfellow | FE228710 | (Fe/Cr18/Ni10) |
| AutoFlow Direct Heat CO2 Incubator | Nuaire | NU-5500 | |
| Picospritzer III | Intracel Ltd | 051-0500-900 0-100 psi | Single channel picospritzer III |
| Glass capillary with filament 1 mm | WPI | TW100F-4 | |
| Tungsten wire 0.1 mm | Goodfellow | W005138 | |
| Tungsten wire 0.38 mm | Goodfellow | W005155 | |
| Aspirator tubes | Sigma | A5177 | Used for mouth aspiration lineage tracers |
References
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